程鈺潔，邱彩月，洪婉敏，盧彭信，汪凱東，徐 杰，張志鵬

車前子及其炮制品色度值、UPLC指紋圖譜及體外抗氧化活性的差異研究

程鈺潔，邱彩月，洪婉敏，盧彭信，汪凱東，徐 杰，張志鵬*

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

分析車前子及其不同炮制品的指紋圖譜、色度值及抗氧化活性的差異，探討其化學(xué)成分與抗氧化作用的譜效關(guān)系。采用分光測(cè)色儀測(cè)定色度值，采用UPLC法建立車前子及其不同炮制品指紋圖譜，采用ABTS法測(cè)定抗氧化活性，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、方差分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)方法分析車前子及其炮制品的差異；運(yùn)用偏最小二乘回歸法（partial least squares regression method，PLSR）和灰色關(guān)聯(lián)度分析法（grey relation analysis，GRA）分析車前子及其不同炮制品化學(xué)成分與抗氧化活性的譜效關(guān)系。建立的車前子UPLC指紋圖譜標(biāo)定了19個(gè)共有峰，炒車前子和鹽車前子標(biāo)定了27個(gè)共有峰，合計(jì)標(biāo)定了34個(gè)色譜峰，并對(duì)其中13個(gè)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)。多元統(tǒng)計(jì)分析表明，車前子與不同炮制品間存在顯著差異，PCA與HCA可將車前子生品與炮制品分為2類，OPLS-DA篩選出10個(gè)差異性標(biāo)志成分。車前子炮制前后的粉末色度值Δ*＞6，可被肉眼識(shí)別，但不同炮制品間粉末顏色差異不明顯?？寡趸钚越Y(jié)果表明，車前子炮制后抗氧化作用增強(qiáng)，不同炮制品間差異不大。相關(guān)性分析表明，共有峰的峰面積值對(duì)色度值有一定影響，對(duì)*值的影響較小，對(duì)*值、*值影響較大；PLSR與GRA分析表明，有11個(gè)共有峰表征的化學(xué)成分與車前子及其炮制品的抗氧化活性關(guān)聯(lián)較大，其中包括原兒茶酸、木通苯乙醇苷B與野漆樹苷。建立的UPLC指紋圖譜及色度值、抗氧化活性的測(cè)定方法，可用于車前子及其不同炮制品的鑒別及質(zhì)量分析，指紋圖譜-體外抗氧化活性的譜效關(guān)系研究，可為車前子炮制機(jī)制的研究提供參考。

車前子；炮制；UPLC；指紋圖譜；色度值；抗氧化活性；譜效關(guān)系；ABTS法；主成分分析；層次聚類分析；正交偏最小二乘-判別分析；灰色關(guān)聯(lián)度分析法；異毛蕊花糖苷；車前草苷D；野漆樹苷；京尼平苷酸

車前子是車前科車前屬植物車前L.或平車前Willd.的干燥成熟種子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰的功效，臨床用于治療熱淋澀痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽[1]。車前子包含的主要化學(xué)成分有多糖、黃酮類、苯乙醇苷類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類、三萜類等[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，車前子具有利尿、抗氧化、降尿酸、降血糖、調(diào)血脂、降血壓及抗肝損傷等多種作用，臨床應(yīng)用十分廣泛，可用于濕熱引起的諸多疾病，如肝炎、腎病、便秘、高尿酸血癥、高血壓等病癥的治療[4-9]。

車前子的現(xiàn)代炮制方法主要有凈制、炒制和鹽制[10]。車前子生品性微寒，長(zhǎng)于利尿通淋，炮制后寒性減弱，其中炒車前子善于祛痰止咳，鹽車前子善于滲濕止瀉。中藥發(fā)揮藥效作用的基礎(chǔ)是多種有效成分的合理、有機(jī)的組合，其模式是多途徑作用于機(jī)體內(nèi)與疾病相關(guān)的多靶點(diǎn)，發(fā)揮對(duì)機(jī)體的整體調(diào)節(jié)作用[11]。因此，車前子生品與炮制品的功效不同，可理解為內(nèi)在化學(xué)成分存在差異。目前，關(guān)于車前子及其炮制品的研究，多集中于炮制工藝及京尼平苷酸、毛蕊花糖苷等成分的含量測(cè)定上，多以單個(gè)或多個(gè)指標(biāo)分析車前子炮制前后的差異，不足以作為全面地反映車前子炮制前后差異的主要變量指標(biāo)[10]。

顏色性狀作為中藥飲片質(zhì)量的外在體現(xiàn)，是中藥鑒別與質(zhì)量評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，采用色度值量化飲片粉末顏色，在中藥炮制領(lǐng)域已有較為廣泛的應(yīng)用[12-14]。因此，本研究擬通過(guò)UPLC法建立車前子及其不同炮制品的UPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)模式識(shí)別對(duì)三者化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)的分析；通過(guò)采集飲片粉末的色度值，分析車前子炮制前后飲片粉末的顏色變化；同時(shí)測(cè)定車前子及其不同炮制品的體外抗氧化活性，進(jìn)一步分析車前子及其炮制品的藥效差異；利用偏最小二乘回歸法（partial least squares regression method，PLSR）及灰色關(guān)聯(lián)度法（grey relation analysis，GRA）分析UPLC指紋圖譜共有峰與抗氧化活性的譜-效關(guān)系，以期為車前子的炮制機(jī)制研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity型超高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)沃特世公司；Thermo ICAPQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)賽默飛公司；ME204E型萬(wàn)分之一天平、XP26型百萬(wàn)分之一天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)，浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；H22-X3型電陶爐，杭州九陽(yáng)生活電器有限公司；TS7700型分光測(cè)色儀，深圳市三恩時(shí)科技有限公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Milli-QDirect超純水系統(tǒng)，默克股份有限公司。

1.2 材料

對(duì)照品京尼平苷酸（批號(hào)11828-201805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%）、阿魏酸（批號(hào)110773-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、大車前苷（批號(hào)111914-202105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.0%）、木犀草苷（批號(hào)111720-202111，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.6%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）、木犀草素（批號(hào)111520-202006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.4%）、芹菜素（批號(hào)111901-202004，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、原兒茶酸（批號(hào)110809-201906，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.7%）、野漆樹苷（批號(hào)111919-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.5%）、木通苯乙醇苷B（批號(hào)111910- 201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品異毛蕊花糖苷，批號(hào)FF17B039，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，成都普思生物科技有限公司；對(duì)照品車前草苷D，批號(hào)CFS202101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，Chem Faces公司；對(duì)照品芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷，批號(hào)21062901，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.29%，成都普菲德生物科技有限公司。色譜級(jí)甲醇、乙腈，德國(guó)默克股份有限公司；色譜純磷酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水，取自實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水系統(tǒng)，其余試劑均為分析純；ABTS自由基清除能力檢測(cè)試劑盒，蘇州格銳思生物科技有限公司。

12批車前子藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為車前科車前屬植物車前L.的干燥成熟種子，12批炒車前子和12批鹽車前子為廣東一方制藥有限公司實(shí)驗(yàn)室自制，按照《廣東省中藥飲片炮制規(guī)范》第一冊(cè)[15]炒車前子炮制項(xiàng)下規(guī)定，取凈車前子炒至略有爆聲并有香氣溢出時(shí)，取出攤涼，得到炒車前子，按照《中國(guó)藥典》2020年版一部[1]鹽車前子炮制項(xiàng)下規(guī)定，取凈車前子照鹽水炙法（通則0213）炒至起爆裂聲時(shí)，噴灑鹽水，炒干，取出攤涼，得到鹽車前子。具體樣品信息見(jiàn)表1及圖1。

表1 樣品來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 車前子及其不同炮制品色度值測(cè)定與分析

采用分光測(cè)色儀對(duì)車前子及其不同炮制品飲片粉末進(jìn)行色度值測(cè)定。取12批車前子、炒車前子、鹽車前子飲片粉末（過(guò)三號(hào)篩）適量，均勻平鋪于玻片上，壓制厚度約1 mm，采用國(guó)際照明委員會(huì)認(rèn)可的D65光源，以白色作為背景，測(cè)定孔徑8 mm，視角選擇2度，經(jīng)白板校正后，采集飲片粉末色彩圖像，并測(cè)定色度值，平行3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖2及表2。

Lab色彩模式中，L值為明度指數(shù)，*、*為色度指數(shù)，其中*為紅綠軸，*為黃藍(lán)軸，樣品粉末顏色用總色度值（*）表示，公式為*＝(*2＋*2＋*2)1/2。Δ*C-S＝*C－*S、Δ*Y-S＝*Y－*S、Δ*Y-C＝*Y－*C、Δ*C-S＝*C－*S、Δ*Y-S＝*Y－*S、Δ*Y-C＝*Y－*C、Δ*C-S＝*C－*S、Δ*Y-S＝*Y－*S、Δ*Y-C＝*Y－*C、色差Δ*C-S＝(Δ*C-S2＋Δ*C-S2＋Δ*C-S2)1/2、Δ*Y-S＝(Δ*Y-S2＋Δ*Y-S2＋Δ*Y-S2)1/2、Δ*Y-C＝(Δ*Y-C2＋Δ*Y-C2＋Δ*Y-C2)1/2，用于表達(dá)生品及不同炮制品在明度、紅綠、黃藍(lán)、總體的顏色變化情況，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

當(dāng)Δ*為6～12時(shí)，其色差可被肉眼識(shí)別，當(dāng)Δ*＞12時(shí)，色差顯著[16]。由表3可知，12批車前子與其2種炮制品的色差值均＞6.0，即同批次藥材中可明顯區(qū)分生品與炮制品，但炒車前子和鹽車前子2種炮制品之間色差值較小，難以用肉眼區(qū)分。此外，車前子與炒車前子的Δ*為?14.12～?2.52，均值為?9.54，車前子與鹽車前子的Δ*為?15.06～?4.90，均值為?10.87，表明車前子炮制后明度下降，顏色加深；車前子與炒車前子的Δ*為3.97～5.47，均值為4.88，車前子與鹽車前子的Δ*為4.48～5.78，均值為5.26，表明車前子炮制后紅色加深；車前子與炒車前子、鹽車前子Δ*正負(fù)均有且數(shù)值不大，表明車前子炮制前后在黃藍(lán)軸上顏色變化不大。

圖1 車前子、炒車前子及鹽車前子樣品圖

圖2 12批車前子(S)、炒車前子(C)及鹽車前子(Y)樣品粉末色彩圖像

2.2 車前子及其不同炮制品指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 采用Waters Acquity UPLC HSS T3column（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，10%乙腈；5～15 min，16%～18%乙腈；15～20 min，18%～25%乙腈；20～25 min，25%～45%乙腈；25～30 min，45%～60%乙腈；30～40 min，60%～70%乙腈；40～41 min，70%～10%乙腈；41～50 min，10%乙腈；程序檢測(cè)波長(zhǎng)：0～10.5 min，245 nm；10.5～35.5 min，330 nm；35.5～50 min，245 nm；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

表2 色度值結(jié)果

表3 色度值變化結(jié)果

2.2.2 質(zhì)譜條件 氮?dú)庾鳛橘|(zhì)譜離子源的霧化、錐孔氣；質(zhì)譜采用HESI離子源，離子源參數(shù)為鞘氣流速35 arb；輔助氣流速10 arb；噴霧電壓3.2 kV；射頻電壓50 V；輔助器加熱溫度350 ℃；毛細(xì)管加熱溫度350 ℃。質(zhì)譜掃描參數(shù)為正、負(fù)離子掃描模式；掃描范圍為/150～2000；一級(jí)掃描分辨率為70 000 FWHM；二級(jí)掃描分辨率為17 500 FWHM；二級(jí)碰撞能量為40 eV。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取京尼平苷酸、原兒茶酸、阿魏酸、大車前苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、車前草苷D、異毛蕊花糖苷、野漆樹苷、芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為53.072 1、84.217 4、86.179 8、40.512 0、42.117 6、158.888 8、69.034 6、44.590 0、57.232 0、49.182 5、48.555 3、38.043 2、62.622 0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 取飲片粉末（過(guò)二號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理（250 W、40 kHz）60 min，離心，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水使溶解，用醋酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并醋酸乙酯，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?0 mL量瓶，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取車前子（S04）供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以17號(hào)毛蕊花糖苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.06%～0.96%，相對(duì)峰面積的RSD為0.09%～2.89%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取車前子（S04）供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在制備后0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以17號(hào)毛蕊花糖苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.08%～1.20%，相對(duì)峰面積RSD為0.31%～2.53%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取車前子樣品（S04），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以17號(hào)毛蕊花糖苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.05%～1.07%，相對(duì)峰面積RSD為0.13%～2.52%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 指紋圖譜的建立及色譜峰的指認(rèn) 取12批車前子、炒車前子及鹽車前子樣品，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，采集色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立指紋圖譜，分別以S01、C01和Y01號(hào)圖譜作為參照?qǐng)D譜，以“中位數(shù)”法作為對(duì)照?qǐng)D譜生成方式，分別生成12批車前子、炒車前子及鹽車前子的對(duì)照指紋圖譜。12批車前子共標(biāo)定了19個(gè)共有峰，12批炒車前子和鹽車前子均共標(biāo)定了27個(gè)共有峰，結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)質(zhì)譜精確相對(duì)分子質(zhì)量、碎片離子對(duì)比分析，再與對(duì)照品保留時(shí)間及紫外吸收光譜比對(duì)，指認(rèn)出其中13個(gè)主要成分，指認(rèn)結(jié)果見(jiàn)圖4及表4。

2.2.9 相似度評(píng)價(jià) 分別以車前子、炒車前子及鹽車前子的對(duì)照指紋圖譜為參照，計(jì)算12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）指紋圖譜的相似度，結(jié)果分別為0.998、0.998、1.000、0.997、0.999、0.999、0.999、0.972、0.999、0.999、1.000、0.999，0.950、0.955、0.999、0.914、0.999、0.999、0.996、0.991、0.939、0.997、0.998、0.995，0.981、0.965、0.995、0.941、0.959、0.976、0.984、0.984、0.995、0.982、0.987、0.984。結(jié)果顯示，12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）的相似度均大于0.9，說(shuō)明不同批次的車前子樣品批間差異較小，且炮制后的樣品批間質(zhì)量也較穩(wěn)定。分別把車前子、炒車前子及鹽車前子生成的對(duì)照指紋圖譜導(dǎo)入軟件，車前子與炒車前子的相似度值為0.388，車前子與鹽車前子的相似度值為0.358，炒車前子與鹽車前子的相似度值為0.997，說(shuō)明車前子生品與炮制品之間的化學(xué)成分差異性較大，而不同炮制品之間差異較小。

2.3 車前子及其不同炮制品UPLC指紋圖譜多元統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 單因素方差分析 將車前子及其不同炮制品的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計(jì)）導(dǎo)入SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，車前子經(jīng)炮制后，色譜峰的變化較為明顯。其中，相比于生品，車前子炮制品UPLC指紋圖譜中新增了13個(gè)色譜峰，分別為峰1～3、6～12、18、20、28，缺失了4個(gè)峰，分別為峰14、16、23、31。此外，除峰25外，車前子炮制品各色譜峰的峰面積與車前子生品間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；炒車前子與鹽車前子中峰6、8、12、15、17（毛蕊花糖苷）、19（車前草苷D）、21（異毛蕊花糖苷）、22（野漆樹苷）、24、26、27、33的峰面積差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。

2.3.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計(jì)）導(dǎo)入SIMCA 14.1，進(jìn)行PCA。以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，共提取了3個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為93.2%，提示模型預(yù)測(cè)良好，可反映出12批車前子、炒車前子及鹽車前子整體的信息，各主成分貢獻(xiàn)率見(jiàn)表6。

由前3個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，得到的車前子、炒車前子及鹽車前子的PCA得分圖如圖5所示。結(jié)果顯示，車前子生品與炮制品可明顯分為2組，但炒車前子和鹽車前子的部分樣品相互重疊，無(wú)法較好地區(qū)分。

圖3 12批車前子(S01～S12)、炒車前子(C01～C12)、鹽車前子(Y01～Y12)的UPLC指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜(SR, CR, YR)

4-京尼平苷酸 5-原兒茶酸 13-阿魏酸 14-大車前苷 16-木犀草苷 17-毛蕊花糖苷 18-木通苯乙醇苷B 19-車前草苷D 21-異毛蕊花糖苷 22-野漆樹苷 23-芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷 28-木犀草素 29-芹菜素

2.3.3 層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 將12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計(jì)）導(dǎo)入SPSS 26.0，采用組間連接法，以平方歐氏距離為分類依據(jù)，進(jìn)行HCA。結(jié)果如見(jiàn)圖6所示，當(dāng)聚類距離為5時(shí)，車前子生品與炮制品可明顯分為2類，但炒車前子和鹽車前子無(wú)法較好地聚類，其中C09單獨(dú)聚為一類，其余批次的炒車前子和鹽車前子聚為一類，表明炒車前子和鹽車前子樣品相似度較高，與PCA結(jié)果基本一致。

2.3.4 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 為篩選車前子、炒車前子及鹽車前子成分差異的主要標(biāo)志性成分，將12批車前子（S01～S12）、炒車前子（C01～C12）及鹽車前子（Y01～Y12）的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計(jì)）導(dǎo)入SIMCA 14.1，進(jìn)行OPLS-DA。對(duì)各指標(biāo)的變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值進(jìn)行大小排列，選擇VIP值＞1的指標(biāo)作為區(qū)分車前子、炒車前子及鹽車前子的主要差異性成分。

建立的車前子、炒車前子及鹽車前子的OPLS- DA模型中，自變量累積解釋能力參數(shù)R2為0.985，因變量累積解釋能力參數(shù)R2為0.938，預(yù)測(cè)能力參數(shù)2為0.807，均大于0.5，說(shuō)明所建模型具有較強(qiáng)的解釋率和預(yù)測(cè)率，得到的OPLS-DA得分圖見(jiàn)圖7，VIP值見(jiàn)圖8。由圖7可知，車前子、炒車前子及鹽車前子呈現(xiàn)明顯的分類聚集現(xiàn)象。由圖8可知，以VIP值＞1為標(biāo)準(zhǔn)共提取10個(gè)VIP值，重要程度排名依次為峰21（異毛蕊花糖苷）、24、19（車前草苷D）、26、22（野漆樹苷）、8、4（京尼平苷酸）、27、7、15，以上成分可能是車前子、炒車前子與鹽車前子的差異性標(biāo)志物。

表5 指紋圖譜峰面積單因素方差分析結(jié)果

與車前子比較：*＜0.05；與炒車前子比較：#＜0.05

*< 0.05PS;#< 0.05fPS

表6 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖5 12批車前子及炮制品PCA得分圖

圖6 12批車前子及炮制品HCA圖

2.4 車前子及其不同炮制品體外抗氧化活性測(cè)定與分析

2.4.1 測(cè)定方法 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究將供試品溶液的質(zhì)量濃度稀釋成60 μg/mL，按照格銳思試劑盒的規(guī)定方法進(jìn)行測(cè)定。

（1）試劑溶液的配制：①試劑1：臨用前甩幾下使粉劑落入底部，每支加0.49 mL蒸餾水溶解。②試劑2：臨用前甩幾下使粉劑落入底部，每支加2.86 mL蒸餾水，充分溶解，備用。③ABTS工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑1-試劑2（1∶1）比例混合，避光反應(yīng)12 h后（2 d內(nèi)用完），再用無(wú)水乙醇稀釋20～30倍備用。

圖7 12批車前子及炮制品OPLS-DA圖

將上述溶液按照表7設(shè)計(jì)充分混勻后避光靜置6 min，轉(zhuǎn)移至玻璃比色皿（光徑1 cm）中，于734nm處讀取吸光度（）值，分別記為空白、對(duì)照和測(cè)定，并計(jì)算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率＝1－(測(cè)定－對(duì)照)/空白

2.4.2 測(cè)定結(jié)果 12批車前子、炒車前子及鹽車前子的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8?？梢?jiàn)，12批車前子及其炮制品均具有清除ABTS自由基的能力，其中炒車前子最強(qiáng)，鹽車前子與炒車前子差異不大，車前子生品清除能力最弱。

2.5 表-里關(guān)聯(lián)分析

將車前子及其不同炮制品的色度值與峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計(jì)）導(dǎo)入SPSS 26.0進(jìn)行皮爾遜（Pearson）相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表9。結(jié)果表明，除峰21、24、25外，各共有峰峰面積均與*值、*值及*值呈極顯著相關(guān)（＜0.01）；其中峰13、14、16、17、19、22、23、26、27、30～34與*值和*值均呈極顯著正相關(guān)，其余峰與*值和*值呈極顯著負(fù)相關(guān)；峰1～12、15、18、20、24、28、29與*值呈極顯著正相關(guān)，其余峰與*值呈極顯著負(fù)相關(guān)；峰19、21、22、25、26與*值呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），峰24與*值呈極顯著正相關(guān)（＜0.05），峰5、9、10與*值呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），峰1、2、11與*值呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。總體而言，各共有峰的峰面積值對(duì)色度值均有一定影響，對(duì)*值的影響較小，對(duì)*值、*值影響較大。

圖8 12批車前子及炮制品VIP得分圖

表7 ABTS反應(yīng)體系

表8 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.6 譜-效關(guān)系分析

2.6.1 偏最小二乘回歸法（partial least squares regression method，PLSR）分析[17-18]參考文獻(xiàn)方法，利用SIMCA 14.1軟件，以12批車前子、炒車前子及鹽車前子的ABTS清除率為因變量，共有峰的峰面積經(jīng)折算扣除水分后為自變量（部分缺失色譜峰峰面積以0計(jì)），采用PLSR進(jìn)行相關(guān)性分析，建立的回歸方程為＝0.0591＋0.0952＋0.0013－0.0164＋0.0485＋0.0586＋0.0307＋0.0908－0.0369－0.00710＋0.07511＋0.06612－0.09513＋0.00814＋0.06115＋0.08416－0.00817＋0.04718－0.11219＋0.00720－0.05121＋0.00522＋0.01323＋0.08024＋0.13125－0.06026－0.01827－0.16428－0.06629－0.05230－0.05531－0.09232－0.11433－0.11434＋40 761，得到的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)見(jiàn)圖9。其中，峰1～3、5～8、11、12、14～16、18、20、22～26的回歸系數(shù)大于0，表明其與抗氧化活性呈正相關(guān)，其余峰的回歸系數(shù)為負(fù)值，與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)。

2.6.2 灰色關(guān)聯(lián)度（grey correlation degree，GRA）分析[19-21]將車前子、炒車前子及鹽車前子共有峰的峰面積（部分缺失色譜峰峰面積以0計(jì)）和抗氧化活性數(shù)據(jù)進(jìn)行均值化處理。將處理后的抗氧化活性數(shù)據(jù)設(shè)置為母序列0（），峰面積數(shù)據(jù)為子序列x（）（為峰號(hào)），根據(jù)公式（1）計(jì)算母序列與子序列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)。其中為分辨系數(shù)，越小，則分辨力越大，一般的取值區(qū)間為[0，1]，當(dāng)≤0.546 3時(shí)，分辨力最好，通常取＝0.5。根據(jù)公式（2）計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)的算術(shù)平均值，即為關(guān)聯(lián)度，結(jié)果見(jiàn)表10。

當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.8，則表示母序列與子序列關(guān)聯(lián)度較大；當(dāng)關(guān)聯(lián)度介于0.6～0.8，則表示二者關(guān)聯(lián)度一般；當(dāng)關(guān)聯(lián)度小于0.6，則表示二者關(guān)聯(lián)度較小。由表10可知，峰1～12、15、18～22、24～26、28、29、34與抗氧化活性貢獻(xiàn)作用關(guān)聯(lián)度較大。與PLSR結(jié)果結(jié)合分析，可綜合得出峰1～3、5～8、11、12、15、18、20、22、24～26是與車前子及其炮制品的抗氧化活性關(guān)聯(lián)度較大的正相關(guān)色譜峰，即為主要起抗氧化作用的成分，其中峰5為原兒茶酸、峰18為木通苯乙醇苷B、峰22為野漆樹苷，其余色譜峰所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)成分還有待進(jìn)一步探索研究。

表9 色度值與化學(xué)成分(色譜峰)相關(guān)性分析

*＜0.05**＜0.01

圖9 PLSR標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖

表10 關(guān)聯(lián)度結(jié)果

3 討論

3.1 提取和分析條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別考察了提取方式（回流、超聲）、提取溶劑（60%、80%、100%甲醇）、提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）、溶劑用量（25、50 mL）對(duì)特征圖譜色譜峰的峰型及峰面積的影響，結(jié)果顯示車前子樣品前處理時(shí)加入甲醇25 mL超聲1.0 h效果整體較佳。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用PDA檢測(cè)器對(duì)車前子及其炮制品中的色譜峰進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)京尼平苷酸在238 nm下有最大紫外吸收，原兒茶酸在259 nm有最大紫外吸收，毛蕊花糖苷及的最佳紫外吸收為330 nm，異毛蕊花糖苷、木犀草苷、野漆樹苷、芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷、芹菜素、木犀草素的最大紫外吸收也在330 nm附近；且0～10.5 min和35.5～50 min時(shí)，色譜峰在245 nm下較豐富，紫外吸收較強(qiáng)；10.5～35.5 min時(shí)，色譜峰在330 nm下較豐富，紫外吸收較強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)最終采用切換波長(zhǎng)的方式對(duì)車前子及其不同炮制品的UPLC指紋圖譜進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 生品與不同炮制品比較

本研究建立了車前子及其不同炮制品的UPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了34個(gè)共有峰，其中車前子有19個(gè)，炒車前子和鹽車前子有27個(gè)。共指認(rèn)出其中13個(gè)主要成分，其中車前子指認(rèn)了10個(gè)，炒車前子和鹽車前子指認(rèn)了10個(gè)。車前子炮制前后色譜峰變化明顯，新增了13個(gè)峰，包括原兒茶酸、木通苯乙醇苷B和木犀草素；減少了4個(gè)峰，包括大車前苷、木犀草苷和芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷，上述色譜峰可作為車前子生品與炮制品的專屬性鑒別峰。同時(shí)，峰8、15僅在部分批次車前子生品中檢出，但在車前子炮制品指紋圖譜中均有呈現(xiàn)，且峰面積遠(yuǎn)高于生品（＜0.05），說(shuō)明峰8、15所表征的化合物亦為受熱后新增的成分，生品中檢出的原因可能為產(chǎn)地干燥過(guò)程中，受熱程度稍高產(chǎn)生的。峰27、30、33在所有車前子生品中均有檢出，但僅在部分炮制品指紋圖譜中呈現(xiàn)，且炮制品中上述3個(gè)色譜峰的峰面積遠(yuǎn)小于生品（＜0.05），說(shuō)明峰27、30、33所表征的化合物為熱敏性成分，炮制受熱后易分解或轉(zhuǎn)化，部分炮制品中檢出峰27、30、33，可能為批間炮制程度差異導(dǎo)致。單因素方差分析結(jié)果表明車前子及其炮制品中的部分化學(xué)成分具有顯著性差異，由PCA、HCA結(jié)果可知車前子炮制前后成分含量差異較大，進(jìn)一步采用OPLS-DA分析可將炒車前子和鹽車前子也區(qū)分開，同時(shí)提取出10個(gè)潛在的差異性標(biāo)志物。粉末外觀顏色上，通過(guò)色差Δ*＞6.0，可輔助識(shí)別車前子生品及炮制品。在抗氧化活性研究中，以ABTS自由基的清除率作為抗氧化活性的藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示車前子炮制后抗氧化活性較生品明顯提高，而不同炮制品間的活性差異不大。

3.3 成分變化分析

車前子炮制后毛蕊花糖苷明顯減少，而異毛蕊花糖苷明顯增加，同時(shí)新產(chǎn)生了木通苯乙醇苷B；芹菜素-7--葡萄糖醛酸苷消失，而芹菜素明顯增加，原因可能與炮制時(shí)成分相互轉(zhuǎn)化有關(guān)[22-23]；有研究表明，含有阿魏酸的藥材在體外干燥過(guò)程中會(huì)與阿魏酸松柏酯相互轉(zhuǎn)化，在光照或升溫時(shí)還會(huì)發(fā)生降解[24]，阿魏酸峰面積在炮制后顯著降低可能與此有關(guān)；原兒茶酸和木犀草素的增加可能是因?yàn)榕谥茣r(shí)車前子內(nèi)部溫度升高，藥材中含有的苷類化合物在加熱條件下不穩(wěn)定分解而成[25]。此外，還有一些化合物含量升高或降低有待進(jìn)一步研究。

3.4 譜-效關(guān)系分析

中藥成分復(fù)雜，治療范圍廣，副作用小，是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的結(jié)果，指紋圖譜可以在整體水平闡明中藥的化學(xué)成分組成，但不能直接對(duì)其功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。中藥譜效學(xué)[25]是研究中藥藥效和指紋圖譜相互關(guān)系的學(xué)科，可以將化學(xué)成分與中藥藥效相結(jié)合，對(duì)中藥質(zhì)量的控制和藥效的評(píng)價(jià)具有重要意義。

PLSR法[24]綜合回歸分析、相關(guān)分析和主成分分析，更加準(zhǔn)確可靠，具有較高的預(yù)測(cè)性，可以通過(guò)構(gòu)建科學(xué)的回歸模型初步衡量各有效成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)程度；灰色關(guān)聯(lián)分析[25]是研究2個(gè)因素變化趨勢(shì)相關(guān)性的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，2個(gè)因素之間的關(guān)聯(lián)度高，則表示二者的同向化變化趨勢(shì)程度高，適合用于分析樣本信息量單一但影響因素復(fù)雜的圖譜，在譜效關(guān)系中運(yùn)用廣泛[19,26]。本研究采用PLSR和灰色關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法，成功建立了車前子及其炮制品UPLC指紋圖譜與其抗氧化活性的譜效關(guān)系，結(jié)果顯示有11個(gè)峰代表的化學(xué)成分與車前子及其炮制品的抗氧化活性關(guān)聯(lián)較大，即主要具有抗氧化作用，其中3個(gè)峰分別為原兒茶酸、木通苯乙醇苷B和野漆樹苷，文獻(xiàn)研究也表明，這3個(gè)成分均具有較好的抗氧化活性[27-29]，其余峰所代表的化學(xué)成分還需要進(jìn)一步研究。

本研究建立車前子炮制前后的UPLC指紋圖譜，并結(jié)合色度值和抗氧化活性，明確了車前子生品及其不同炮制品的顯著差異點(diǎn)，為車前子及其不同炮制品的鑒別及質(zhì)量分析提供較科學(xué)、全面的判斷；同時(shí)結(jié)合譜效關(guān)系研究，明確了車前子及其炮制品抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為車前子的炮制機(jī)制研究提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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CHENG Yu-jie, QIU Cai-yue, HONG Wan-min, LU Peng-xin, WANG Kai-dong, XU Jie, ZHANG Zhi-peng

Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd., Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule, Foshan 528244, China

To analyze the difference of fingerprint, chromatic value and antioxidant activity of Cheqianzi (, PS) and its different processed products, and explore the spectrum-effect relationship between the chemical components and antioxidant effects.The chromaticity value were determined by spectrophotometer, the fingerprint of PS and its different processed products were established by UPLC, and the antioxidant activity were determined by ABTS method. The similarity evaluation, variance analysis, principal component analysis (PCA), cluster analysis, and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) were used to analyze the difference of PS and its different processed products; and the partial least-square method regression (PLSR) and grey correlation analysis (GRA) method were used to explore the spectrum-effect relationship between the chemical components and the antioxidant of PS and its different processed products.The established UPLC fingerprint of PS has calibrated 19 common peaks, while 27 common peaks were calibrated in fried PS (fPS) and salt-processed PS (spPS). A total of 34 chromatographic peaks were calibrated and 13 of them were identified. Multivariate statistical analysis showed that there were obvious differences between PS and its different processed products. PCA and HCA divided the raw and processed products of PS into two categories, and OPLS-DA screened 10 differential marker components. The chromaticity value Δ*of PS and its different processed products was greater than 6, making it visually distinguishable, but the color difference among different processed products was not obvious. The results of antioxidant activity showed enhanced antioxidant effect of PS after processing, with no significant difference among different processed products. Correlation analysis indicated that the peak area values of common peaks had a certain impact on chromaticity values, with a smaller impact on*values and a greater impact on*and*values. PLSR and GRA analysis showed that the chemical constituents represented by 11 peaks were significantly related to the antioxidant of PS and its different processed products, including protocatechuate, calceorioside B and rhoifolin.The UPLC fingerprint established in this study, as well as the determination method of chromaticity value and antioxidant activity, can be used for the identification and quality analysis of PS and its different processed productsThe study of the spectrum-effect relationship between fingerprint and antioxidant activitycan provide a reference for the study of the processing mechanism of PS

; processing; UPLC; fingerprint; chromatic value; antioxidant activity; spectrum-effect relationship; ABTS method; principal component analysis; hierarchical cluster analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; grey relation analysis; isoacteoside; plantainoside D; rhoifolin; geniposidic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)20 - 6657 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.010

2023-04-28

國(guó)家工信部2022年產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)公共服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目——中藥全產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量技術(shù)服務(wù)平臺(tái)（2022-230-221）

程鈺潔（1998—），女，漢族，學(xué)士，初級(jí)中藥師，從事中藥及中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: 13226546740 E-mail: 2496773973@qq.com

通信作者：張志鵬（1990—），男，漢族，碩士，副主任中藥師，從事中藥及中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: 15919328456 E-mail: zhangzp0909@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]