張旼旼，黃新宇，戴慧

丹參多酚酸鹽抑制氧化應(yīng)激減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性研究

張旼旼1，黃新宇2，戴慧1

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市腫瘤醫(yī)院放療科，浙江杭州 310002；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州 310002

探究丹參多酚酸鹽（salvianolate，SAL）對(duì)阿霉素（adriamycin，ADM）誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)作用及調(diào)控機(jī)制。采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠分為對(duì)照組、ADM組、等效劑量丹參多酚酸鹽（equivalent dose of salvianolate，ESAL）組和高劑量丹參多酚酸鹽（high-dose salvianolate，HSAL）組，每組10只，超聲檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)和功能，測(cè)量小鼠體質(zhì)量和心臟重量計(jì)算心臟體質(zhì)量比，蘇木精–伊紅染色觀察心臟組織形態(tài)，TUNEL檢測(cè)法檢測(cè)心臟組織凋亡，ELISA法檢測(cè)小鼠血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量水平。將小鼠心肌細(xì)胞仍分為上述四組，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞活性和凋亡；ELISA法檢測(cè)心肌細(xì)胞上清液中LDH、AST、MDA和SOD的含量。SAL可減輕ADM誘導(dǎo)的心肌肥厚、改善射血分?jǐn)?shù)和降低心臟體質(zhì)量比（<0.05），減輕心肌組織纖維化，減少組織細(xì)胞發(fā)生凋亡（<0.05）；降低了ADM誘導(dǎo)的小鼠血清中LDH、AST、BNP和MDA水平（<0.05），升高了SOD的水平（<0.05）；SAL能提高ADM抑制的心肌細(xì)胞活性（<0.05）、減少細(xì)胞凋亡（<0.05），降低了小鼠心肌細(xì)胞中LDH、AST和MDA水平（<0.05），升高了SOD的水平（<0.05）。SAL可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮對(duì)ADM誘導(dǎo)的心臟毒性的保護(hù)作用。

丹參多酚酸鹽；阿霉素；心臟毒性

蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物阿霉素（adriamycin，ADM），是臨床廣泛使用的細(xì)胞毒性藥物之一。研究顯示，如果使用劑量超出400～700mg/m2的范圍，蒽環(huán)類(lèi)藥物會(huì)導(dǎo)致劑量依賴(lài)性的心臟毒性[1]，因而ADM在臨床使用中受到劑量限制[2]。右丙亞胺（dexrazoxane，DEX）是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)臨床使用的心臟保護(hù)劑，但其具有生殖毒性，且可加重化療藥物引起的骨髓抑制，長(zhǎng)期使用可發(fā)生繼發(fā)性惡性腫瘤（主要為急性髓性白血?。3]。丹參的水溶性成分丹參多酚酸鹽（salvianolate，SAL）具有減輕氧自由基損傷、提高機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，SAL能使缺血再灌注后的心肌凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少[4]。本研究通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)研究SAL對(duì)ADM誘導(dǎo)的心臟毒性的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

選取6周齡雄性C3H/HeN小鼠40只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。小鼠原代心肌細(xì)胞（批號(hào)：CPKP-M073）購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市腫瘤醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：EYOUNG-20210205-03）。

1.2 藥物與試劑

阿霉素（生產(chǎn)單位：輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20013334，規(guī)格：10mg/瓶）；蘇木精–伊紅染液套裝、蛋白酶K、TUNEL試劑盒和DAPI均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD醫(yī)療器械有限公司，小鼠ELISA試劑盒購(gòu)購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 藥物制備與分組

1.3.1 丹參多酚酸鹽制備 丹參的風(fēng)干根購(gòu)自杭州市中醫(yī)院中藥房，通過(guò)蒸餾水將丹參干燥的根部煮沸制備，采用高效液相色譜法對(duì)丹參多酚酸鹽進(jìn)行含量測(cè)定，將提取物用生理鹽水稀釋成10mg/ml，4℃保存?zhèn)溆肹5]。

1.3.2 動(dòng)物分組與給藥 40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、ADM組、ESAL組、HSAL組，每組10只。對(duì)照組第5、12天于小鼠腹腔左側(cè)注射生理鹽水2ml，ADM組第5、12天于腹腔左側(cè)注射ADM 7.5mg/kg，注射體積2ml，給藥方式和劑量參考先前報(bào)道[6]；對(duì)照組和ADM組小鼠腹腔右側(cè)均每天注射生理鹽水2ml。ESAL組和HSAL組除第5、12天于腹腔左側(cè)注射7.5mg/kg ADM 2ml外，每天于腹腔右側(cè)注射SAL（ESAL為15mg/kg，HSAL為30mg/kg）2ml，連續(xù)14天。

1.3.3 細(xì)胞分組與給藥 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)仍設(shè)置對(duì)照組、ADM組、ESAL組、HSAL組，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)照組不加藥物，ADM組加入ADM 20μmol/L，ESAL組和HSAL組除加入ADM 20μmol/L外，還需加入SAL（ESAL為14μmol/L，HSAL為28μmol/L），培養(yǎng)24h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 心臟結(jié)構(gòu)和功能檢測(cè) 將小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，備皮，采用動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)，取5個(gè)心動(dòng)周期的平均值記錄數(shù)據(jù)，評(píng)價(jià)小鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能。心臟結(jié)構(gòu)監(jiān)測(cè)包括左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、室間隔舒張末室厚度（intraventricular septum end-diastolic thickness，IVSEDT）、室間隔收縮末厚度（intraventricular septum end-systolic thickness，IVSEST），左心室后壁舒張末厚度（left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVEDPWT）和左心室后壁收縮末厚度（left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVESPWT），這些指標(biāo)均反映了心臟的肥厚程度；評(píng)價(jià)心臟功能指標(biāo)包括左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening LVFS）。

1.4 心臟體質(zhì)量比

處死小鼠，取出心臟，稱(chēng)小鼠體質(zhì)量和全心重量，計(jì)算心臟心臟體質(zhì)量比[全心重量（g）/體質(zhì)量（g）]。

1.5 蘇木精-伊紅染色

將石蠟包埋的心臟組織標(biāo)本切片、脫蠟，蘇木精–伊紅染色，脫水封片后，顯微鏡下采集圖像并分析（細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色）。

1.6 組織凋亡染色

心臟組織切片脫蠟、蛋白酶K修復(fù)、破膜，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，進(jìn)行組織凋亡染色；使用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片后于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像（DAPI染出的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下呈藍(lán)色，F(xiàn)ITC熒光素標(biāo)記陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核呈綠色）；心肌組織凋亡率：分別計(jì)數(shù)400倍的高倍鏡下至少5個(gè)視野內(nèi)的綠色細(xì)胞數(shù)與藍(lán)色細(xì)胞數(shù)的比率。

1.7 細(xì)胞活性檢測(cè)

取小鼠原代心肌細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的心肌細(xì)胞以3×104細(xì)胞/孔的密度鋪于96孔板中，給藥處理24h，CCK-8試劑盒評(píng)估細(xì)胞活力，使用酶標(biāo)儀在450nm的波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞活性＝（實(shí)驗(yàn)組值–空白調(diào)零值）/（對(duì)照組值–空白調(diào)零值）×100%。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞以1.2×106細(xì)胞/孔種植于6孔板，給藥處理24h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 小鼠血清和原代心肌細(xì)胞中LDH、MDA、SOD、AST、BNP含量變化

C3H/HeN小鼠取血或取小鼠原代心肌細(xì)胞，離心后取上清液，ELISA試劑盒分析小鼠血清或心肌細(xì)胞上清液中LDH、MDA、SOD、AST、BNP的含量變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能比較

與對(duì)照組比較，ADM組、ESAL組和HSAL組中小鼠心臟結(jié)構(gòu)指標(biāo)（LVEDD、LVESD、IVSEDT、IVSEST、LVEDPWT和LVESPWT）數(shù)值均顯著增加（<0.05），與ADM組比較，ESAL組和HSAL組中小鼠心肌肥厚度顯著下降（<0.05）。與ADM組比較，ESAL組和HSAL組均可改善心臟射血功能（<0.05），見(jiàn)表1。ESAL組和HSAL組間心肌肥厚程度和心臟射血功能比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，各給藥組中小鼠LVEF、LVFS顯著降低（<0.05），見(jiàn)圖1。

表1 各組小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能比較（，mm，n=5）

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖1 各組小鼠LVEF和LVFS比較

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

2.2 小鼠心臟體質(zhì)量比比較

與對(duì)照組比較，各給藥組中小鼠心臟體質(zhì)量比均顯著性升高（<0.05），與ADM組比較，ESAL組和HSAL組均可減輕ADM誘導(dǎo)的心臟水腫（<0.05），但ESAL組和HSAL組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠全心重量、體質(zhì)量及心臟體質(zhì)量比變化情況（，n=5）

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

2.3 各組小鼠心肌組織形態(tài)變化

對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞核位于細(xì)胞中部，呈長(zhǎng)橢圓形，心肌纖維排列整齊，間隙大小均等；而ADM組中心肌細(xì)胞損傷較嚴(yán)重，細(xì)胞腫脹變圓，心肌細(xì)胞纖維化明顯，排列紊亂，間隙大小不一；與ADM組相比，ESAL組和HSAL組心肌細(xì)胞損傷均有不同程度的恢復(fù)，其中HSAL組心肌細(xì)胞腫脹程度明顯減輕，心肌纖維排列部分恢復(fù)有序狀態(tài)，見(jiàn)圖2。

2.4 各組小鼠心肌組織凋亡情況比較

與對(duì)照組相比，各給藥組組中TUNEL染色陽(yáng)性（綠色熒光，圖3A）的細(xì)胞增多，心肌組織凋亡率顯著升高（圖3B）（<0.05）；與ADM組比較，ESAL和HSAL組均可顯著減少ADM誘導(dǎo)的心肌組織凋亡（<0.05），ESAL和HSAL組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見(jiàn)圖3。

2.5 各組小鼠血清中LDH、AST、BNP、MDA和SOD水平比較

與對(duì)照組比較，各給藥組小鼠血清中LDH、AST、BNP和MDA的含量均顯著升高（<0.05），SOD的含量均顯著降低（<0.05）；與ADM組比較，ESAL組和HSAL組均顯著降低ADM誘導(dǎo)的LDH、AST、BNP和MDA的水平（<0.05），顯著升高SOD水平（<0.05），ESAL組和HSAL組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見(jiàn)圖4。

2.6 各組小數(shù)心肌細(xì)胞活性比較

與對(duì)照組比較，各給藥組小鼠原代心肌細(xì)胞的存活率顯著降低（<0.05）；與ADM組比較，ESAL組和HSAL組中心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著升高（<0.05），ESAL組和HSAL組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見(jiàn)圖5。

2.7 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較

與對(duì)照組比較，各給藥組心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率顯著升高（<0.05）；與ADM組比較，ESAL組和HSAL組中細(xì)胞凋亡率均顯著降低（<0.05），ESAL組和HSAL組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見(jiàn)圖6。

2.8 各組小鼠LDH、AST、MDA和SOD的含量比較

與對(duì)照組比較，各給藥組心肌細(xì)胞上清液中LDH、AST和MDA的含量均顯著升高（<0.05），SOD的含量均顯著降低（<0.05）；與ADM組比較，ESAL組和HSAL組中LDH、AST和MDA含量均降低（<0.05），SOD含量顯著升高（<0.05），ESAL組和HSAL組間上述指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見(jiàn)圖7。

圖2 小鼠心肌組織形態(tài)變化（HE染色，×200）

圖3 各組小鼠心肌組織凋亡情況比較

A.TUNEL染色觀察心肌組織凋亡（×400）；B.各組小鼠心肌組織凋亡率

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖4 各組小鼠血清中LDH、AST、BNP、MDA和SOD的水平比較

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖5 CCK-8檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖7 各組小鼠LDH、AST、MDA和SOD水平比較

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

3 討論

ADM誘導(dǎo)的心臟毒性在腫瘤治療中是極其嚴(yán)重的不良反應(yīng)，現(xiàn)有多種機(jī)制來(lái)解釋ADM引起的心臟毒性的發(fā)病機(jī)制，包括氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化等[7-8]。阿霉素誘導(dǎo)心肌毒性的產(chǎn)生已被證實(shí)與氧自由基相關(guān)，尤其是抗氧化物SOD減少、活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多，從而觸發(fā)氧化應(yīng)激事件導(dǎo)致細(xì)胞損傷[7]。ADM可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外多種生化成份過(guò)氧化堆積，如脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA，MDA可損傷生物膜，使膜酶受損、活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞變性壞死[8]。此外，ADM誘導(dǎo)的心肌損害，會(huì)導(dǎo)致心臟毒性生物標(biāo)志物，如LDH、AST、BNP等從受損的心肌細(xì)胞中釋放，這些都可作為監(jiān)測(cè)ADM 誘導(dǎo)心臟毒性的敏感指標(biāo)[9]。盡管已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究以減少ADM誘導(dǎo)的心臟毒性，但尚未發(fā)現(xiàn)安全有效的預(yù)防措施。

丹參多酚酸鹽是由中藥材丹參的根提制而成，它具有鎮(zhèn)靜、抗氧化和促進(jìn)血液循環(huán)等作用。丹參中主要包含脂溶性和水溶性化合物兩大成分，其中，水溶性化合物主要由丹參素、原兒茶酚及SAL等組成。有研究報(bào)道，SAL具有抗氧化和清除自由基作用，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[10]。Hung等[11]研究發(fā)現(xiàn)丹參水提取物對(duì)ADM介導(dǎo)的大鼠心肌來(lái)源的H9c2細(xì)胞的死亡具有劑量依賴(lài)性的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，SAL可減輕ADM預(yù)處理后小鼠心肌肥厚、改善心臟射血功能和減輕心臟水腫、減少心肌纖維化和心肌組織凋亡的發(fā)生，還可以減少小鼠心臟毒性指標(biāo)（LDH、AST和BNP）釋放。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，SAL增強(qiáng)了心肌細(xì)胞活性和抑制心肌細(xì)胞凋亡，同樣可以降低心肌細(xì)胞上清液中LDH、AST水平。通過(guò)上述體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)SAL對(duì)ADM誘導(dǎo)的心臟毒性具有保護(hù)作用。本研究中還通過(guò)ELISA法檢測(cè)了小鼠血清和原代心肌細(xì)胞上清液中SOD和MDA水平，結(jié)果證實(shí)SAL可以促進(jìn)SOD的釋放及抑制MDA的表達(dá)。

綜上所述，SAL可能是通過(guò)促進(jìn)抗氧化物SOD釋放以減少氧化應(yīng)激事件、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA產(chǎn)生以減輕ADM對(duì)細(xì)胞膜的損傷，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞和心肌組織發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮其對(duì)ADM誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)作用的。這一結(jié)果有可能為臨床安全使用ADM提供更加有效的措施。但SAL具體如何促進(jìn)抗氧化劑SOD釋放及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化MDA產(chǎn)生的機(jī)制仍不清楚，需要更進(jìn)一步的研究來(lái)揭示相關(guān)的分子機(jī)制。

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Study on the inhibition of oxidative stress by salvia polyphenolates to alleviate adriamycin-induced cardiotoxicity

ZHANG Minmin, HUANG Xinyu, DAI Hui

1.Department of Radiotherapy, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310002, Zhejiang, China; 2.Department of Medical Oncology, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310002, Zhejiang, China

To investigate the protective effect and regulatory mechanism of salvianolate (SAL) on adriamycin (ADM)-induced cardiotoxicity.A total of 40 mice were randomly divided into control group, ADM group, equivalent dose of salvianolate (ESAL) group, high-dose salvianolate group (HSAL) group, with 10 rats in each group. The heart structure and cardiac function were detected by ultrasound, the weight and heart weight of mice were measured to calculate the heart weight ratio, and the morphology of heart tissue was observed by HE staining, TUNEL assay to detect cardiac tissue apoptosis, ELISA method was used to detect the contents of lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (AST), B-type natriuretic peptide (BNP), malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in mouse serum. The mouse primary cardiomyocytes were still divided into the above 4 groups, with each group consisting of three repeated wells, and each experiment was repeated three times. the cardiomyocyte activity and apoptosis were detected by CCK-8 and apoptosis kit; ELISA method was used to detect LDH, AST, MDA and SOD content in cardiomyocyte culture medium.SAL can reduce ADM induced myocardial hypertrophy, improve ejection fraction and reduce heart weight ratio (<0.05), reduce myocardial fibrosis, and reduce apoptosis of tissue cells (<0.05). It decreased the levels of LDH, AST, BNP and MDA in serum of mice induced by ADM (<0.05), and increased the level of SOD (<0.05). SAL can increase the activity of cardiomyocytes inhibited by ADM (<0.05), reduce apoptosis (<0.05), decreased the level of LDH, AST and MDA in mouse cardiomyocytes (<0.05), increased the level of SOD (<0.05).SAL may play a protective role on ADM induced cardiotoxicity by inhibiting oxidative stress.

Salvianolate; Adriamycin; Cardiotoxicity

R273

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.26.024

杭州市農(nóng)業(yè)與社會(huì)發(fā)展科研項(xiàng)目（20180533B64）

黃新宇，電子信箱：zhouhui3k686@163.com

（2022–11–13）

（2023–08–20）