曹正鄧淵, 文雙雅, 高志強

(湖南農業(yè)大學農學院,湖南長沙 410128)

油菜是我國第一大植物油源,每年可提供約520萬t優(yōu)質食用油。冬油菜作為越年生植物,可以使耕地在冬季能更有效地利用起來,增加土地利用效率,使農民在農閑期也有收入。葉綠素熒光參數可反映植物光合作用機理和光合生理狀況,是作物逆境脅迫研究中的重要指標,同時作為植物與環(huán)境之間的紐帶,對于研究植物光合作用與環(huán)境之間的關系具有重要意義[1]。其中,Fv/Fm表示為光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)中的最大光量子產量,對于研究作物生理變化和逆境脅迫具有重要意義[2]。胡能兵等利用Fv/Fm在不同脅迫時間和PEG濃度下的變化差異進行耐高溫脅迫育種研究[3];Poudyal等為了實現在生長發(fā)育前期對番茄的耐熱性進行監(jiān)測,通過Fv/Fm,針對高溫脅迫條件下的耐熱性,對不同基因型番茄進行篩選[4];王淦等用Fv/Fm監(jiān)測了木薯在干旱脅迫下受到的影響,結果表明,品種的抗旱性越強,Fv/Fm的下降速度越慢,并且會延后內源乙烯含量的上升時間[5]。

在不同的研究中,使用葉綠素熒光儀對熒光參數進行測定時,根據不同標準,有5、10、15、20、30 min 等[6-10]。在目前Fv/Fm監(jiān)測手段中,Fm作為光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應中心完全關閉時的熒光產量,通常需要葉片經過20 min暗適應才可測得[11],監(jiān)測速度較慢,時間成本上升。同時,可監(jiān)測葉綠素熒光參數的監(jiān)測儀器造價高昂,很多科研人員難以承擔。這2個方面的不足大大阻礙了葉綠素熒光參數Fv/Fm的研究。因此,如何在快速無損且低成本的前提下精確監(jiān)測Fv/Fm是一個亟待解決的科學問題,具有重要的現實意義。

光譜技術由于具有無損、快速、精度高等優(yōu)點,目前已被廣泛應用于各類作物生理狀態(tài)的監(jiān)測中[12-13]。例如,譚昌偉等通過分析高光譜植被指數與緊湊型玉米整個生育期的Fv/Fm相關關系,建立了相應的高光譜監(jiān)測模型,結果表明,Fv/Fm與所選的植被指數呈極顯著正相關;其中,基于相關系數最高的結構敏感色素指數(SIPI)所建立的監(jiān)測模型的決定系數(R2)達到0.812 6,均方根誤差(RMSE)達到0.082[14]。Zhang等用植被指數對不同鹽度海灘的鹽地堿蓬葉片葉綠素熒光參數的相關性進行了回歸分析,結果表明,680 nm和935 nm是葉綠素熒光最敏感的高光譜波段,其中,植被指數(R680 nm-R935 nm)/(R680 nm+R935 nm)和(R680 nm/R935 nm)具有較高的相關系數和較低的均方根誤差,進而對Fo、Fm、Fv/Fm等多種葉綠素熒光參數進行了預測[15]。由此可見,利用光譜反射來對Fv/Fm進行預測是可行的,但由于使用植被指數進行預測模型的構建時,其擬合公式固定而導致模型的精度不高,而通過機器學習進行預測模型的構建是提升模型精度的一個重要途徑。

基于此,本試驗采集甘藍型油菜薹期葉片的光譜和葉綠素熒光參數Fv/Fm,分別使用Savitzky-Golay卷積平滑(SG)、標準正態(tài)變換(SNV)和多元散射校正(MSC)組成3種方法對原始光譜進行預處理,然后通過競爭性自適應重加權算法(CARS)挑選特征波段,進而建立并對比偏最小二乘回歸(PLSR)、支持向量回歸(SVR)和徑向基神經網絡(RBFNN)3種預測模型的精度,甄選出精度最高的建模方法,從而為高光譜快速無損監(jiān)測Fv/Fm提供技術支撐以及為實時監(jiān)測油菜生理狀況提供方法路線。

1 材料與方法

1.1 試驗設置及供試材料

試驗全程均在面積為20 hm2的湖南農業(yè)大學瀏陽教學科研綜合平臺基地(28°30′N,113°84′E)進行,試驗時間為2021年9月至2022年5月。供試材料為湘雜油787,為湖南農業(yè)大學農學院油菜育種團隊選育的甘藍型中熟雜交油菜品種,是湖南省主推的種植品種。播種時間為2021年9月29日,收獲時間為2022年5月6日。播種方式采用直播,播種時統(tǒng)一施用復合肥(氮磷鉀有效營養(yǎng)配比為 18 ∶ 12 ∶ 10),主區(qū)因素P為播種量,設3個水平,分別為高密(P1:4.608 kg/hm2)、中密(P2:3.456 kg/hm2)和低密(P3:2.304 kg/hm2);裂區(qū)因素B為施肥量,設3個水平,依次為低肥(B1:300 kg/hm2)、中肥(B2:600 kg/hm2)和高肥(B3:900 kg/hm2)。一共設置9個處理,進行4次重復,共計36個小區(qū),各小區(qū)的面積為258 m2(86 m×3 m),每小區(qū)施硼砂16.5 kg/hm2。

1.2 數據采集

本研究在2022年2月26日對油菜葉片葉綠素熒光參數、葉片反射率數據進行采集。在樣本小區(qū)中心位置各選取3株具有代表性的冬油菜植株,選取1張完全展開的綠色葉片,分別測量其光譜反射率和葉綠素熒光參數。用美國ASD-FieldSpec 3地物波譜儀完成葉片光譜反射率的采集,選用的光譜范圍為350～2 500 nm,光譜分辨率為3nm @ 350～1 000 nm、10 nm @ 1 000～2 500 nm。首次使用需預熱15 min,測試每個樣品前都進行白板定標。每個樣品重復測量5次,將5次數據進行平均后得出的平均反射率作為該樣品的實際光譜反射率。一共采集540條原始光譜數據,平均后得到108條實際光譜反射率。

葉綠素熒光參數的收集采用捷克PSI-FluorPen-FP110手持式葉綠素熒光儀。每張葉提前進行20 min暗適應,儀器夾在葉片上進行測量,要確保地物波譜儀和葉綠素熒光儀所測量的為同一葉片位置,且葉綠素熒光參數與葉片光譜反射率的獲取時間間隔不超過10 min;然后使用FlourPen導出所測得的初始熒光Fo和最大熒光產量Fm參數值,進而通過計算得到108條Fv/Fm。Fv/Fm的數學公式如下:

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm。

(1)

1.3 數據分析方法

由于高光譜數據存在嚴重的共線性和冗余干擾信息,因而需要在全波段的基礎上進行光譜預處理和特征波段提取[16-17]。本試驗所有計算均通過Matlab 2018a編輯代碼完成,繪圖均使用Origin 2021。使用SG平滑進行第1次預處理。SG平滑是在移動平滑的基礎上進行改進,其原理為:假設存在一個擬合點xk,在xk的左右兩側各自選取m個數據點,將選取的2m+1個數據點進行多項式擬合,當數據點的實際值與擬合值差值的平方和最小時完成擬合,完成后將xk進行平移,重復相同的計算,使整條曲線最終趨于平滑[18-20]。然而在葉片光譜的采集過程中,由于所采集葉片上顆粒不同或者光的散射水平不同,導致所采集光譜信息中出現大量冗余甚至錯誤的信息,因此需要對原始光譜信息進行散射校正。MSC通過計算得出的平均光譜作為“理想光譜”,通過一元線性回歸,將原始光譜向著“理想光譜”平移、靠攏,從而提升光譜信息的準確性。而SNV則是對每條光譜曲線完成標準正態(tài)化,從而修正散射帶來的誤差。SNV與MSC主要是算法上的差異,而二者共同的優(yōu)勢都是不會改變光譜曲線的趨勢即樣品對光譜的吸收信息,保存了原始信息的完整性。本研究分別使用SG平滑、SNV和MSC進行光譜的預處理,使用競爭自適應重加權采樣法(CARS)對波段中的特征波長進行提取,該算法是將蒙特卡洛采樣與PLSR模型回歸系數相結合的特征變量篩選方法。篩選特征波長后通過Kennard-Stone(KS)算法劃分訓練集和測試集,通過PLSR、SVR和RBFNN 3種不同算法進行模型構建,采用R2、RMSE和相對分析誤差(RPD)3個參數對模型精度進行評估。R2的取值范圍為0～1,數值越接近1且RMSE越小,說明預測模型的精度越高。而RPD通過判斷預測值與實測值之間的偏離情況,對模型的預測能力進行說明,若RPD≤1.5,模型無法對樣本進行預測;若1.5

(2)

(3)

(4)

2 結果與分析

2.1 Fv/Fm與原始光譜曲線分析

本試驗的108條Fv/Fm數據經過整理后的結果如表1所示。以0.05為差值,將Fv/Fm分為 0.65≤Fv/Fm<0.7、0.7≤Fv/Fm<0.75、0.75≤Fv/Fm<0.80、0.80≤Fv/Fm<0.85這4個區(qū)間,并挑選出每個區(qū)間所對應的原始光譜數據計算該區(qū)間平均光譜曲線,結果如圖1所示。由圖1可知,4個區(qū)間的原始光譜曲線趨勢基本一致,皆在550 nm附近出現反射峰,在680 nm附近出現吸收谷,但在 580～680 nm附近,4條曲線出現一定程度的差異,反映了Fv/Fm越高、光譜反射率越低的規(guī)律。這可能主要是葉綠素熒光光譜范圍為640～800 nm的葉綠素熒光參數更為敏感[23];同時,由于Fv/Fm與相同環(huán)境下光合速率存在正相關關系[24],Fv/Fm值高的樣本,對光能的吸收率越大,對太陽輻射的反射越少,從而導致在葉綠素吸收波范圍內原始光譜曲線反射率相比Fv/Fm值低的樣本更低。

表1 光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學產量Fv/Fm

2.2 光譜預處理及基于CARS算法的特征波段篩選

本試驗在SG平滑的基礎上各使用SNV和MSC進行散射校正,即使用SG、SG-SNV和SG-MSC 3種預處理方法對獲取的原始光譜數據進行預處理,3種預處理方法中SG的多項式階數均設置為2,平滑窗口大小設置為11,結果如圖2所示。圖2-c和圖2-d相比圖2-a對光譜曲線的散射差異有明顯優(yōu)化,同一波段下不同樣本的反射率差異變小。由于SG僅完成對譜線的平滑,因此相對于原始光譜無明顯變化。

在完成對原始數據的平滑和散射校正后,使用CARS對處理后的3組光譜進行特征波段的選取,CARS中主成分數設置為25,交互驗證次數為5,篩選波長數為50。由圖3可知,SG、SG-SNV、SG-MSC 3種預處理方法分別在400～1 000 nm范圍內篩選出10、24、20個特征波段。圖3-a中,10個特征點均在可見光范圍(400～780 nm)內,且主要集中在400～450 nm。圖3-b中,特征點主要集中在400～450 nm和550～650 nm,在該范圍內存在多個影響植物光合作用的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等光合色素的吸收峰[25]。圖3-c中,特征點主要集中在400～500 nm和950～1 000 nm,有1個特征點位于747 nm處,而葉綠素熒光光譜在 690 nm 和740 nm附近存在2個波峰[23]。

2.3 模型的構建與分析

將上述3種預處理方法通過CARS算法篩選出的10、24、20個特征點分別作為自變量x輸入,使用PLSR、SVR和RBFNN構建Fv/Fm預測模型,結果如表2所示。

表2 不同算法下的模型結果

由表2可知,在3種預處理方法下,SG-SNV和SG-MSC相較于SG,模型精度有較大提升;在SG-SNV和SG-MSC中,SVR和RBFNN 2種基于機器學習構建的模型,從精度上相比于PLSR也有較大提升,這主要是因為機器學習的非線性擬合能力相對更強[26]。其中,RBFNN的建模精度略大于SVR,效果最優(yōu)為SG-SNV中的RBFNN,訓練集R2為0.928 8,RMSE為0.008 8;測試集R2為0.907 2,RMSE為0.011 5,RPD為3.417 6,模型對樣本的預測能力極好。將該模型得出真實值與預測值進行擬合,結果如圖4所示。由此表明,本試驗所使用的預處理方法可以有效去除光譜數據中的噪聲,且利用RBFNN模型對Fv/Fm有較好的預測效果。

3 討論與結論

本研究結果表明,基于機器學習所構建的模型相比PLSR模型有顯著效果。在李斌等的研究中,以SNV-CARS-SPA-SVR建立的Fv/Fm預測模型精度最高,其測試集R2為0.911 7,RMSE為0.010 8[27],也證明了機器學習能有效提高模型對Fv/Fm的預測能力。

RBFNN作為機器學習算法中的一種,是一種性能優(yōu)良的前饋性神經網絡,具備優(yōu)秀的自學能力,對非線性問題有較強的映射能力,在農業(yè)領域獲得廣泛應用。劉占宇等用主成分分析將一階微分光譜壓縮,把得到的主分量光譜輸入RBFNN,對病害嚴重度進行預測,得出的RMSE為7.73%,結果證明可以對胡麻斑病導致的水稻病害程度進行快速準確的預測[28]。馮旭萍等在鑒定CRISPR/Cas9誘導水稻突變體的研究中,通過二階導數對特征波長進行提取,輸入RBFNN模型,其建模集和驗證集的分別達到了92.25%和89.5%,表明使用高光譜成像技術結合化學計量學方法,鑒別水稻CRISPR/Cas9突變體是可行的,為快速準確地鑒定水稻育種中大量突變體提供了理論基礎[29]。

本研究基于高光譜技術,僅對薹期甘藍型油菜葉片Fv/Fm進行預測,在后續(xù)的試驗中應對油菜全生育期進行預測并對比,篩選出用于Fv/Fm預測的最佳時期。張永江等報道玉米同一葉片中不同部位Fm、Fv/Fm的參數值有顯著差異[30]。因此,甘藍型油菜葉片不同位置Fv/Fm差異性,應加入到未來的研究方向中。同時模型的普適性還需要進行驗證,需進一步完成對模型的優(yōu)化,探索可用于Fv/Fm預測的最佳模型,為甘藍型油菜實時監(jiān)測提供更有力的技術。

本研究以甘藍型油菜薹期植株作為材料,采集葉片光譜與對應的葉片Fv/Fm,通過SG、SG-SNV和SG-MSC 3種方法完成對原始光譜的預處理,結果表明,SG-SNV和SG-MSC 2種方法對原始光譜曲線有明顯優(yōu)化。運用CARS算法完成特征波長的選取,基于3種預處理方法,分別篩選出10、24、20個特征點,進而將所篩選的特征波長作為自變量x,輸入完成PLSR、SVR和RBFNN 3種預測模型的構建。本研究結果表明,在上述3種構建的模型中,SG-SNV-RBFNN的精度最高,該方式下建立的預測模型訓練集R2為0.928 8,RMSE為0.008 8,測試集R2為0.907 2,RMSE為0.011 5,RPD為3.417 6。