文嗣鑫，李樂康，李亞培，李辰鈺，龔小玲*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實驗室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；3.江西省水生生物保護(hù)救助中心，江西 南昌 330042；4.九江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 九江 332000)

短頜鱭(Coiliabrachygnathus)俗稱毛花魚[1]，體型似長頜鱭(Coiliamacrognathos)，二者形態(tài)上的主要區(qū)別：長頜鱭上頜骨較長，可向后延長至鰓蓋后緣，體側(cè)縱列鱗數(shù)目較多，為75～83個；而短頜鱭上頜骨不超過鰓蓋后緣，體側(cè)縱列鱗數(shù)目為68～77個。早期研究認(rèn)為，短頜鱭生長、發(fā)育和繁殖均在江河湖泊內(nèi)，且多在中上水層生活，并在深水層越冬，生殖期在每年4—5月，能在靜水和緩水中產(chǎn)卵，屬于中小型經(jīng)濟(jì)魚類[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，短頜鱭也存在江海洄游的個體[4]。短頜鱭在不同的生長階段食性會發(fā)生變化，幼魚主要以水中浮游動物為食，小型成體主要攝食昆蟲幼蟲、橈足類和枝角類，而大型成體主要以魚蝦為食[5-6]。

魚類腸道微生物是由宿主自身的特性和各種外界環(huán)境因素共同作用形成的，最有優(yōu)勢的微生物類群一般是細(xì)菌[7]，主要由兼性厭氧菌和好氧菌組成，通常存在變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)3門核心微生物，它們能夠有效調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)組成，參與魚的生長和免疫，促使魚類健康生長[8]。

鄱陽湖是中國第一大淡水湖[9]，位于江西省北部，是長江中下游地區(qū)主要支流之一；而青草沙水庫位于咸、淡水交界處的長江口，短頜鱭均是鄱陽湖和青草沙水庫魚類的優(yōu)勢種[10-12]，在兩種不同水域中都具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。魚類腸道菌群與水域環(huán)境密切相關(guān)，因此，探究不同水域短頜鱭腸道菌群差異及影響因素具有重要意義。本研究通過比較鄱陽湖和青草沙水庫中大、小兩種規(guī)格的短頜鱭腸道菌群結(jié)構(gòu)差異并預(yù)測菌群功能，以期為探究短頜鱭水環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制及短頜鱭腸道菌群與宿主之間的調(diào)控關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查站位

分別于2021年11月23、24、25日對江西省九江市鄱陽湖湖口，以及2021年12月30日對上海市長江口青草沙水庫進(jìn)行實地采樣。調(diào)查當(dāng)日下午將網(wǎng)具放置在指定位置，次日上午收取。調(diào)查網(wǎng)具為三層刺網(wǎng)：單條網(wǎng)長100 m，高2 m，網(wǎng)目2a=4 cm，每個調(diào)查站位放置2條，每次放置時間約12 h。采樣點(diǎn)具體信息見圖1、表1。

本圖基于自然資源部標(biāo)準(zhǔn)地圖服務(wù)網(wǎng)站GS(2019)3333號標(biāo)準(zhǔn)地圖為底圖，底圖邊界無修改。The figure is based on the standard map GS(2019)3333 in the Standard Map Service website of Ministry of Natural Resources of the People’s Republic of China，with no modifications of the boundaries in the standard map.圖1 短頜鱭樣品采集站位Fig.1 Sample collection sites of Coilia brachygnathus

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 在鄱陽湖湖口共采集到短頜鱭60尾，在青草沙水庫共采集到74尾。測量樣本全長和體質(zhì)量，并按全長、體質(zhì)量區(qū)間值劃分為大、小規(guī)格兩類，共4組。其中，青草沙水庫大、小規(guī)格短頜鱭分別記為QCS-L、QCS-S，鄱陽湖大、小規(guī)格短頜鱭分別記為PYH-L、PYH-S。大規(guī)格全長為30～35 cm，平均值為(31.58±0.74)cm，體質(zhì)量為100～130 g，平均值為(120.43±5.85)g；小規(guī)格全長為15～20 cm，平均值為(17.72±1.30)cm，體質(zhì)量為10～30 g，平均值為(16.85±4.53)g。

從每組隨機(jī)選取3尾短頜鱭，共12個樣本。無菌條件下，用乙醇棉球擦拭魚體表后，再用剪刀從短頜鱭肛門處將腹部剪開，分離出完整腸道。將腸道放入培養(yǎng)皿中，去除腸道內(nèi)容物，并使用緩沖液沖洗掉腸壁上的血液、脂肪。腸道樣品用液氮速凍后置于2 mL凍存管，并于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 細(xì)菌總DNA提取和測序 根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit 抽提腸道菌群群落總DNA，采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并利用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度。設(shè)計上游引物(5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 3′)和下游引物(5′CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 3′)對16S rRNA V4～V5(a)可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃下預(yù)變性3 min；95 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行27個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存(PCR 儀：ABI GeneAmp?9700型)。PCR 反應(yīng)體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，DNA模板 10 ng，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR產(chǎn)物在Illumina MiSeq平臺(Illumina，San Diego，USA)上進(jìn)行測序。

1.2.3 樣品OTU、菌群多樣性及群落組成分析 對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步篩查，對存在問題的樣品進(jìn)行重測、補(bǔ)測。原始序列按照index和barcode信息進(jìn)行文庫和樣品劃分，去除低質(zhì)量序列及barcode和接頭信息。

按照QIIME 2 dada 2和Vsearch軟件的分析流程進(jìn)行序列OTU聚類。依據(jù)OTU在不同樣品中的分布，評估每個樣品的Alpha多樣性水平。

在物種分類學(xué)組成層面，利用QIIME 2軟件進(jìn)行分析，并結(jié)合統(tǒng)計學(xué)檢驗方法，進(jìn)一步衡量不同樣品間的物種豐度組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群的測序質(zhì)量及OTU數(shù)量

從圖2可見，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，各組樣品OTU數(shù)量也隨之增大，最終曲線趨于平緩，表明測序結(jié)果已足夠反映樣品所包含的多樣性，能反映不同水域短頜鱭腸道菌群組成和種類。

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Sample dilution curves

從圖3可見，QCS-L、QCS-S、PYH-L、PYH-S腸道菌群的平均OTU分別為524、472、466和567個，4組特有的OTU分別為 215、171、189、280個，表明QCS-L腸道菌群的多樣性比PYH-L的更高，而QCS-S腸道菌群的多樣性則比PYH-S的要低。

2.2 腸道菌群Alpha多樣性

從表2可見，鄱陽湖、青草沙水庫不同規(guī)格短頜鱭腸道菌群樣品覆蓋率均接近1.0，且無顯著性差異(P>0.05)，表明樣品中未被測序的菌群概率非常低。在Alpha多樣性分析中，Chao1指數(shù)值越大，OTU數(shù)目越多，說明該樣品腸道菌群物種數(shù)較多。QCS-L的Chao1指數(shù)值比PYH-L的高，而QCS-S的Chao1指數(shù)則比PYH-S的低。表明大規(guī)格短頜鱭的腸道菌群在青草沙水庫的物種數(shù)比鄱陽湖多，而小規(guī)格則相反。

表2 鄱陽湖、青草沙水庫不同規(guī)格短頜鱭腸道菌群 Alpha 多樣性

Shannon和Simpson指數(shù)表征物種多樣性，數(shù)值越大，表示群落多樣性越高。QCS-L腸道菌群的Shannon和Simpson值比PYH-L的高，而QCS-S腸道菌群的Shannon和Simpson值則比PYH-S的低。表明大規(guī)格短頜鱭腸道菌群在青草沙水庫的群落多樣性比鄱陽湖的高，而小規(guī)格則相反。

2.3 腸道菌群Beta多樣性

PCoA分析顯示：QCS-L腸道菌群樣品主要沿PCo1坐標(biāo)軸形成一個簇，與PYH-L明顯分離；沿PCo2坐標(biāo)軸，QCS-S腸道菌群樣品也與PYH-S明顯分離(圖4)。Permanova分析表明，青草沙水庫與鄱陽湖大、小規(guī)格短頜鱭腸道菌群存在顯著性差異(P=0.003<0.05)。

圖4 鄱陽湖、青草沙水庫不同規(guī)格短頜鱭腸道菌群差異主成分分析Fig.4 Principal co-ordinates analysis showing the differences in intestinal bacterial communities of Coilia brachygnathus with different sizes in Poyang Lake and Qingcaosha Reservoir

2.4 腸道菌群組成

從門分類水平將豐度大于1%的細(xì)菌類群進(jìn)行統(tǒng)計，而將豐度小于1%的細(xì)菌類群進(jìn)行合并，并命名為“others”。從圖5可見，不同水域短頜鱭腸道菌群主要分為8個門，分別是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、OD1菌門(OD1)、浮霉菌門(Planctomycetes)、衣原體門(Chlamydiae)和酸桿菌門(Acidobacteria)。每個門類細(xì)菌在不同水域短頜鱭腸道中的豐度差異較大，在大規(guī)格短頜鱭中，變形菌門和擬桿菌門在鄱陽湖中的豐度大于青草沙水庫，厚壁菌門在鄱陽湖中的豐度則小于青草沙水庫；在小規(guī)格短頜鱭中，擬桿菌門、厚壁菌門在鄱陽湖中的豐度大于青草沙水庫，變形菌門在鄱陽湖中的豐度則小于青草沙水庫。

圖5 門水平上鄱陽湖、青草沙水庫不同規(guī)格短頜鱭腸道菌群豐度Fig.5 Intestinal bacterial community abundance in Coilia brachygnathus with different sizes at phylum level in Poyang Lake and Qingcaosha Reservoir

從圖6可見，鄱陽湖、青草沙水庫不同規(guī)格短頜鱭腸道菌群主要分為9個屬，分別是蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、鮭色沉積物桿狀菌屬(Sediminibacterium)、紅游動菌屬(Rhodoplanes)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、念珠菌屬(Candidatus_Rhabdochlamydia)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)。在各組對比中，伯克霍爾德菌屬為差異性最大的菌群，其在QCS-L、PYH-L中分別占18.69%、9.28%，在QCS-S、PYH-S中分別占25.53%、12.68%。

圖6 屬水平上鄱陽湖、青草沙水庫不同規(guī)格短頜鱭腸道菌群豐度Fig.6 Intestinal bacterial community abundance in Coilia brachygnathus with different sizes at genus level in Poyang Lake and Qingcaosha Reservoir

2.5 腸道菌群功能預(yù)測

從圖7可見，參與生物合成(biosynthesis)的代謝途徑豐度最高，其中，參與氨基酸生物合成(amino acid biosynthesis)、核苷與核苷酸生物合成(nucleoside and nucleotide biosynthesis)、脂肪酸與脂質(zhì)生物合成(fatty acid and lipid biosynthesis)及輔因子(cofactor，prosthetic group，electron carrier and vitamin biosynthesis)等通路豐度較高。

圖7 鄱陽湖和青草沙水庫不同規(guī)格短頜鱭腸道菌群代謝通路豐度Fig.7 Metabolic pathway abundance of intestinal bacterial community in Coilia brachygnathus with different sizes in Poyang Lake and Qingcaosha Reservoir

3 討論

魚類腸道微生物是水環(huán)境和餌料中的微生物隨著鰓和口腔進(jìn)入體內(nèi)，并與魚類發(fā)生適應(yīng)性生理生化作用，最終定植在魚類腸道中的菌群，因此，魚類腸道菌群的結(jié)構(gòu)與其遺傳、食性和水環(huán)境密切相關(guān)[13]。Fietz等[14]在鱗柄玉筋魚(Ammodytestobianus)和尖頭富筋魚(Hyperopluslanceolatus)這兩種海洋魚類中發(fā)現(xiàn)，遺傳因素可能在種間和種內(nèi)水平上對腸道菌群組起調(diào)節(jié)作用。鄱陽湖和青草沙水庫兩個水域小規(guī)格短頜鱭可能均為定居性群體，且在不同水域發(fā)生了遺傳分化[15]，這可能是它們腸道菌群組成差異的原因之一；由于本研究中短頜鱭樣品均為性成熟的樣品[16]，因此，腸道菌群與發(fā)育階段無關(guān)，導(dǎo)致其腸道菌群差異的因素還可能有食性和水環(huán)境。

3.1 腸道菌群與食性的關(guān)系

李可俊等[17]在對長江口8種野生魚類腸道菌群的比較中發(fā)現(xiàn)，魚類腸道結(jié)構(gòu)多樣性的差異與魚類食性密切相關(guān)，食性差異越大的魚類之間腸道菌群差異也越顯著。同一種魚攝食不同種類的食物后，其消化道菌群結(jié)構(gòu)也會發(fā)生改變[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，鄱陽湖小規(guī)格短頜鱭相比大規(guī)格的腸道菌群多樣性和豐富度更高。唐渝[20]在研究太湖湖鱭種群數(shù)量變動及合理利用時發(fā)現(xiàn)，湖鱭胃容物包括原生動物、蝦蟹貝幼體、魚卵、水蚤、輪蟲、低等藻類及湖鱭幼魚等，高達(dá)30多種。一般體長小于13 cm的湖鱭餌料以枝角類、橈足類等浮游動物為主，當(dāng)其體長超過13 cm時，餌料中會出現(xiàn)一些經(jīng)濟(jì)魚蝦，當(dāng)其體長增長至17 cm以上時，餌料中經(jīng)濟(jì)魚蝦相對密度急劇上升[21]。Zhang等[22]研究證實，鄱陽湖短頜鱭食性介于濾食性與肉食性之間。本研究中，小規(guī)格短頜鱭還能以浮游動物為食，相比大規(guī)格的個體在食性上更為豐富，這很可能是導(dǎo)致鄱陽湖小規(guī)格短頜鱭腸道菌群多樣性和豐富度比大規(guī)格短頜鱭高的重要原因。而青草沙水庫短頜鱭則與之相反，這可能是由于采集分析的大規(guī)格短頜鱭樣本存在江海洄游的個體。徐剛春等[4]在研究長江短頜鱭耳石Sr/Ca值變化特征時發(fā)現(xiàn)，長江中存在參與江海洄游的短頜鱭個體。江海洄游需經(jīng)歷咸、淡水復(fù)雜的水環(huán)境，導(dǎo)致洄游型短頜鱭腸道菌群多樣性和豐富度更高。

3.2 腸道菌群與水環(huán)境的關(guān)系

董博等[23]研究發(fā)現(xiàn)，河口生活的彈涂魚(Periophthalmuscantonensis)腸道微生物群落中同時具有陸生動物、淡水與海水魚類及兩棲動物的典型細(xì)菌家族，這與其在水陸過渡咸淡水交界處的生活特征相吻合，其依靠多樣的腸道微生物來應(yīng)對不同環(huán)境。本研究中發(fā)現(xiàn)，鄱陽湖小規(guī)格短頜鱭的腸道菌群多樣性和豐富度最高，因其樣品采集于鄱陽湖湖口，此處屬鄱陽湖與長江交匯處，來水及水體環(huán)境復(fù)雜，相較湖區(qū)水體微生物群落更為豐富[24-25]。而青草沙水庫采用“避咸取淡”(避東海咸潮取長江淡水)管理模式，經(jīng)過十多年的運(yùn)行，青草沙水庫庫內(nèi)與庫外的水質(zhì)發(fā)生了明顯差異，庫內(nèi)為較優(yōu)質(zhì)的、穩(wěn)定的飲用水源[26]，庫內(nèi)藻類較來水有所增殖，導(dǎo)致庫內(nèi)微生物多樣性比來水低，即長江水進(jìn)入水庫后，微生物群落出現(xiàn)了生態(tài)演替，菌群多樣性降低[27]，進(jìn)而影響到棲息于此的魚類腸道菌群多樣性和組成。

3.3 腸道菌群組成及其功能預(yù)測

本研究中，從不同水域短頜鱭腸道菌群組成分析可以看出，青草沙水庫和鄱陽湖短頜鱭的腸道菌群中，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門均占絕對優(yōu)勢。這與鄱陽湖水體環(huán)境優(yōu)勢菌群組成相一致[24-25]，進(jìn)一步證實水環(huán)境是影響短頜鱭腸道菌群多樣性和組成的重要因素。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門這3類細(xì)菌在很多魚類腸道中出現(xiàn)且占腸道菌群的90%以上[28]，變形菌門和擬桿菌門的有些成員可以改善宿主的代謝和免疫功能障礙，誘導(dǎo)其免疫應(yīng)答，很可能與魚的生長和免疫有關(guān)[29-30]，這與本研究發(fā)現(xiàn)的短頜鱭腸道菌群中，參與生物合成的代謝途徑豐度相較其他代謝通路豐度較高的結(jié)果相一致。而厚壁菌門中的某些細(xì)菌在魚類的消化吸收過程中提供多種酶[31]，可能在促進(jìn)短頜鱭營養(yǎng)物質(zhì)的吸收中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

1)青草沙水庫大規(guī)格短頜鱭的腸道菌群多樣性比鄱陽湖同規(guī)格短頜鱭的高，而鄱陽湖小規(guī)格短頜鱭的腸道菌群多樣性比青草沙水庫同規(guī)格的高。

2)不同水域短頜鱭腸道中，每個門類的細(xì)菌豐度差異較大；在屬水平上，伯克霍爾德菌屬為豐度差異性最大的菌群。

3)不同水域短頜鱭腸道菌群多樣性和豐度的差異，極有可能是短頜鱭生活史、食性轉(zhuǎn)變及水環(huán)境差異造成的。