朱飛雪, 程玉江, 郭 麗

(1. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南中牟 451450; 2. 河南東寶園林綠化工程有限公司,河南鄭州 451450)

脫落酸(ABA)是植物體內(nèi)重要的天然激素,在植物細(xì)胞分化、休眠、組織發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。當(dāng)植物受到外部環(huán)境脅迫時(shí),ABA的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及分布會(huì)受到顯著影響[2]。WRKY蛋白是植物中特異的轉(zhuǎn)錄因子家族,其特征為WRKY在蛋白質(zhì)序列中存在高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域,WRKY結(jié)構(gòu)域由1個(gè)保守的核心序列WRKY-GQK和1個(gè)鋅指基序組成[3]。WRKY蛋白可根據(jù)WRKY保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和氨基酸序列分為3型:Ⅰ型WRKY蛋白包含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域,而Ⅱ、Ⅲ型WRKY皆由1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域組成;但不同型WRKY的鋅指基序不同,在Ⅰ、Ⅱ型WRKY蛋白的C末端具有C2H2基序,而Ⅲ型的C末端則為C2HC[4]。此外,根據(jù)序列相似性,Ⅱ型分為a、b、c、d、e 5個(gè)亞型[5]。已有研究表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)對(duì)生物脅迫和調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用,然而其對(duì)植物激素的串聯(lián)反應(yīng)鮮有研究涉及。

自從WRKY轉(zhuǎn)錄因子首次在蘭科植物中被發(fā)現(xiàn)以來(lái),關(guān)于WRKY基因的研究主要集中于生物學(xué)進(jìn)展上,多項(xiàng)研究證實(shí)WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與腺毛生長(zhǎng)、種子萌發(fā)、果實(shí)成熟、葉片衰老等過(guò)程[6-8]。Raineri等研究表明,在水分脅迫下,HaWRKY76轉(zhuǎn)基因株系和野生型向日葵轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗逆性和更高的產(chǎn)量[9]。王茹等發(fā)現(xiàn),番茄SlWRKY6轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)植株細(xì)胞壁螯合重金屬,從而對(duì)植株重金屬累積具有負(fù)調(diào)控作用[10]。低溫脅迫下,馬鈴薯StWRKY15基因的過(guò)表達(dá)可顯著提高脯氨酸、可溶性糖、總蛋白含量,降低丙二醛分泌,從而減輕寒冷脅迫對(duì)植株帶來(lái)的不利影響[11]。在水稻中,OsWRKY11可被熱應(yīng)激和轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),從而增強(qiáng)水稻幼苗對(duì)高溫脅迫的耐受性[12]。此外,WRKY轉(zhuǎn)錄因子在病害[13]、蟲(chóng)害[7,14-15]等生物脅迫方面亦發(fā)揮著重要作用。

蘭科是最大的被子植物之一,約占被子植物總量的10%,在全世界約有750屬25 000余種。目前關(guān)于蘭科植物的研究主要集中在花朵發(fā)育、色素機(jī)制、菌根共生等方面[16]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)特別是高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,已經(jīng)探索了蘭科MADS-box、MYB家族的全基因組特征和響應(yīng)環(huán)境變化的功能分析[17]。蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)是我國(guó)栽培的重要蘭科植物,具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而,該品種的過(guò)度挖取和生態(tài)環(huán)境惡化,使得蝴蝶蘭種質(zhì)資源和生存環(huán)境維護(hù)日趨嚴(yán)峻[18]。WRKY家族是植物中最大的超家族之一,然而對(duì)蘭科植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)及功能卻知之甚少?；诖?本研究從蝴蝶蘭中克隆并分析了PaWRKY57基因,探索了該基因的理化特性、亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)、響應(yīng)脫落酸的功能分析,旨在為蝴蝶蘭的育種和遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料處理

試驗(yàn)于2021年6—10月在河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院人工氣候室中進(jìn)行。蝴蝶蘭品種為滿天紅,為河南東寶綠化工程園林有限公司培養(yǎng)的二年生組培苗。供試野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子為擬南芥Col-0生態(tài)型,過(guò)表達(dá)擬南芥種子為PaWRKY57轉(zhuǎn)化型,供試煙草品種為本氏煙草(Nicotianabenthamiana),購(gòu)自福州愛(ài)若莎生物科技有限公司。供試脫落酸(ABA,C15H20O4)購(gòu)自Sigma-Aldrich化工試劑公司。供試培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭、蛭石按體積比2 ∶ 1復(fù)配。

將二年生的蝴蝶蘭組培苗置于75%相對(duì)濕度的人工氣候室中培養(yǎng),光—暗周期為16 h—8 h,光照度為150 μmol/(m2·s),晝、夜溫度分別為26、22 ℃;并在0、2、4、8、12、24、48 h取樣保存于 -80 ℃ 環(huán)境。用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的本氏煙草培養(yǎng)環(huán)境同蝴蝶蘭組培苗。

將野生Col-0生態(tài)型擬南芥種子置于裝滿培養(yǎng)基質(zhì)的缽體中,標(biāo)記為WT,基質(zhì)含水量為75%,轉(zhuǎn)移至人工氣候室中。相關(guān)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化品系培養(yǎng)方式同Col-0生態(tài)型。對(duì)于過(guò)表達(dá)擬南芥的外源脫落酸處理:采用10 mmol/L ABA噴灑擬南芥的葉子直至滴落,并在處理后0、12、24、48 h取樣。

1.2 WRKY基因克隆及序列分析

1.2.1WRKY基因的克隆 采用MiniBEST Plant RNA 提取試劑盒[TaKaRa,寶生物工程(大連)有限公司]對(duì)蝴蝶蘭進(jìn)行總RNA提取,采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒[TaKaRa,寶生物工程(大連)有限公司]逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,將cDNA稀釋100倍以適合PCR反應(yīng),引物由Oligo5.0軟件根據(jù)PaWRKY57基因序列設(shè)計(jì)(表1),并通過(guò)RT-PCR克隆全長(zhǎng)PaWRKY57基因。PCR反應(yīng)程序如下:94 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量和純度。將擴(kuò)增的片段純化并連接到pEASYBlunt載體,然后將該載體轉(zhuǎn)化到Trans5α細(xì)胞中,并測(cè)試其克隆陽(yáng)性反應(yīng)。

表1 qRT-PCR引物序列信息

1.2.2WRKY基因的序列分析 通過(guò)Expasy系統(tǒng)(http://web.expasy.org/compute_pi/)在線預(yù)測(cè)氨基酸序列的物理和化學(xué)性質(zhì),包括分子量和等電點(diǎn)[19]。使用WOLF PSORT (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)對(duì)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)保守域進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。多序列比對(duì)通過(guò)Clustal W (http://www.clustal.org/clustal2/)和DNAMAN5.0軟件(Lynnon Biosoft,https://www.lynnon.com/dnaman.html)進(jìn)行。AtWRKY和OsWRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列從TAIR 9.0 (http://www.arabidopsis.org/index.jsp)和植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下載。采用MEGA 7.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)架系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),bootstrap設(shè)置為1 000[20]。

1.3 亞細(xì)胞定位測(cè)定

利用在線軟件Plant-mPLoc 9.0(http://linux1.softberry.com/all.htm)和Cell-PLoc 2.0軟件[21](http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對(duì)蝴蝶蘭PaWRKY57蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。根據(jù)PaWRKY57序列設(shè)計(jì)不含有終止密碼子(ORF)的XbaI/SmaI酶切位點(diǎn)特異性引物(表1),并以蝴蝶蘭cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用雙酶切技術(shù)(NEB)將產(chǎn)物與pBI121-綠色熒光蛋白(GFP)載體用T3連接酶連接,最終構(gòu)建pBI121-GFP ∶PaWRKY57融合表達(dá)載體。將新鮮的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101中,5 000 r/min離心10 min,棄上清,在沉淀物中加入新鮮的煙草浸潤(rùn)緩沖液(0.15 μmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES(嗎啉乙磺酸),pH值為5.6),最終D600 nm調(diào)節(jié)為0.8。室溫靜置2 h后接種至5葉齡的健康本式煙葉表皮。采用共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM710,Carl Zeiss,Jena,德國(guó))觀察。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR分析

采用同基因克隆方式提取植物RNA,合成cDNA,使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)在Step One Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher,Waltham,MA,美國(guó))上進(jìn)行RT-qPCR分析。反應(yīng)程序如下:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個(gè)循環(huán)。在分析PaWRKY57的表達(dá)水平時(shí),使用蝴蝶蘭的18S-1300作為內(nèi)參基因(表1)。qRT-PCR結(jié)果采用2-△△CT算法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.5 PaWRKY57的擬南芥植株轉(zhuǎn)化

pBI121-35S ∶PaWRKY57通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花朵浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥[13]。感染擬南芥花朵45～60 s后,在黑暗中培養(yǎng)20 h,在含有50 mg/L卡那霉素(C18H38N4O15S)的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因種子,并將傳代植物用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.6 轉(zhuǎn)化植株葉綠素含量及內(nèi)源性技術(shù)含量測(cè)定

葉綠素含量(葉綠素a、葉綠素b)測(cè)定皆采用乙醇丙酮浸提法,采用紫外分光光度計(jì)(UV-1800,上海美譜達(dá)儀器有限公司)在663、646 nm處測(cè)定,具體步驟參照李合生的方法[22]。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定擬南芥葉片中內(nèi)源激素脫落酸(ABA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)的含量,具體步驟參考Xu等所述[23]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2020對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),采用鄧肯氏多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(α=0.05),采用Origin 2022進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭PaWRKY57基因克隆及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

以蝴蝶蘭cDNA為模板用PaWRKY57的特異性引物PaWRKY57-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),得到全長(zhǎng)2 049 bp的特異性條帶(圖1-A)。PaWRKY57具有1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼682個(gè)氨基酸。利用Expasy在線工具預(yù)測(cè)結(jié)果表明,PaWRKY57蛋白的理論等電點(diǎn)為6.17,分子質(zhì)量為76 416.43 ku,不穩(wěn)定指數(shù)為45.24,脂肪系數(shù)為45.79,平均親水性系數(shù)為 -0.906,顯示PaWRKY57蛋白是一種不穩(wěn)定的親水蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)由19.50%的α-螺旋、15.25%延伸鏈、4.84%β-轉(zhuǎn)角和60.41%的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成(圖1-B)。

2.2 蝴蝶蘭PaWRKY57基因序列和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

根據(jù)SMART在線工具分析,選取與PaWRKY57同源植物的WRKY保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明,PaWRKY57與WRKY家族Ⅲ型的水稻OsWRKY45,擬南芥的AtWRKY30、AtWRKY41、AtWRKY53、AtWRKY70進(jìn)行序列對(duì)比,發(fā)現(xiàn)其皆具有WRKY家族典型的“WRKYGQK”域,表明PaWRKY57屬于Ⅲ型家族(圖2-A)。為進(jìn)一步確定PaWRKY57的分類地位,采用MEGA 7.0軟件對(duì)WRKY之間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,結(jié)果顯示13個(gè)蝴蝶蘭WRKY轉(zhuǎn)錄因子分別屬于Ⅲ型(PaWRKY70、PaWRKY57、PaWRKY53)、Ⅰ型(PaWRKY2、PaWRKY3、PaWRKY24、PaWRKY4)、Ⅱa型(PaWRKY40)、Ⅱb型(PaWRKY31)、Ⅱc型(PaWRKY49)、Ⅱd型(PaWRKY21、PaWRKY11)、Ⅱe型(PaWRKY65)?？偠灾?確定PaWRKY57屬于Ⅲ型亞家族(圖2-B)。

2.3 PaWRKY57在不同組織和ABA處理下的葉片表達(dá)模式

基因表達(dá)模式通常與基因功能密切相關(guān)。為了更好地了解PaWRKY57的功能,分析了其在蝴蝶蘭不同組織(根系、假鱗莖、葉片、花朵)中的表達(dá)水平。結(jié)果表明,PaWRKY57基因在所有組織中都有陽(yáng)性表達(dá),但在這4個(gè)器官中表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平,其中在假鱗莖中表達(dá)水平最低,在葉片中相對(duì)表達(dá)量最高(圖3-A),表明PaWRKY57與葉片發(fā)育最為相關(guān)。作為一種植物激素反應(yīng)因子,PaWRKY57對(duì)外源性脫落酸反應(yīng)強(qiáng)烈,噴施ABA后PaWRKY57的表達(dá)水平顯著增加,并在處理后2 h達(dá)到峰值,而其在12 h的表達(dá)水平與2 h相當(dāng),此后急劇下降(圖3-B),這種“升—降—升—降”的表達(dá)模式表明PaWRKY57與外源脫落酸之間存在較為復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。

2.4 PaWRKY57的亞細(xì)胞定位

為了在蛋白質(zhì)水平上探索PaWRKY57在細(xì)胞中的可能駐位點(diǎn),借助在線分析工具WoLF PSORT預(yù)測(cè)了PaWRKY57蛋白的分布位置。如圖4所示,PaWRKY57可能存在于細(xì)胞核中;為了確定PaWRKY57的亞細(xì)胞準(zhǔn)確位置,構(gòu)建了一個(gè)PaWRKY57 ∶ GFP融合蛋白,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸潤(rùn)在本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明,在激光共聚焦顯微鏡下,細(xì)胞核DNA被二脒基-2-苯基吲哚的藍(lán)色熒光(DAPI)染色,PaWRKY57 ∶ GFP綠色熒光與藍(lán)色熒光大部分重疊,表明PaWRKY57位于細(xì)胞核內(nèi)。

2.5 過(guò)表達(dá)PaWRKY57及響應(yīng)ABA處理的表型分析

選擇來(lái)自T2代的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行表型觀察。通過(guò)觀察擬南芥的整個(gè)生長(zhǎng)周期,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PaWRKY57的轉(zhuǎn)基因植株比野生生態(tài)型(WT)植株開(kāi)花更早(圖5-A),同時(shí)葉片衰老黃化更迅速(圖5-B、圖5-C),噴施ABA進(jìn)一步加快了葉片的衰老;即相同培養(yǎng)周期內(nèi),過(guò)表達(dá)PaWRKY57或過(guò)表達(dá)噴施ABA其葉形無(wú)明顯變化,但葉黃化更明顯。為此測(cè)定了植株葉片葉綠素含量,結(jié)果表明,PaWRKY57過(guò)表達(dá)以及噴施ABA條件下均顯著降低了擬南芥葉片葉綠素a、葉綠素b含量(圖5-D～E)。在葉綠素a與葉綠素b含量比值中,轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥無(wú)明顯差異,且均顯著低于 ABA+PaWRKY57處理(圖5-G)。綜上,過(guò)表達(dá)PaWRKY57使植株生長(zhǎng)史時(shí)間縮短,在此基礎(chǔ)上噴施ABA則加速葉片衰老。

2.6 ABA處理下過(guò)表達(dá)擬南芥葉片激素變化分析

由圖6所示,在擬南芥的葉片中檢測(cè)到了內(nèi)源激素,包括脫落酸、赤霉素、油菜素內(nèi)酯、吲哚乙酸。結(jié)果顯示,脫落酸噴施處理下,轉(zhuǎn)化擬南芥中的ABA、GAs含量呈相同變化趨勢(shì),即隨著脫落酸噴施處理時(shí)間的延長(zhǎng),ABA、GAs含量呈先升高后降低的趨勢(shì),脫落酸處理后各處理ABA、GAs含量均表現(xiàn)為ABA+PaWRKY57>PaWRKY57>WT,且ABA+PaWRKY57均在處理后12 h出現(xiàn)峰值,此時(shí)PaWRKY57、ABA+PaWRKY57、WT間兩兩均差異顯著(圖6-A、圖6-B)。而在脫落酸噴施處理后,各處理BR含量均呈上升趨勢(shì),且各處理BR含量均呈WT>PaWRKY57>ABA+PaWRKY57(圖6-C)。IAA含量與BR含量存在相反變化趨勢(shì),即隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),IAA含量均呈下降趨勢(shì),但同時(shí)各處理IAA含量均呈WT>PaWRKY57>ABA+PaWRKY57(圖6-D)。

3 討論

蝴蝶蘭為蘭科(Orchidaceae)蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)多年生觀賞性草本植物,蝴蝶蘭以其花姿優(yōu)美、葉色翠綠、香氣馥郁、葉藝優(yōu)雅等特點(diǎn)深受園藝愛(ài)好者喜愛(ài)[24]。本研究從蝴蝶蘭中克隆得到PaWRKY57蛋白,生物學(xué)信息表明:PaWRKY57理論等電點(diǎn)為6.17,分子質(zhì)量為76 416.43 ku,脂肪系數(shù)為45.79,且不穩(wěn)定指數(shù)大于40(45.24)、平均親水性系數(shù)為負(fù)值(-0.906)。根據(jù)Expasy系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)判別顯示,PaWRKY57蛋白是一種不穩(wěn)定的親水蛋白[19]。

本研究序列對(duì)比分析表明,蝴蝶蘭WRKY蛋白存在完整的WRKYGQK序列。前人研究發(fā)現(xiàn)不同植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基序保守序列不同,而被子植物進(jìn)化而來(lái)的WRKY蛋白發(fā)生突變、存在大概率事件[25]。然而,本研究中PaWRKY57結(jié)構(gòu)域的核心序列不包含突變序列(圖2-A),表明PaWRKY57結(jié)構(gòu)域高度保守且其氨基酸序列在進(jìn)化過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生大量變化。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示PaWRKY57、AtWRKY53等隸屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的Ⅲ型家族;而PaWRKY57、OsWRKY47同屬一個(gè)小分支中,說(shuō)明兩者在功能上可能與水稻OsWRKY47相似?；陔p酶切技術(shù)構(gòu)建pBI121-GFP ∶ PaWRKY57融合表達(dá)載體,雙熒光染色分析顯示在本氏煙葉葉片中PaWRKY57存在于細(xì)胞核內(nèi)。

基因表達(dá)模式是反映基因功能表達(dá)導(dǎo)向的重要指標(biāo),在植物組織中高表達(dá)的WRKY家族往往主導(dǎo)該組織的生長(zhǎng)發(fā)育[26]。如編碼擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的TESTA GLABRA2(TTG2)早期存在于種皮中,而進(jìn)入生長(zhǎng)期后則主要在葉片中表達(dá)[27]。擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的37個(gè)成員中有32個(gè)存在于葉片表達(dá)域中,表明WRKY在葉細(xì)胞成熟中發(fā)揮特殊作用[28]。本研究中,組織表達(dá)分析表明,PaWRKY57在根系、假鱗莖、葉片、花序中均有表達(dá),但在葉片中的表達(dá)水平顯著高于其他組織,表明其在葉片相關(guān)生理調(diào)控中扮演著重要角色。脫落酸噴施處理下葉片PaWRKY57表現(xiàn)出“升—降—升—降”的表達(dá)模式,同時(shí)在噴施ABA后PaWRKY57基因在2、12 h具有最高的表達(dá)水平;雙峰的表達(dá)模式意味著ABA在誘導(dǎo)PaWRKY57的過(guò)程中可能存在多激素潮汐式的波動(dòng)影響[29]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用已被眾多研究證實(shí),最新的研究發(fā)現(xiàn)WRKY在植物葉片衰老、矮化等表型的形態(tài)建成方面起著關(guān)鍵作用[30]。一些研究表明,擬南芥AtWRKY53在葉片衰老早期顯著上調(diào),其在轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中的過(guò)表達(dá)加速了葉片衰老進(jìn)程,而沉默AtWRKY53則延緩了葉片衰老[31]。Besseau等研究發(fā)現(xiàn),敲除AtWRKY54、AtWRKY70的雙突變體植株衰老更快[32]。為進(jìn)一步研究PaWRKY57轉(zhuǎn)錄因子的功能,通過(guò)花浸泡法獲得過(guò)表達(dá)PaWRKY57植株,與WT擬南芥相比,同一培養(yǎng)期內(nèi),過(guò)表達(dá)PaWRKY57的轉(zhuǎn)基因植物開(kāi)花提前且葉片黃化明顯,表明該基因的過(guò)表達(dá)可能正調(diào)控植物的衰老過(guò)程。

ABA是WRKY調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一,在轉(zhuǎn)錄信號(hào)通路中充當(dāng)催化劑或抑制劑[33]。茶樹(shù)的CsWRKY2基因在葉片中的表達(dá)量較高,ABA信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控CsWRKY2基因在植物對(duì)寒冷和干旱脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[34]。鐵皮石斛的DoWRKY5抑制ABI5基因響應(yīng)ABA的表達(dá),并與ABAR調(diào)節(jié)因子負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[35]。本研究中,在轉(zhuǎn)基因植株上噴施ABA,轉(zhuǎn)基因植株葉片黃化加劇、葉綠素a/b含量比值更高;此外,液相色譜分析顯示,噴施ABA條件下過(guò)表達(dá)植株抑生型激素(ABA、GAs)含量更高,而促生長(zhǎng)激素(BR、IAA)含量更低。表明PaWRKY57是一個(gè)衰老基因且對(duì)ABA反應(yīng)敏感,ABA作為促進(jìn)劑正向調(diào)控著PaWRKY57的功能表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究表明,蝴蝶蘭PaWRKY57是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白,具有一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼682個(gè)氨基酸。亞細(xì)胞定位顯示,PaWRKY57蛋白位于細(xì)胞核中,根據(jù)其預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞定位可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。結(jié)構(gòu)域分析和同源性比較表明,PaWRKY57蛋白具有WRKYGQK結(jié)構(gòu)域,屬于WRKY家族Ⅲ型家族,系統(tǒng)發(fā)育分析表明PaWRKY57與水稻OsWRKY47在生物學(xué)功能上密切相關(guān)。實(shí)時(shí)熒光PCR分析顯示,PaWRKY57在根系、假鱗莖、葉片、花序中表達(dá),在葉片中表達(dá)量最高,且在ABA處理下波動(dòng)較大。與野生型擬南芥品系(WT)相比,PaWRKY57過(guò)表達(dá)品系的生育周期縮短、葉片黃化嚴(yán)重、葉綠素含量降低、促生型植物激素含量降低、抑生型植物激素含量增加。綜上,PaWRKY57是一個(gè)響應(yīng)ABA信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子,可能參與了ABA信號(hào)介導(dǎo)調(diào)控的蝴蝶蘭衰老過(guò)程。期待研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究PaWRKY57的功能和為未來(lái)蝴蝶蘭的遺傳改良與培育提供理論依據(jù)。