王 鑫， 劉賀榮， 陳曉珍， 楊 怡， 雷瑞琛， 朱 粵， 李麗萍

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，銀川 750004）

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］是一類典型的鄰苯二甲酸酯類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，作為增塑劑廣泛應(yīng)用于個(gè)人洗護(hù)用品、家居裝飾、食品包裝袋、兒童玩具中[1]，因其以非共價(jià)鍵的形式與物品結(jié)合，所以很容易游離至物品表面，并進(jìn)入到環(huán)境中[2]，可通過消化道、呼吸道、皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體，危害人類健康[3]。流行病學(xué)研究[4-5]表明，暴露DEHP 與注意缺陷多動(dòng)障礙患病率之間存在明顯相關(guān)性；動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，暴露于750 mg·kg-1DEHP 的鵪鶉頭部出現(xiàn)攣縮、站立不穩(wěn)、眼球震顫、吞咽困難、羽毛生長不足、意識(shí)躁狂和反射亢進(jìn)等異常改變[6]，然而關(guān)于DEHP 的神經(jīng)毒性作用機(jī)制尚不清楚。海馬組織在記憶的形成、導(dǎo)航和認(rèn)知方面起著極其重要的作用，能夠?qū)箲]和認(rèn)知等行為產(chǎn)生調(diào)控能力[7]。CA1、CA2 與CA3 這3 個(gè)部分構(gòu)成了海馬組織，CA2 區(qū)與CA1 區(qū)側(cè)錐體神經(jīng)元能夠敏銳感知氧化應(yīng)激，產(chǎn)生改變，特別是CA1 區(qū)海馬神經(jīng)元，對(duì)外界環(huán)境的損傷抵御能力最弱[8]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，0.1 mol·L-1和0.3 mol·L-1的DEHP 暴露能夠抑制神經(jīng)元的興奮性和突觸可塑性的關(guān)鍵原因是阻礙CA1 錐體細(xì)胞的鉀通道，最終對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶力產(chǎn)生危害。氧化應(yīng)激可能會(huì)加速神經(jīng)元的衰老，并引發(fā)多種神經(jīng)性疾病中的細(xì)胞凋亡[10]。DEHP 能夠使過氧化物酶體內(nèi)的各種基因進(jìn)行編碼，使其基因進(jìn)行選擇性轉(zhuǎn)錄，從而進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)[11]。有研究[12]表明，氧化應(yīng)激可影響磷脂酰肌醇－3-激酶/蛋白激酶B（phosphati dylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路，通過降低PI3K 磷酸化水平進(jìn)而抑制其下游蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）磷酸化。PI3K/Akt 信號(hào)通路存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，它們受細(xì)胞外界信號(hào)的控制，對(duì)保護(hù)細(xì)胞的生命活動(dòng)起著舉足輕重的作用。Bcl-2作為PI3K/Akt 信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子，當(dāng)PI3K/Akt 通路被激活后，細(xì)胞開始發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為Bcl-2 生成量增加，Bax 表達(dá)被抑制[13]。Caspase-3 是凋亡發(fā)生的主要執(zhí)行者，Cleaved Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立亞慢性動(dòng)物模型，探討DEHP 染毒對(duì)雄性大鼠神經(jīng)行為的影響及DEHP 對(duì)神經(jīng)毒性的可能機(jī)制，為進(jìn)一步探索暴露DEHP 后神經(jīng)毒性的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DEHP（中國國藥集團(tuán)有限公司）；GAPDH 抗體、AKT Rabbit Polyclonal Antibady（Proteintech公司，美國）；p-Akt、PI3K、Phospho-PI3 Kinase p85（CST 公司，美國）；山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物科技有限公司）；聚偏氟乙烯膜（0.22 μm，PVDF 膜）（Millipore，美國）；Amersham Hybond P0.45 PVDF blotting membrane（Cytiva，美國）；烏拉坦（北京百靈威科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；玉米油（山東三星科技有限公司）；DEHP（中國國藥集團(tuán)有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 有限公司）；曠場設(shè)備及數(shù)據(jù)采集裝置（上海欣軟信息科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF 級(jí)SD 雄性大鼠40 只，3 周齡，體質(zhì)量50～70 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（寧）2020-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查編號(hào)：IACUC-NYLAC-2021-165。大鼠于室溫22～25 ℃，濕度50%～70%，12 h 光照/12 h 黑夜條件下飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)劃分為4 組，即溶劑對(duì)照組（玉米油）、187 mg·kg-1DEHP 組（1/160 LD50）、375 mg·kg-1DEHP 組（1/80 LD50）、750 mg·kg-1DEHP 組（1/40 LD50），每組10 只，經(jīng)口灌胃染毒，每周染毒6 d，休息1 d，染毒8 周。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，20%烏拉坦麻醉，心尖取血處死大鼠，采集生物標(biāo)本待測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般狀況、體質(zhì)量變化 染毒期間觀察大鼠一般毒性作用表現(xiàn)，每周稱量各組大鼠體質(zhì)量。

1.3.2 臟器系數(shù)的測定 心尖取血處死大鼠后，迅速采集大鼠腦組織稱重，并計(jì)算腦臟器系數(shù)。臟器系數(shù)（%）=臟器濕重（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.3.3 Morris 水迷宮（morris water maze，MWM）定位巡航實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物預(yù)先訓(xùn)練后開始正式實(shí)驗(yàn)，將小鼠面向池壁分別從4 個(gè)入水點(diǎn)放入水中，使用自動(dòng)錄像系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期，若60 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，將大鼠引向平臺(tái)，記錄其潛伏期為60 s，連續(xù)測試5 d?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：定位航行結(jié)束次日撤除平臺(tái)，在原平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)象限記錄大鼠入水6 s 的游泳軌跡，并記錄60 s 內(nèi)小鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)。

1.3.4 曠場實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT） 將曠場劃分為中心區(qū)域與外周區(qū)域。使用成像系統(tǒng)記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡及運(yùn)動(dòng)時(shí)各區(qū)域的停留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員用手握住鼠尾2/3 處，將大鼠朝向固定的方向，動(dòng)作輕柔地放在中心點(diǎn)，大鼠自由探索5 min，期間記錄大鼠總的運(yùn)動(dòng)路程、跨格子數(shù)、在中心區(qū)域的運(yùn)動(dòng)路程等。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，使用75%的乙醇清理曠場。

1.3.5 氧化應(yīng)激水平測定 將大鼠腦組織開顱后，取完整腦組織，沿矢狀面一分為二，在一側(cè)腦組織中取海馬組織，使用網(wǎng)搓法，邊搓邊用PBS沖洗，收集細(xì)胞懸液，1 500 r·min-1離心10 min，去上清，加入熒光探針DCFH-DA（1∶1 000），檢測海馬組織懸液中的ROS 水平。采用專用試劑盒測定血清中SOD、GSH-Px 和MDA 的含量，嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說明書步驟進(jìn)行操作并完成結(jié)果計(jì)算。

1.3.6 腦組織蘇木精-伊紅染色（HE）病理形態(tài)觀察 取部分腦組織，用體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛對(duì)其進(jìn)行固定，隨后使用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行脫水，用二甲苯進(jìn)行透明，依次進(jìn)行浸蠟、包埋和切片（腦切片4 μm），蘇木素染色，使用光鏡觀察海馬組織病理形態(tài)的改變。

1.3.7 腦組織海馬透射電鏡超微病理形態(tài)觀察 海馬固定后，梯度乙醇脫水，丙酮置換，浸透包埋、切片，最后染色與拍照。

1.3.8 RT-qPCR 法測定大鼠海馬組織PI3K、Akt mRNA 水平 采用RT-qPCR 測定大鼠海馬組織中PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase－3 mRNA 水平。具體方法按照試劑盒說明進(jìn)行。首先提取大鼠海馬組織中總RNA，并將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其次使用RT-qPCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)，利用2-ΔΔCt法計(jì)算各組基因mRNA 水平。計(jì)算公式為：mRNA 水平=2-ΔΔCt×100%，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）-對(duì)照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）提供的PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 引物序列，引物設(shè)計(jì)、合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.9 Western blot 測定大鼠海馬組織PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase－3 蛋白表達(dá) 使用磷酸化蛋白提取試劑盒裂解海馬組織，用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，按比例加入5×loading buffer，上樣體積15 μL/孔，蛋白上樣量為60 μg/孔。電泳條件：濃縮膠80 V、20 min，分離膠120 V、60 min。轉(zhuǎn)膜采用0.22 μm PVDF 膜濕轉(zhuǎn)。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，封閉完TBST 洗膜3 次，每次10 min，4 ℃孵育一抗過夜，孵育完TBST 洗膜3 次，每次5 min，室溫孵育二抗（1∶5 000）1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min。ECL 化學(xué)發(fā)光液曝光拍照，利用Image J 軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，用SPSS 28.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 8 軟件繪制柱狀圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DEHP 染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

各組大鼠染毒期間未見明顯毒性作用表現(xiàn)。與對(duì)照組比較，各DEHP 染毒組大鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），見圖1。

圖1 DEHP 染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=10）

2.2 DEHP 染毒對(duì)大鼠腦組織臟器系數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，各DEHP 染毒組大鼠腦組織臟器系數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均>0.05），見圖2。

2.3 DEHP 染毒對(duì)大鼠神經(jīng)行為的影響

2.3.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 在定位巡航實(shí)驗(yàn)中，大鼠巡航距離和首次穿越平臺(tái)時(shí)間隨訓(xùn)練時(shí)間增加而減少；同一時(shí)間點(diǎn)巡航距離與對(duì)照組比較，各DEHP 染毒組大鼠差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，750 mg·kg-1DEHP 組大鼠在60 s 內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)減少（P<0.05），見圖3。

2.3.2 曠場實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組相比，總路程各DEHP染毒組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，375 mg·kg-1DEHP組、750 mg·kg-1DEHP 組中心路程和跨格子數(shù)均減少（P 均<0.05），見圖4。

圖4 DEHP 染毒對(duì)大鼠曠場試驗(yàn)的影響（±s，n=5）

2.4 DEHP 染毒對(duì)大鼠氧化應(yīng)激的影響

2.4.1 DEHP 染毒對(duì)大鼠海馬組織ROS 水平的影響 與對(duì)照組相比，750 mg·kg-1DEHP 組活ROS 相對(duì)含量升高（P<0.05），見圖5。

圖5 DEHP 染毒對(duì)大鼠ROS 表達(dá)相對(duì)含量的影響（±s，n=3）

2.4.2 DEHP 染毒對(duì)大鼠血清MDA、SOD、GSHPx 水平的影響 與對(duì)照組相比，750 mg·kg-1DEHP組中SOD 與GSH-Px 水平降低，MDA 水平升高（P 均<0.05），187 mg·kg-1DEHP 組與375 mg·kg-1DEHP 組SOD 水平降低（P 均<0.05），見圖6。

圖6 DEHP 染毒對(duì)大鼠SOD、MDA、GSH-Px 的影響（±s，n=6）

2.5 DEHP 染毒對(duì)大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組海馬CA1 區(qū)細(xì)胞排列有序，細(xì)胞核大而圓，清晰可見。DEHP 染毒組海馬CA1 區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的核固縮現(xiàn)象，見圖7。

圖7 DEHP 對(duì)大鼠腦海馬組織病理形態(tài)的影響

2.6 DEHP 染毒對(duì)大鼠海馬組織超微病理形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

通過透射電鏡可以觀察到，對(duì)照組海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核大且飽滿，核仁清晰，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能清晰觀察到；187 mg·kg-1DEHP 組核膜皺縮，染色質(zhì)沉積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張，線粒體嵴局部輕微溶解、消失形成空泡，高爾基體腫脹。375 mg·kg-1DEHP 組核膜模糊不清，線粒體數(shù)目增多，雙層膜結(jié)構(gòu)模糊不清，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張伴核糖體脫落，出現(xiàn)“脫顆?！爆F(xiàn)象。750 mg·kg-1DEHP 組出現(xiàn)部分染色質(zhì)凝集，核膜部分溶解，核仁不清，線粒體畸形，部分線粒體溶解透明成為空泡，見圖8。

圖8 DEHP 對(duì)大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)的影響（×10 000）

2.7 DEHP 染毒對(duì)大鼠海馬組織中PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響

2.7.1 DEHP 染毒對(duì)大鼠海馬PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，375 mg·kg-1DEHP 組、750 mg·kg-1DEHP 組PI3K、Akt 與Bcl-2 mRNA 水平降低（P 均<0.05）；375 mg·kg-1DEHP 組、750 mg·kg-1DEHP 組Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA 水平升高（P 均<0.05），187 mg·kg-1DEHP 組Bax mRNA 水平升高（P<0.05）；各DEHP 染毒組Bcl-2/Bax mRNA 水平均降低（P 均<0.05），見圖9。

圖9 DEHP 染毒對(duì)PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA 水平的影響（±s，n=3）

2.7.2 DEHP 染毒對(duì)大鼠海馬PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響與對(duì)照組相比，各DEHP 染毒組PI3K、p-PI3K、Bcl-2 蛋白及Bcl-2/Bax 比值均降低（P 均<0.05），375 mg·kg-1DEHP 組與750 mg·kg-1DEHP 組Akt 與p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)水平、p-PI3K/PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P 均<0.05）；750 mg·kg-1DEHP 組p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.05）；各DEHP 染毒組Cleaved Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高（P 均<0.05），750 mg·kg-1DEHP組Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P<0.05），見圖10。

圖10 Western blot 檢測DEHP 染毒對(duì)PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

3 討論

近年來，DEHP 的神經(jīng)毒性作用日益受到眾多學(xué)者的關(guān)注，但DEHP 暴露對(duì)神經(jīng)毒性作用的具體機(jī)制尚不明確。本研究通過構(gòu)建亞慢性動(dòng)物模型，以雄性大鼠為研究對(duì)象，探討DEHP 暴露對(duì)大鼠神經(jīng)行為的影響及潛在機(jī)制，為DEHP 的神經(jīng)毒性作用研究提供基礎(chǔ)。

體質(zhì)量作為一項(xiàng)綜合指標(biāo)能夠衡量動(dòng)物的健康和生長狀況，在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般毒性作用可以用體質(zhì)量的變化來評(píng)價(jià)[15]。本研究中，未觀察到DEHP 染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量產(chǎn)生影響。臟器系數(shù)可反映外源化學(xué)物毒性的綜合情況，若器官發(fā)生水腫、充血等變化，則該比值可能會(huì)增高[16]。本次研究各DEHP 染毒組大鼠腦組織的臟器系數(shù)與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力，主要參數(shù)為穿越平臺(tái)次數(shù)、定位航行潛伏期和目標(biāo)象限探索時(shí)間[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，大鼠巡航距離、首次穿越平臺(tái)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空間探索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，各DEHP 染毒雄性大鼠60 s 內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)減少，375 mg·kg-1DEHP 組與750 mg·kg-1DEHP 組中大鼠水中運(yùn)動(dòng)路徑不規(guī)則，缺乏目的性，表明DEHP 染毒后大鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶功能可能受損，而DEHP 對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響可能與染毒劑量有關(guān)，這與其他研究者關(guān)于DEHP喂養(yǎng)大鼠致大鼠空間學(xué)習(xí)受損的結(jié)論一致[17]。曠場實(shí)驗(yàn)可以反映大鼠的探索行為，中間區(qū)域停留的時(shí)間與進(jìn)入中間區(qū)域的次數(shù)是曠場實(shí)驗(yàn)的主要參數(shù)[18]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，375 mg·kg-1DEHP 組與750 mg·kg-1DEHP 組中心路程和跨格子數(shù)減少，表明DEHP 染毒對(duì)大鼠探索行為產(chǎn)生了影響。氧化應(yīng)激表明機(jī)體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡[10]。機(jī)體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)無法維持平衡時(shí)，機(jī)體累積的ROS 引起脂質(zhì)過氧化，若在腦組織中發(fā)生氧化應(yīng)激可能會(huì)對(duì)學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生損傷[12]。SOD 和GSH-Px 是體內(nèi)的主要抗氧化酶，它們可以通過清除ROS 來保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的傷害[16]。機(jī)體中多不飽和脂肪酸過氧化的最終產(chǎn)物MDA，其過量產(chǎn)生與ROS 的增加有關(guān)，該指標(biāo)可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[19]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，750 mg·kg-1DEHP 組活性氧相對(duì)含量升高，750 mg·kg-1DEHP組中SOD 與GSH-Px 水平降低，MDA 水平升高，187 mg·kg-1DEHP 組與375 mg·kg-1DEHP 組SOD 水平降低，表明DEHP 暴露可引起機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，并且隨著DEHP 染毒劑量的升高，氧化應(yīng)激水平上升，氧化產(chǎn)物超過了機(jī)體的清除能力，進(jìn)而產(chǎn)生氧化損傷。有研究[20]表明，小鼠暴露于DEHP 3 周后，小鼠體內(nèi)中的ROS 水平和MDA含量會(huì)逐漸上升，SOD 活性會(huì)下降。

海馬組織位于大腦皮質(zhì)，作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是機(jī)體學(xué)習(xí)和記憶儲(chǔ)存的部位之一，在記憶的形成、導(dǎo)航和認(rèn)知方面起著極其重要的作用[7]。本研究結(jié)果顯示，DEHP 染毒組海馬CA1 區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的核固縮現(xiàn)象。進(jìn)一步通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，DEHP 組可不同程度地引起大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞核膜皺縮，染色質(zhì)沉積，線粒體嵴局部輕微溶解、消失形成空曠，高爾基體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張伴核糖體脫落，出現(xiàn)“脫顆?！爆F(xiàn)象，部分線粒體溶解透明成為空泡，表明DEHP 暴露可引起成年雄鼠海馬神經(jīng)元的損傷，這與任文強(qiáng)[21]的研究結(jié)論一致。

PI3K/Akt 信號(hào)通路可縮短神經(jīng)前體細(xì)胞的細(xì)胞間期，使該細(xì)胞迅速進(jìn)入細(xì)胞分裂期，因而可使神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)程加快，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化，對(duì)神經(jīng)的再生修復(fù)有著極大的促進(jìn)作用[22]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的分子通過阻斷PI3K/Akt 介導(dǎo)的修復(fù)能力作用于PI3K/Akt 信號(hào)通路。Bcl-2/Bax/Caspase-3 是參與細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Bcl-2 表達(dá)下降，Bax 表達(dá)增加，而最終能否進(jìn)入凋亡要計(jì)算Bcl-2/Bax 比值。Bax 游離到線粒體外膜，促使細(xì)胞色素C 等移動(dòng)到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C 激活下游分子Caspase-3 使DNA 修復(fù)酶發(fā)生斷裂，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。

本次研究進(jìn)一步檢測PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3 相關(guān)基因和蛋白水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，375 mg·kg-1DEHP 組與750 mg·kg-1DEHP 組PI3K、Akt 與Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平降低；375 mg·kg-1DEHP 組與750 mg·kg-1DEHP 組Bax 與Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平升高，187 mg·kg-1DEHP 組Bax mRNA 表達(dá)水平升高，各DEHP 染毒組Bcl-2/Bax 比值降低。蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各DEHP 染毒組PI3K 與p-PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，Bcl-2 相對(duì)蛋白表達(dá)水平與Bcl-2/Bax 比值降低，375 mg·kg-1DEHP 組與750 mg·kg-1DEHP 組Akt 與p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，各DEHP 染毒組Cleaved Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，750 mg·kg-1DEHP 組Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，表明DEHP 暴露可抑制PI3K/Akt 磷酸化水平，進(jìn)而作用于下游Bcl-2、Bax 與Caspase-3 蛋白，促進(jìn)海馬細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Wu 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，DEHP 處理NE-4C 細(xì)胞后Cleaved Caspase-3 和Bax 蛋白水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低。

綜上所述，暴露DEHP 后大鼠的空間記憶能力受損，其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，抑制了PI3K/Akt 磷酸化水平，上調(diào)了Bax與Cleaved Caspase-3 表達(dá)水平，進(jìn)而抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致海馬組織內(nèi)細(xì)胞的凋亡。