景年華，史俊友，安仙香，劉超穎

（1.曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院，云南 曲靖 655011；2.曲靖師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 曲靖655011）

銀杏科（Ginkgoaceae）植物銀杏（Ginkgo bilobaL.）為落葉喬木，被譽為植物界的活化石［1］。據(jù)記載，銀杏葉性平、味甘苦，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂之功效［2］；現(xiàn)代研究表明，銀杏葉有效成分包括黃酮類、多糖類等活性物質(zhì)，具有保護神經(jīng)系統(tǒng)、改變血液流變學(xué)、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等生物活性［3-8］。因此，開展提高黃酮含量以利用銀杏葉藥用價值為目標(biāo)的提取工藝優(yōu)化具有重要現(xiàn)實意義。多種癌細(xì)胞活性受黃酮類化合物抑制，例如肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞。Jiang等［9］研究發(fā)現(xiàn)木犀草素，對A549細(xì)胞及H460 細(xì)胞均有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，H460 裸鼠移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)木犀草素顯著抑制了腫瘤生長，同時發(fā)現(xiàn)木犀草素對非小細(xì)胞肺癌具有顯著腫瘤抑制活性作用。類黃酮可抑制卵巢癌細(xì)胞自噬，改善細(xì)胞凋亡，從而在抵抗卵巢癌中發(fā)揮作用［10］。黃酮類化合物具有較好的抗炎作用，有實驗表明白簕植物黃酮提取物可有效抑制角叉菜膠誘發(fā)的大鼠腳趾腫脹［11］。二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳朵腫脹實驗表明，黃酮可有效降低腫脹程度［12］。黃酮具較高抗氧化活性，銀杏葉黃酮是天然植物抗氧化劑，可有效清除機體自由基［13］，并有效消除人體內(nèi)氧化生成的各種不飽和脂類自由基、蛋白質(zhì)自由基，避免人體細(xì)胞及組織氧化損傷，同時有證據(jù)表明黃酮類化合物對豬油自氧化有明顯的抑制作用［14］。

近年來，銀杏葉多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等方面的活性不斷被發(fā)現(xiàn)，具有十分可觀的藥用價值及潛在的醫(yī)藥開發(fā)前景［15-18］。多糖廣泛存在于植物、動物及微生物組織中［19］。人類對其初始研究可追溯到1936 年對多糖抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)［20］。至50 年代，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些真菌多糖和高等植物多糖具有明顯的抑瘤活性［21］，隨著研究的進一步深入，人們發(fā)現(xiàn)多糖還具有增強免疫力、抗肝炎、降血糖、降血脂、抗衰老、抗病毒病菌、消炎、緩解疲勞等作用［15-18］。天然多糖因其獨特的功能和很低的毒性，已成為天然藥物學(xué)和保健食品學(xué)的研究熱點。它既是尋找高效天然無毒副作用藥物的有效途徑，也是保健功能因子的研究項目之一。

目前，關(guān)于銀杏葉多糖類化合物及黃酮類化合物的提取方法主要集中于水提醇沉法、酶解法、超聲波法、微波法及其相互間的技術(shù)聯(lián)用等，且提取時僅僅集中于其中一種有效成分的提?。?3，22，23］。利用超聲波產(chǎn)生的空化作用迅速破裂細(xì)胞，使黃酮類化合物及多糖類化合物在超聲波熱效應(yīng)下更易溶解，縮短了提取時間，增加了提取率及原料利用率。常波等［24］應(yīng)用超聲波輔助萃取所得植物總黃酮的得率最高，且操作簡單?；诔暡ㄝo助萃取法的優(yōu)點，本文在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對銀杏葉黃酮及多糖提取工藝進行了優(yōu)化，旨在通過超聲輔助萃取法提取銀杏黃酮及多糖有效成分，為銀杏葉相關(guān)保健產(chǎn)品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

銀杏葉采自云南曲靖。使用試劑為無水乙醇、亞硝酸納、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚等均為分析純。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：成都埃及生物科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：國藥集團化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9245 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SK3200LHC 超聲波清洗儀：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；SHZ-DIII 循環(huán)水式真空泵：鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；XA-1 高速萬能粉碎機：金壇市白塔金昌實驗儀器廠；CP214 電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；TU-1810 紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 實驗方法

2.1 銀杏葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 實驗流程

銀杏葉清洗→干燥→粉碎→準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量銀杏葉→以不同濃度乙醇為提取溶劑超聲輔助提取總黃酮→抽濾→紫外可見分光光度法測其黃酮含量

2.1.2 蘆丁最大吸收波長λmax的確定

準(zhǔn)確量取1.00 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg·mL-1）置于10 mL 比色管中，依據(jù)姜洪芳等的方法［25］，顯色后，用無水乙醇定容至10 mL，搖勻，于300～600 nm波長范圍進行光譜掃描，得光的吸收曲線及最大吸收波長λmax。

2.1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg·mL-1）0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL 于10 mL 比色管中，如2.1.2 所述顯色后，于波長λ = 389.1nm 處測定其吸光度值A(chǔ)。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.4 銀杏葉黃酮最大吸收波長λmax的確定

準(zhǔn)確稱取5 g 銀杏葉干燥粉末，設(shè)定超聲功率（100 W），超聲持續(xù)時間（40 min），超聲溫度（35℃），提取溶劑（75%乙醇），料液比（1 ∶ 20 g·mL-1），對銀杏葉黃酮進行超聲提取。超聲提取后，抽濾得濾液，濾液稀釋后依據(jù)2.1.2 所述實驗方法顯色，于340～800 nm 波長范圍進行光譜掃描，得光的吸收曲線及銀杏葉黃酮顯色后最大吸收波長λmax。

2.1.5 單因素試驗

2.1.5.1 料液比對銀杏葉黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取5 g銀杏葉干燥粉末5份，設(shè)定超聲功率（100 W），超聲持續(xù)時間（40 min），超聲溫度（35℃），提取溶劑（75%乙醇），通過改變料液比即料液比分別為1 ∶ 10 g·mL-1、1 ∶ 20 g·mL-1、1 ∶ 30 g·mL-1、1 ∶ 40 g·mL-1、1 ∶ 50 g·mL-1進行單因素試驗。超聲提取后，抽濾得濾液，濾液顯色后測定吸光度值A(chǔ)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算黃酮提取率。

2.1.5.2 乙醇濃度對銀杏葉黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取5 g 銀杏葉干燥粉末5 份，設(shè)定超聲功率（100 W），超聲持續(xù)時間（40 min），超聲溫度（35℃），料液比（1 ∶ 20 g·mL-1），通過改變提取溶劑即55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇進行單因素試驗。超聲提取后，抽濾得濾液，濾液顯色后測定吸光度值A(chǔ)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算黃酮提取率。

2.1.5.3 提取超聲時間對銀杏葉黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取5 g 銀杏葉干燥粉末5 份，設(shè)定超聲功率（100 W），超聲溫度（35℃），料液比（1 ∶20 g·mL-1），提取溶劑（85%乙醇），通過改變超聲時間即40 min、50 min、60 min、70 min、80 min 進行單因素試驗。超聲提取后，抽濾得濾液，濾液顯色后測定吸光度值A(chǔ)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算黃酮提取率。

2.1.5.4 提取超聲功率對銀杏葉黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取5 g 銀杏葉干燥粉末5 份，設(shè)定超聲溫度（35℃），料液比（1 ∶ 20 g·mL-1），提取溶劑（85%乙醇），超聲時間（50 min），通過改變超聲功率即100 W、200 W、300 W、400 W、500 W 進行單因素試驗。超聲提取后，抽濾得濾液，濾液顯色后測定吸光度值A(chǔ)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算黃酮提取率。

2.1.6 正交試驗

據(jù)2.1.5 實驗結(jié)果，以黃酮提取率為考察指標(biāo)，選擇影響黃酮提取率的4 個因素即料液比、乙醇濃度、超聲時間、超聲功率進行4 因素3 水平L9（43）正交實驗。正交因素水平見表1。

表1 銀杏葉黃酮提取正交實驗因素水平表Tab.1 Orthogonal experimental factors and levels of extraction of flavonoids from leaves of Ginkgo biloba

2.2 銀杏葉多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 銀杏葉多糖提取流程

銀杏葉清洗→干燥→粉碎→準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量銀杏葉→超聲輔助提取多糖→離心→抽濾→醇沉（80%乙醇醇沉）→離心（對醇沉所得白色絮狀多糖進行2次離心）→洗滌、烘干→粗多糖→配制粗多糖溶液→苯酚-硫酸法測定多糖含量。

2.2.2 葡萄糖最大吸收波長λmax的確定

準(zhǔn)確量取0.00 mL、1.00 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg·mL-1）于10 mL 比色管中，分別加入蒸餾水補足體積至2 mL，搖勻，利用苯酚-硫酸法顯色，于300～600 nm 波長范圍內(nèi)進行光譜掃描得光的吸收曲線及最大吸收波長λmax以用于后續(xù)實驗［26］。

2.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分 別 準(zhǔn) 確 移 取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg·mL-1）于比色管中，按2.2.2 所述操作顯色后，于波長λ = 490 nm 處測定吸光度值A(chǔ)。以葡萄糖質(zhì)量（mg）對吸光度值A(chǔ) 進行線性回歸，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 銀杏葉多糖最大吸收波長λmax的確定

準(zhǔn)確稱取5 g 銀杏葉干燥粉末，以水為提取溶劑，設(shè)定超聲溫度（45℃），料液比（1 ∶ 20 g·mL-1），超聲功率（500 W），超聲時間（40 min），對銀杏葉多糖進行超聲提取。超聲提取后，經(jīng)醇沉、離心、洗滌烘干得粗多糖。配置0.2 mg·mL-1粗多糖溶液，依據(jù)2.2.2所述實驗方法顯色，于400～800 nm波長范圍進行光譜掃描，得光的吸收曲線及銀杏葉多糖顯色后最大吸收波長λmax。

2.2.5 單因素試驗

2.2.5.1 超聲時間對銀杏葉多糖提取率的影響

設(shè)定超聲溫度（45℃），料液比（1 ∶ 20 g·mL-1），超聲功率（500 W），通過改變超聲時間即20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 進行單因素試驗。超聲后，4000 r/min離心10 min，收集上清液，殘渣同前重復(fù)提取1 次，合并2 次提取上清液，抽濾，濾液醇沉、離心、洗滌烘干得粗多糖。準(zhǔn)確稱取0.0100 g 粗多糖，定容至50 mL 得0.2 mg·mL-1粗多糖溶液。粗多糖溶液顯色測其吸光度值A(chǔ)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算多糖提取率。

2.2.5.2 超聲功率對銀杏葉多糖提取率的影響

設(shè)定超聲溫度（45℃），料液比（1 ∶ 20 g·mL-1），超聲時間（40 min），通過改變超聲功率即100 W、200 W、300 W、400 W、500 W進行單因素試驗。超聲后4000 r/min 離心10 min，收集上清液，殘渣同前重復(fù)提取一次，合并上清液抽濾，濾液醇沉、離心、洗滌烘干得粗多糖。配制0.2 mg·mL-1粗多糖溶液、顯色測其吸光度值A(chǔ)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算多糖提取率。

2.2.5.3 超聲溫度對銀杏葉多糖提取率的影響

設(shè)定超聲時間（40 min），料液比（1 ∶ 20 g·mL-1）超聲功率（300 W），通過改變超聲溫度即20℃、30℃、40℃、50℃、60℃進行單因素試驗，超聲后4000 r/min 離心10 min，收集上清液，殘渣同前重復(fù)提取一次，合并上清液抽濾，濾液醇沉、離心、洗滌烘干得粗多糖，配制粗多糖溶液（0.2 mg·mL-1），顯色后測其吸光度值A(chǔ)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算多糖提取率。

2.2.6 正交實驗設(shè)計

據(jù)2.2.5 單因素試驗結(jié)果，以銀杏葉多糖提取率為考察指標(biāo)，以超聲時間、超聲功率、超聲溫度為因素進行3 因素3 水平L9（33）正交實驗。正交實驗因素及水平見表2。

表2 銀杏葉多糖提取正交實驗因素水平表Tab.2 Orthogonal experimental factors and levels of extraction of polysaccharides from leaves of Ginkgo biloba

3 結(jié)果與分析

3.1 最大吸收波長的λ max確定

于波長300～600 nm 范圍內(nèi)進行光譜掃描，蘆丁顯色后光的吸收曲線于389.1 nm 處有最高峰，即λmax= 389.1 nm；葡萄糖顯色后吸收曲線于490 nm處有最高峰，即λmax= 490 nm。另外，于波長340～800 nm及400～800 nm 處分別對顯色后銀杏葉黃酮及多糖進行光譜掃描，光吸收曲線見圖1。由圖1可知顯色后銀杏葉黃酮及多糖λmax分別為397.5 nm、487.5 nm，與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁及葡萄糖顯色后λmax相近，依據(jù)文獻［27-30］，往往選擇標(biāo)準(zhǔn)品顯色后最大吸收波長進行含量測定，故后續(xù)對黃酮及多糖含量測定時，分別選擇蘆丁顯色后λmax（389.1 nm）及葡萄糖λmax（490 nm）進行測定。

圖1 銀杏葉黃酮和多糖的光吸收曲線Fig.1 Spectral absorption curves of flavonoids and polysaccharides from leaves of Ginkgo biloba

3.2 銀杏葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

相關(guān)研究表明［31，32］，在冷凍條件下總黃酮含量相對穩(wěn)定，隨著溫度的升高，總黃酮含量降低速率逐漸增加，充分考慮到總黃酮這一性質(zhì)，總黃酮提取時考慮超聲溫度對銀杏葉總黃酮提取的影響，實驗結(jié)果如圖2所示，超聲溫度在35～45℃范圍內(nèi)黃酮提取率逐漸降低，超聲溫度為45℃時，提取率達最小值19.62 mg·g-1；超聲溫度在45～50℃范圍內(nèi)，隨著超聲溫度增大，黃酮提取率上升，超聲溫度為55℃時，黃酮提取率有所下降；超聲溫度為35℃，銀杏葉黃酮提取率達最大值22.26 mg·g-1。因此，銀杏葉總黃酮超聲提取時，超聲溫度選擇相對較低溫度35℃，盡可能降低溫度對總黃酮含量的影響。實驗時，選擇料液比、乙醇濃度、超聲時間及超聲功率4個因素進行銀杏葉總黃酮提取工藝優(yōu)化。

圖2 超聲溫度對銀杏葉黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of flavonoids from leaves of Ginkgo biloba

3.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得線性方程為Y = 3.087 9 X +0.193，R2= 0.999 1，蘆丁質(zhì)量在0.05 ～ 0.35 mg 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Rutin standard curve

3.2.2 黃酮提取單因素試驗

3.2.2.1 料液比對銀杏葉黃酮提取率的影響

由圖4 可知，料液比在1 ∶ 10 ～ 1 ∶ 20 g·mL-1范圍內(nèi)黃酮提取率逐漸增加，料液比為1 ∶ 20 g·mL-1時，提取率達最大值28.14 mg·g-1；料液比在1 ∶ 20 ～1 ∶ 50 g·mL-1范圍內(nèi)，隨著提取溶劑體積增大，黃酮提取率逐漸下降，料液比為1 ∶ 50 g·mL-1時提取率降至26.89 mg·g-1。這可能是料液比為1 ∶ 10 ～ 1 ∶20 g·mL-1時，溶劑用量未達到飽和，所以黃酮提取率隨著溶劑用量的增加而增大。繼續(xù)增加溶劑用量，其他可溶性雜質(zhì)提取量增加，黃酮得率反而降低。所以1 ∶ 20 g·mL-1為銀杏葉黃酮提取最佳料液比。選取料液比1 ∶ 10 g·mL-1、1 ∶ 20 g·mL-1、1 ∶30 g·mL-1進行正交試驗。

圖4 料液比對銀杏葉黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of flavonoids from leaves of Ginkgo biloba

3.2.2.2 乙醇濃度對銀杏葉黃酮提取率的影響

由圖5 可知，乙醇濃度為55% ～ 85%時，銀杏葉黃酮提取率隨乙醇濃度的增大而增大，乙醇濃度為85%時，提取率達最大值達47.20 mg·g-1；乙醇濃度為95% 時，黃酮提取率有所降低，提取率為43.53 mg·g-1。主要原因可能是黃酮類化合物具有廣泛極性，當(dāng)溶液極性過高或過低時，會減少黃酮類化合物的溶解，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。所以銀杏葉黃酮提取以乙醇為提取溶劑，其濃度為85%。

圖5 乙醇濃度對銀杏葉黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction of flavonoids from leaves of Ginkgo biloba

3.2.2.3 超聲時間對銀杏葉黃酮提取率的影響

超聲時間對銀杏葉黃酮提取率的影響見圖6，隨著超聲時間的延長，黃酮提取率呈先增大后降低的趨勢。超聲時間在40 ～ 50 min 范圍內(nèi)，黃酮提取率隨時間增加隨之增大，超聲時間為50 min 時，黃酮提取率最大，為47.64 mg·g-1。超聲時間在50 ～80 min 范圍，黃酮提取率下降， 80 min 時提取率下降至30.12 mg·g-1。主要原因可能是超聲時間會影響提取的傳質(zhì)過程，超聲時間過短，傳質(zhì)不能達到平衡，其提取率偏低，超聲時間適宜，傳質(zhì)達到基本平衡，提取率最佳，超聲時間過長，多種雜質(zhì)溶解，溶液黏度增大，黃酮溶出受阻，同時部分黃酮苷水解，提取率隨之降低。所以銀杏葉黃酮最佳超聲時間為50 min。

圖6 超聲時間對銀杏葉黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on the extraction of flavonoids from leaves of Ginkgo biloba

3.2.2.4 超聲功率對銀杏葉黃酮提取率的影響

超聲功率在100～400 W 范圍內(nèi)，黃酮提取率隨超聲功率的增大不斷增加，超聲功率為400 W 時，黃酮提取率最大，為34.90 mg·g-1。超聲功率在400～500 W 范圍內(nèi)，黃酮提取率隨超聲功率的增大而下降，超聲功率為500 W 時，黃酮提取率降至32.84 mg·g-1。原因可能為超聲功率為100～400 W時，銀杏葉黃酮分子運動加速從而使黃酮提取得率增大，當(dāng)超聲功率 ＞ 400 W 時，可能由于超聲波空化效應(yīng)及機械效應(yīng)［33］，引起黃酮類物質(zhì)分解，所以黃酮提取率出現(xiàn)下降。因此，最佳超聲提取功率為400 W（圖7）。

圖7 超聲功率對銀杏葉黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on the extraction of flavonoids from leaves of Ginkgo biloba

3.2.3 正交實驗分析

由表3 黃酮提取率極差可得，超聲波輔助提取銀杏葉黃酮類化合物的影響因素依次為A（料液比） ＞ D（超聲功率） ＞ B（乙醇濃度） ＞ C（超聲時間）。由正交試驗結(jié)果可得，銀杏葉黃酮最佳提取工藝為A2B3C3D1，進行驗證實驗（n = 3），得黃酮的提取率為37.50 mg·g-1，高于其它各正交實驗值，確定該提取工藝穩(wěn)定性好，可行性高。因此，確定銀杏葉黃酮提取最佳工藝條件為，料液比為1 ∶20 g·mL-1，乙 醇 濃 度 為95%，超 聲 持 續(xù) 時 間 為60 min，超聲功率300 W。

3.3 多糖提取工藝優(yōu)化

銀杏葉多糖提取時，如圖8 所示，料液比在1 ∶15 ～ 1 ∶ 20 g·mL-1范圍內(nèi)，多糖提取率逐漸增大，料液比為1 ∶ 20 g·mL-1時，多糖提取率最大，提取率為50.08 mg·g-1，料液比在1 ∶ 20 ～ 1 ∶ 35 g·mL-1范圍內(nèi)，多糖提取率呈下降趨勢，最低值達40.35 mg·g-1。料液比對銀杏葉多糖提取的影響相較于超聲時間、超聲功率及超聲溫度對多糖提取率的影響較小，因此實驗時，選擇超聲時間、超聲功率及超聲溫度3個因素進行銀杏葉多糖提取工藝優(yōu)化。

圖8 料液比對銀杏葉多糖提取率的影響Fig.8 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of polysaccharide from leaves of Ginkgo biloba

3.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以葡萄糖質(zhì)量（mg）對吸光度值A(chǔ) 做線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y = 1.685 8 X - 0.021 3，R2=0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9所示。

圖9 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Glucose standard curve

3.3.2 單因素實驗

3.3.2.1 超聲時間對銀杏葉多糖提取率的影響

超聲時間對多糖提取率的影響見圖10。超聲時間在20～40 min 范圍內(nèi)，多糖提取率逐漸升高，當(dāng)時間為40 min時，多糖提取率最大，提取率為43.70 mg·g-1，超聲時間 ＞ 40 min時，多糖提取率呈下降趨勢，超聲時間達60 min 時，多糖提取率降至13.70 mg·g-1。主要原因可能是超聲時間過長，較多雜質(zhì)溶出從而使溶出物濃度差降低，影響多糖溶解，且因超聲時間過長部分多糖水解，導(dǎo)致銀杏葉多糖提取率下降。因此多糖最佳超聲時間為40 min。

圖10 超聲時間對銀杏葉多糖提取率的影響Fig.10 Effect of ultrasound time on the extraction of polysaccharide from leaves of Ginkgo biloba

3.3.2.2 超聲功率對銀杏葉多糖提取率的影響

超聲功率對銀杏葉多糖提取的影響見圖11。超聲功率在100 ～ 300 W范圍內(nèi)，多糖提取率持續(xù)增大，多糖提取率為16.10 ～ 28.00 mg·g-1。超聲功率為300 W 時，多糖提取率達最大值，為28.00 mg·g-1。超聲功率 ＞ 300 W 時，隨著超聲功率的增大，雜質(zhì)溶出，溶液黏度增大，降低了多糖類物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致多糖提取率降低，其提取率下降至22.00 mg·g-1。因此，銀杏葉多糖最佳超聲功率為300 W。

圖11 超聲功率對銀杏葉多糖提取率的影響Fig.11 Effect of ultrasonic power on the extraction of polysaccharide from leaves of Ginkgo biloba

3.3.2.3 超聲溫度對銀杏葉多糖提取率的影響

超聲溫度對銀杏葉多糖的影響見圖12。溫度影響分子擴散，隨著提取溫度的升高，分子運動加快。因此，溫度的升高加快了溶劑分子在細(xì)胞內(nèi)的運動。超聲溫度在20～60℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，多糖提取率不斷增大，當(dāng)溫度達到60℃時，多糖提取率為32.60 mg·g-1。因此，選取超聲溫度為60℃進行銀杏葉多糖提取。

3.3.3 正交實驗分析

由表4 銀杏葉多糖提取率極差可知，超聲波輔助提取銀杏葉多糖，各因素對銀杏葉中多糖提取影響由大到小排列依次為為A（超聲時間） ＞ C（超聲溫度） ＞ B（超聲功率）。正交試驗最優(yōu)組合為A2B1C2，在此工藝條件下，銀杏葉多糖的提取率平均值為48.98 mg·g-1，提取率均高于其他正交試驗，因此，銀杏葉多糖最佳提取工藝為即超聲時間40 min、超聲功率為200 W、超聲溫度為50℃。

表4 銀杏葉多糖超聲提取工藝優(yōu)化正交實驗Tab.4 Orthogonal design of optimization of ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from leaves of Ginkgo biloba

4 討論

銀杏葉有效成分包括黃酮類、多糖類等活性物質(zhì)，具有保護神經(jīng)系統(tǒng)、改變血液流變學(xué)、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等生物活性。因此，開展提高黃酮含量及多糖含量以利用銀杏葉藥用價值為目標(biāo)的提取工藝優(yōu)化具有重要現(xiàn)實意義。以銀杏葉為原料，結(jié)合超聲波輔助提取法，利用單因素試驗及正交試驗研究不同因素對銀杏葉黃酮及多糖提取率的影響以確定銀杏葉最佳黃酮及多糖提取工藝條件，建立了銀杏葉黃酮及多糖有效成分超聲波輔助提取工藝。研究結(jié)果表明，銀杏葉黃酮提取時，料液比為1 ∶ 20 g·mL-1、提取溶劑為95%乙醇、超聲時間為60 min 及超聲功率為300 W 時，黃酮的提取率為37.50 mg·g-1， 提取率最大。超聲波輔助提取銀杏葉多糖時，其最佳提取工藝為超聲時間40 min、超聲功率200 W 及超聲溫度50 ℃，在此條件下，銀杏葉多糖提取率為48.98 mg·g-1。銀杏葉易于獲得，且其黃酮類化合物和多糖含量較高，對其提取工藝進行優(yōu)化，可為銀杏葉相關(guān)保健產(chǎn)品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。