李穎穎, 康業(yè)斌, 李成軍, 李淑君

(1.河南科技大學園藝與植物保護學院,河南洛陽 471000;2.煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室/河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所,河南許昌 461000)

由煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)侵染煙草引起的黒脛病在全球普遍發(fā)生,嚴重威脅煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]。生物防治成為煙草病害防治的發(fā)展趨勢[2]。內(nèi)生細菌豐富多樣,幾乎存在于地球上所有的植物中,不少內(nèi)生細菌具有促進植物生長、提高產(chǎn)品品質(zhì)與增強植株抗病、抗逆能力的作用[3]。陳澤斌等通過培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗,從煙草植株中初步篩選出 4 株能提高煙草種子發(fā)芽率、促進根系生長的內(nèi)生細菌,浮育苗試驗發(fā)現(xiàn)用這些內(nèi)生細菌處理過的煙苗生長發(fā)育更好[4]。雷麗萍從白肋煙 TN90 中分離出一株內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillussp.)菌株WT能顯著降低煙株中的亞硝胺(TSNA)含量[5]。邢穎等發(fā)現(xiàn),相比普通煙株,感染內(nèi)生菌的煙草中亞硝胺類物質(zhì)含量更低,煙草品質(zhì)更佳[6]。梁志超等發(fā)現(xiàn),用內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌制成微生物功能基質(zhì),能達到促生煙苗的效果[7]。夏體淵等發(fā)現(xiàn),通過控制生物炭的不同施用量可以調(diào)整煙草內(nèi)生細菌的種類和數(shù)量[8]。周燕等在黃煙上發(fā)現(xiàn)了能夠防治煙草青枯病的內(nèi)生細菌[9]。云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院建立了國內(nèi)首個煙草內(nèi)生菌資源庫,保存了具有較高殺線蟲活性、提高煙草種子發(fā)芽率、促進根系生長與對煙草黑脛病、空莖病、野火病等具有明顯拮抗作用的內(nèi)生菌菌株[10]。周崗泉等研究發(fā)現(xiàn),煙草中具有抑菌作用的內(nèi)生細菌幾乎均來自抗病品種,抗病品種比感病品種具有更多的拮抗內(nèi)生細菌[11]。目前,已經(jīng)報道的煙草內(nèi)生細菌有 30 多個屬,51 個種[10]。不同煙草種植地區(qū)、不同氣候條件和土壤類型,煙草植株體內(nèi)內(nèi)生細菌種類和數(shù)量存在差異。本研究報道了河南省洛陽地區(qū)煙株內(nèi)生功能細菌的分離鑒定結(jié)果,旨在為煙株內(nèi)生有益微生物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙草植株 2021年6—9月,選擇河南省洛陽市宜陽、汝陽、洛寧、嵩縣等4個縣區(qū)煙田,于煙草團棵期、旺長期及成熟期采集健康煙株164株,帶回實驗室備用。

1.1.2 供試菌株和煙草品種 煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、輪枝鐮刀菌(F.verticillioide)、異絲腐霉(Pythiumdiclinum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、層出鐮刀菌(F.proliferatum)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothide)以及煙草品種(秦煙96)均由河南科技大學植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 主要培養(yǎng)基有NA培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基、M.R培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、苯丙氨酸脫氨酶培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、休和賴夫森二氏培養(yǎng)基、半固體瓊脂培養(yǎng)基、丙二酸鹽培養(yǎng)基[12]。

1.2 試驗時間與地點

煙株樣品采集工作于2021年6、7、8、9月在河南省洛陽市宜陽縣石村煙草種植田、河南省洛陽市汝陽縣劉家凹煙草種植田、河南省洛陽市洛寧縣王村煙草種植田、河南省洛陽市嵩縣流澗峪村煙草種植田進行。

其他試驗部分于2021年6月至2022年12月在河南科技大學植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室進行。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙草內(nèi)生細菌的分離、純化 將根、莖、葉通過清水沖洗后自然晾干,隨機稱取0.4 g,依次用70%乙醇、3%次氯酸鈉消毒,無菌水沖洗3次,以最后1次沖洗的無菌水涂布平板作為空白對照,檢驗樣品表面的微生物是否消毒徹底,通過稀釋涂布平板法分離[13]。

1.3.2 拮抗煙草疫霉內(nèi)生細菌的篩選 (1)初篩:采用平板對峙法測定分離所得菌株對煙草疫霉的抑菌率[13]。(2)復篩:選擇初篩對煙草疫霉抑菌率大于50%的內(nèi)生菌株,通過菌絲生長速率法檢驗其發(fā)酵液對煙草疫霉的抑菌率[14]。

1.3.3 產(chǎn)IAA內(nèi)生細菌的篩選 參照桂楚伊的方法制備吲哚-3-乙酸(IAA)標準曲線[15],利用Salkowski比色法對菌株產(chǎn)IAA能力進行定性、定量測定[16]。

1.3.4 內(nèi)生有益細菌的鑒定 選擇對煙草疫霉初篩抑菌率大于50%與菌株發(fā)酵液IAA含量在 3.7 mg/L 以上的菌株進行鑒定。(1)形態(tài)學鑒定:采用平板劃線法接種待鑒定菌株于NA平板,28 ℃倒置培養(yǎng)3 d,至平板長出單一菌落。觀察單菌落的顏色、形狀、大小、黏稠度、透明度、邊緣等形態(tài)特征。革蘭氏染色和芽孢染色后[15],通過光學顯微鏡觀察菌體和芽孢形態(tài)。(2)生理生化鑒定:菌株的M.R試驗、淀粉水解與糖醇類發(fā)酵等生理生化指標測定參照劉麗輝等的方法進行[17]。(3)16S rDNA 序列測定:根據(jù)生工生物工程(上海)股份有限公司細菌基因組DNA試劑盒方法提取DNA作為模板,采用細菌通用引物27F、1492R進行PCR擴增[18]。為了使鑒定結(jié)果更加準確,同時選用gyrB基因引物UP-1、UP-2R進行擴增測序驗證[19]。PCR擴增體系和反應(yīng)條件見表1。擴增產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測后,送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結(jié)果在GenBank(NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對,以同源性較高的模式菌株基因序列作為參比對象,通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

表1 通用引物及PCR反應(yīng)信息

1.3.5 細菌的抑菌譜測定 采用平板對峙培養(yǎng)法測定12株細菌對 7 種煙草病原菌的抑菌譜。以只接種病原真菌為空白對照,28 ℃倒置培養(yǎng)3～7 d,計算抑菌率。

1.3.6 細菌對煙草種子促生作用的測定 采用培養(yǎng)皿濾紙保濕法測定12株細菌對煙草種子萌發(fā)率的影響及促生效果[21]。將健康的煙草種子置于孢子懸浮液(1×107孢子/mL)中浸泡 16 h,整齊擺放于鋪有滅菌脫脂棉和濾紙保濕的培養(yǎng)皿中,以無菌水浸種為空白對照,每皿30粒(5×6),重復3次。第14天統(tǒng)計種子萌發(fā)率、煙苗根長、莖長和總長(以種子生長節(jié)點區(qū)分根長和莖長,總長為根長與莖長之和),計算增長率。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離

從164份煙株樣品的根、莖及葉片中分別分離出細菌單菌落133、99、157株,依據(jù)這些菌株在NA培養(yǎng)基上菌落的顏色、形態(tài)等特征進行歸類,共分離純化獲得206株細菌菌株。

2.2 拮抗煙草疫霉菌株的篩選

通過平板對峙法測定206株細菌對煙草疫霉的抑菌活性,抑菌率達50%以上的有24株(表2),其中菌株LYYY63-1、LYSX141的抑菌效果最好,抑菌率分別為74.79%、72.58%。菌株LYYY61-2的抑菌率為62.10%,抑菌帶最大,為1.48 cm。復篩結(jié)果表明,增加拮抗菌的接種量可以明顯提高菌株的抑菌效果,當PDA培養(yǎng)基中添加菌株發(fā)酵液至體積濃度為10%時,菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141對煙草疫霉的抑菌率分別達到88.10%、84.55%、73.33%(表3),說明增加空間用量能有效提高菌株的抑菌作用。

表2 內(nèi)生細菌菌株對煙草疫霉的平板抑制效果

表3 內(nèi)生細菌菌株發(fā)酵液對煙草疫霉的抑菌效果

2.3 產(chǎn)IAA菌株的篩選

2.3.1 IAA標準曲線 通過IAA不同質(zhì)量濃度標準品溶液與Salkowski比色計進行顯色反應(yīng),用紫外分光光度計測量樣品溶液在波長535 nm處的吸光度。IAA標準品質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 mg/L 時,測得吸光度分別為0.238、0.659、0.993、1.326、1.685,得到標準曲線y=0.035 6x-0.088 1,r2=0.998 1(圖1)。

2.3.2 IAA定性測定和定量測定 定性檢測篩選出能產(chǎn)生IAA的細菌菌株。利用紫外分光光度計法測定菌株發(fā)酵液的吸光度, 通過IAA標準曲線計算出各菌株產(chǎn)IAA含量,IAA產(chǎn)量在7 mg/L以上的有28株(表4)。

表4 產(chǎn)吲哚-3-乙酸優(yōu)勢菌株的篩選結(jié)果

2.4 煙草內(nèi)生功能細菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)學特征 供試菌株在NA平板上劃線接種,置于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3 d,大部分菌株呈現(xiàn)乳白色和白色,少部分呈現(xiàn)黃色,菌落整體上不透明,多為圓形或者近圓形。大小、表面特征和黏稠度特征存在差異。12株細菌革蘭氏染色結(jié)果表明,其中5株為陽性反應(yīng),7株為陰性反應(yīng)(表5)。菌體呈桿狀,少數(shù)為卵球形,部分產(chǎn)芽孢,呈柱形。

表5 12株內(nèi)生細菌的形態(tài)特征

2.4.2 生理生化鑒定 生理生化試驗結(jié)果表明,12株細菌多為兼性厭氧細菌, 菌株LYRY8、LYYY63-1為厭氧性菌。檸檬酸鹽利用、接觸酶、明膠液化和產(chǎn)酸反應(yīng)試驗結(jié)果呈陽性,具有一定的運動性。可以利用葡萄糖、蔗糖和甘露糖,大部分能夠利用石蕊產(chǎn)酸,菌株LYRY45利用葡萄糖時能夠產(chǎn)氣(表6)。結(jié)合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》將11株拮抗細菌鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillusspp.),菌株LYRY45鑒定為變形桿菌屬(Proteussp.)。

表6 12株內(nèi)生細菌的生理生化檢驗結(jié)果

2.4.3 12株內(nèi)生細菌16S rDNA序列分析 將測序得到的12株細菌基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(獲得登錄號分別為OP646622、OP646623、OP646624、OP646625、OP646626、OP503441、OP646627、OP646628、OP646629、OP646630、OP646631、OP646632),并將基因測序結(jié)果進行序列分析及同源性對比。結(jié)果表明,菌株LYRY8的基因序列與B.safensisEGI287 (MN704552.1)同源相似性為99.68%,菌株LYYY61-2和LYRY69-2與B.safensisS21 (MN062620.1)同源相似性為99.55%,菌株LYYY117與B.safensisEGI287 (MN704552.1)同源相似性為98.39%,菌株LYRY25與B.subtilisJX-2 (KX708699.1)同源相似性為99.28%,菌株LYLN27與B.subtilisH10-7 (FJ392727.1)同源相似性為99.37%,菌株LYRY39-1與B.subtilisUK19 (ON357947.1)同源相似性為97.53%,菌株LYYY63-1與B.subtilisB11 (KJ870191.1)同源相似性為98.50%,菌株LYYY63-3與B.subtilisHGUP332 (MK103123.1)同源相似性為97.81%,菌株LYSX73與B.subtilisSRCM102750 (CP028215.1)同源相似性為98.69%,菌株LYSX141與B.subtilisACHB-2 (KU867636.1)同源相似性為99.46%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)發(fā)現(xiàn)有4株細菌與沙福芽孢桿菌位于同一進化分支,親源關(guān)系最近;另7株細菌與枯草芽孢桿菌位于同一進化分支,親源關(guān)系最近。菌株LYRY45與ProteusmirabilisM3-1-17 (CP053681.1) 同源相似性為99.13%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)發(fā)現(xiàn)LYRY45與奇異變形桿菌位于同一進化分支。gyrB序列測定結(jié)果也與上述一致。

結(jié)合形態(tài)學鑒定、生理生化檢驗及16S rDNA序列分析,將YRY25、LYLN27、LYRY39-1、LYYY63-1、LYYY63-3、LYSX73、LYSX141菌株鑒定為枯草芽孢桿菌 (B.subtilis),LYRY8、LYYY61-2、LYRY69-2、 LYYY117菌株鑒定為沙福芽孢桿菌(B.safensis),均屬厚壁菌門,芽孢桿菌綱,芽孢桿菌目,芽孢桿菌科,芽孢桿菌屬。LYRY45菌株鑒定為奇異變形桿菌 (P.mirabilis),屬變形菌門,變形菌綱,腸桿菌目,腸桿菌科,變形桿菌屬。

2.5 功能細菌的抑菌譜測定

試驗結(jié)果證明,12株功能細菌對7種常見的煙草病原真菌均表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用,抑菌率介于0.68%～71.28%(表7),具有較好的抑菌廣譜性。對比結(jié)果發(fā)現(xiàn),12株細菌對輪枝鐮刀菌、異絲腐霉和立枯絲核菌的拮抗效果最好,抑菌率平均值高于其他病原真菌。沙福芽孢桿菌菌株LYYY61-2、LYRY8、LYYY117對立枯絲核菌的防治效果最好,抑菌率分別為71.28%、70.95%、61.15%。

表7 12株細菌對常見煙草病原真菌的抑制作用

2.6 功能細菌對煙草種子促生作用的測定

培養(yǎng)皿濾紙保濕法結(jié)果顯示(表8),浸種處理后,除菌株LYRY8、LYLN27、LYSX73未表現(xiàn)出明顯促生作用外,9株細菌的萌發(fā)率、根長均高于空白對照組。菌株LYRY45促生效果顯著,出芽率達到98%,促進根部生長37.76%,LYYY117菌株次之。

表8 12株細菌懸浮液浸種對種子萌發(fā)及生長的影響

3 討論與結(jié)論

煙草中已報道的內(nèi)生細菌資源包括芽孢桿菌屬、微桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬等[6]。陳澤斌等報道芽孢桿菌是煙草內(nèi)生菌的優(yōu)勢類群[22-23]。本研究篩選出的12株內(nèi)生細菌,有11株鑒定為芽孢桿菌屬,占比91.67%,與陳澤斌等的報道[22]相符。楊桃從煙株上分離出內(nèi)生枯草芽孢桿菌Itb57,證實該菌株對煙草疫霉抑菌效果良好,研究發(fā)現(xiàn)其抑菌活性與蛋白物質(zhì)有關(guān)[24]。馬冠華等先后報道了枯草芽孢桿菌對煙草黑脛病、煙草青枯病具有良好的防治效果[25-27]。本試驗得到的7株枯草芽孢桿菌對茄病鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、異宗腐霉、立枯絲核菌以及尖孢鐮刀菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141對煙草疫霉的平板抑制拮抗效果可達88.10%、84.55%和73.33%,形態(tài)和顏色特征與馬冠華分離鑒定的Itb57菌落較相似[25],生理生化特征略有差異,分析這與菌落培養(yǎng)環(huán)境條件不同有關(guān)。

沙福芽孢桿菌作為生防內(nèi)生細菌,目前已在核桃、槐樹、瓜果類和木豆等植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[28-31],煙草方面相關(guān)研究甚少。焦蓉等曾在煙草種子部位發(fā)現(xiàn)一株具有拮抗和促生作用的沙福芽孢桿菌菌株YN201702[32]。本研究獲得的沙福芽孢桿菌菌株LYRY8、LYYY117、LYYY61-2對煙草疫霉的室內(nèi)抑菌率分別達到67.06%、64.72%和62.10%,菌株LYYY69-2的抑菌率為69.04%,在煙草植株的莖部、葉部均有分離發(fā)現(xiàn),具備作為生防菌的良好潛力。抑菌譜試驗結(jié)果說明菌株LYRY8、LYYY61-2、LYYY117針對立枯絲核菌具有顯著的抑制效果。煙種經(jīng)菌株LYYY117發(fā)酵液處理后,萌發(fā)率達到96.67%,較空白對照組根長、莖長及總長指標均具有明顯提高。相比于室內(nèi)培養(yǎng),室外田間環(huán)境易受各種因素干擾影響,情況更加復雜多變,生防菌的作用效果尚需要結(jié)合盆栽或田間試驗進行驗證。

本研究首次于煙株體分離出奇異變形桿菌菌株LYRY45。奇異變形桿菌常作為動物體的病原菌存在[33]。試驗分離得到的菌株LYRY45相比其他11株細菌產(chǎn)IAA含量更高,在LB液體培養(yǎng)基中IAA產(chǎn)量為11.06 mg/L。種子萌發(fā)試驗的萌發(fā)率達98.00%,促進根長增長37.76%,莖長增長21.43%,總長增長33.96%,其促生效果明顯高于其他菌株處理,與IAA含量測定試驗結(jié)果一致,促進作用顯著。內(nèi)生菌促生作用的機制途徑復雜,這種產(chǎn)生植物生長素的機制在煙株體內(nèi)能否表達及對植株生長的促進作用是否穩(wěn)定仍需驗證研究。

本研究篩選得到的12株煙草內(nèi)生細菌,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、奇異變形桿菌3類,對煙草疫霉具有顯著的抑制作用及產(chǎn)IAA能力,抑菌譜廣且具備一定的促生作用,具有較好的應(yīng)用潛力。