沙小梅，晏儂洋，陳文美，謝作樺，蘆 玲

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；2.江西德上制藥股份有限公司，江西 宜春 331208）

明膠是一種從動物的皮膚、骨骼和結(jié)締組織中提取的天然親水膠體高分子材料[1]，主要來源于哺乳動物豬和牛，其中，在歐洲約80%的食用明膠是以豬皮為原材料制備而來[2]。明膠具有熱可逆凝膠性、乳化性、起泡性、成膜性等多種性質(zhì)，可作為增稠劑、穩(wěn)定劑、固化劑、澄清劑、保水劑和黏合劑應(yīng)用于食品、藥品和保健產(chǎn)品中。

隨著口蹄疫等疫情的爆發(fā)，豬明膠的安全引起了公眾的關(guān)注[3]。此外，在一些特定的商業(yè)食品包裝上，需明確標(biāo)明不含豬源性成分[4]。因此，有必要開發(fā)一種能夠準(zhǔn)確鑒別明膠物種來源的分析方法[5]。近年來，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）因其相對快速和簡單的特性，被頻繁用于哺乳動物明膠來源的檢測[6-7]。但是，ELISA容易與基質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果[8]。同時(shí)，因明膠提取常需用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等條件處理，易破化原有的DNA樣本，導(dǎo)致PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確度降低[9]。因此，上述技術(shù)難以確保明膠鑒定的準(zhǔn)確性。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術(shù)可檢測明膠酶解后的特征性多肽，是一種準(zhǔn)確鑒別明膠來源的方法[10]。同時(shí)，研究結(jié)果表明，HPLC-MS/MS在明膠鑒定方面比ELISA和PCR更準(zhǔn)確[5]。

提取條件會顯著影響明膠的理化性質(zhì)，生產(chǎn)過程中可通過控制明膠的提取參數(shù)以提高其品質(zhì)[11]。其中，提取pH值是決定明膠性質(zhì)的主要因素之一[12]。用酸、堿或二者結(jié)合對原料進(jìn)行預(yù)處理會影響明膠的蛋白組成[13]，可能會影響明膠的鑒定。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，提取pH值會影響魚明膠的膠融溫度、凝膠溫度和黏度等特性[14]，但是不同提取pH值對豬皮明膠凝膠特性和特征性多肽鑒定的影響有待進(jìn)一步研究。

鑒于商業(yè)生產(chǎn)的豬皮明膠是通過酸處理而獲得的A型明膠[15]，為細(xì)化明膠的提取pH值，本實(shí)驗(yàn)在pH 1、3、5、7條件下分別提取豬皮明膠。應(yīng)用質(zhì)構(gòu)儀和流變儀測定凝膠強(qiáng)度、膠融溫度和凝膠溫度等豬皮明膠的凝膠特性，探究不同提取pH值條件對豬皮明膠凝膠特性產(chǎn)生的影響，為高品質(zhì)豬皮明膠的制備提供參考。同時(shí)，應(yīng)用HPLC-MS/MS研究不同提取pH值對豬皮明膠鑒定效果的影響，探尋不隨pH值變化的豬皮明膠特征性多肽，并將其與本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的豬皮明膠共有特征性多肽進(jìn)行比對，進(jìn)一步探究穩(wěn)定存在于多種提取條件中的特征性多肽，為豬皮明膠精準(zhǔn)鑒定提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬皮 正邦集團(tuán)；胰蛋白酶（酶活力19 385 U/mg）美國Promega公司；蛋白分子質(zhì)量Marker（分子質(zhì)量范圍10～245 kDa） 美國Thermo Scientific公司；鹽酸、異丙醇、無水乙醇、NaOH 西隴科學(xué)股份有限公司；Tris-HCl緩沖液（pH 6.8和8.8）、考馬斯亮藍(lán)R-250 北京索萊寶科技有限公司；SDS 天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他所用試劑均屬于分析純或以上。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；FA1104N型電子分析天平 上海丙林電子科技有限公司；Seven Compact臺式pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BIO-RAD型電泳儀 美國Bio-Rad公司；Q Exactive型質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；LGJ-1型冷凍干燥機(jī) 北京亞泰科隆儀器有限公司；MCR 302型剪切應(yīng)力控制流變儀 奧地利Anton Paar公司。

1.3 方法

1.3.1 豬皮明膠樣品制備

參照Nagarajan等[16]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。鮮豬皮切去油脂等肥膩部分，洗凈后切成1 cm×1 cm小塊，加入異丙醇浸泡脫脂過夜。將浸泡過夜后的豬皮使用清水沖洗，而后用無水乙醇按照料液比1∶3（g/mL）浸泡豬皮10 min除去其中殘存的異丙醇，再用清水洗凈豬皮直至無異味。將豬皮按照料液比1∶10（g/mL）浸泡于0.1 mol/L NaOH溶液中，在15～20 ℃條件下磁力攪拌2 h，每40 min更換一次稀堿溶液。將處理后的豬皮洗至中性，按照料液比1∶10（g/mL）加入0.1 mol/L鹽酸，在15～20 ℃條件下攪拌2 h，每隔1 h更換酸液，浸泡完沖洗豬皮至中性。將處理后的豬皮按照料液比1∶3（g/mL）加入到超純水中，將pH值分別調(diào)至1、3、5、7，置于55 ℃水浴鍋中加熱12 h。提膠完成后調(diào)節(jié)pH值至中性，抽濾除去豬皮殘?jiān)?，將所得濾液進(jìn)行收集，凍干，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 凝膠強(qiáng)度測試

參照Tu Zongcai等[17]的方法測量，并適當(dāng)修改。配制6.67 mg/mL的明膠溶液，取15 mL倒入25 mL的小燒杯中（膠體為33 mm×22 mm），每個(gè)樣品設(shè)置3 組平行，置于4 ℃冷藏18 h，取出使用質(zhì)構(gòu)分析儀測定膠體的凝膠強(qiáng)度。設(shè)定參數(shù)如下：探頭P/0.5R，測試速率1 mm/s，凝膠強(qiáng)度即為探頭下壓明膠4 mm所承受的最大壓力。

1.3.3 流變學(xué)測試

參考Tu Zongcai等[17]的方法，使用流變儀測量明膠的凝膠-融膠轉(zhuǎn)變溫度，將溶液先從45 ℃降溫至5 ℃，再從5 ℃升溫至45 ℃，加熱/冷卻速率為0.5 ℃/min，測量在0.5%應(yīng)變和1 Hz頻率下進(jìn)行。

1.3.4 豬皮明膠酶解

參考課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法對豬皮明膠進(jìn)行酶解[18-19]。將約3 mg的豬皮明膠溶解在SDT緩沖液（含4%SDS、1 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中，煮沸3 min后在冰上進(jìn)行超聲波勻漿處理。粗提物25 ℃、16 000×g離心10 min，取250 μg上清液與200 μL尿素緩沖液（含8 mol/L尿素和150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）混合，通過超濾以去除DTT等低分子質(zhì)量組分。收集濃縮液后，再重復(fù)一次上述混合和離心操作。用尿素緩沖液配制50 mmol/L的碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）并取100 μL與濃縮液混合，室溫避光20 min，離心15 min。之后向濃縮液中加100 μL尿素緩沖液離心，重復(fù)3 次。然后，將濃縮液與100 μL 25 mmol/L NH4HCO3混合，再次離心濃縮，重復(fù)這個(gè)操作2 次?；旌献罱K得到的濃縮物與40 μL 25 mmol/L含3 μg胰蛋白酶的NH4HCO3，在37 ℃孵育過夜，以濾液的形式收集肽。

1.3.5 HPLC-MS/MS檢測

將酶解后的肽段用Easy nLC-Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，液相色譜流動相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為84%乙腈溶液（含0.1%甲酸）。樣品由自動進(jìn)樣器上樣到C18反相色譜柱，以250 nL/min的流速經(jīng)色譜柱分離，樣品洗脫60 min，流動相A線性梯度變化為流動相B。在數(shù)據(jù)依賴采集模式下采集豐度最高的10 個(gè)母離子，獲得其一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過高能碰撞誘導(dǎo)解離（high-energy collision-induced dissociation，HCD）獲得二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將數(shù)據(jù)庫設(shè)置為豬膠原蛋白數(shù)據(jù)庫，采用MASCOT軟件（Matrix Science，London，UK；version 2.2）與所獲得的質(zhì)譜圖進(jìn)行匹配分析。檢索參數(shù)包括：氧化（K、M、P）為可變修飾；半胱氨酸碘乙酰胺化（C）為固定修飾；最大漏切位點(diǎn)數(shù)為2；一級質(zhì)譜錯(cuò)誤率為±0.02‰；二級質(zhì)譜錯(cuò)誤率為±0.1 Da。當(dāng)Mascot分?jǐn)?shù)大于40時(shí)，多肽峰被認(rèn)定為陽性鑒定或準(zhǔn)確度極高（P＜0.05）[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取pH值對豬皮明膠分子質(zhì)量分布的影響

哺乳動物明膠的分子質(zhì)量分布較寬且具有典型的明膠分子質(zhì)量分布圖，包括清晰的α鏈條帶（α1和α2）、β鏈條帶（即α鏈二聚體）和高分子質(zhì)量聚合物（high molecular weight polymers，HMWP）條帶[21]。提取pH值對豬皮明膠分子質(zhì)量分布的影響結(jié)果如圖1A所示，當(dāng)pH值為3、5、7時(shí)，豬皮明膠呈現(xiàn)了典型的明膠分子質(zhì)量分布圖，即保留了α1鏈、α2鏈、β鏈和HMWP條帶，且提取pH 5時(shí)條帶最為清晰，提取pH值為1時(shí)未出現(xiàn)明顯的上述典型條帶且蛋白組分集中分布在低分子質(zhì)量條帶區(qū)域。在pH 3、5和7時(shí)，提取的豬皮明膠在α1鏈和β鏈之間具有連續(xù)分布的輕微降解帶，在α2鏈條帶下方存在低分子質(zhì)量條帶（＜α2鏈）。相較于pH 5時(shí)提取的豬皮明膠，pH 3樣品的低分子質(zhì)量條帶含量更多，這可能是因?yàn)樘崛H值下降，加劇了豬膠原蛋白的解聚，從而低分子質(zhì)量組分增加。當(dāng)明膠提取pH值為7時(shí)，觀察到另一蛋白降解條帶（～135 kDa），可能是處于中性環(huán)境中提取明膠時(shí)膠原蛋白水解程度降低產(chǎn)生的。結(jié)果表明，pH值在控制所提取的豬皮明膠的分子質(zhì)量分布方面起關(guān)鍵作用。并且前人研究結(jié)果表明，明膠的分子質(zhì)量分布會在一定程度上影響其凝膠特性[14,22]，可能也會對明膠的溯源產(chǎn)生影響，這將會在后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行詳細(xì)的分析。

圖1 提取pH值對豬皮明膠分子質(zhì)量分布（A）、凝膠強(qiáng)度（B）的影響Fig.1 Effect of extraction pH on molecular mass distribution (A) and gelling strength (B) of porcine skin gelatin

2.2 提取pH值對豬皮明膠凝膠強(qiáng)度的影響

凝膠強(qiáng)度是考量明膠性能的重要指標(biāo)，顯著影響其實(shí)際應(yīng)用[23]。如圖1B所示，當(dāng)提取pH值為1、3、5、7時(shí)，豬皮明膠凝膠強(qiáng)度分別為242.78、850.13、901.43、997.51 g。課題組前期研究結(jié)果顯示，當(dāng)提取溫度為55～75 ℃，豬皮明膠凝膠強(qiáng)度在717.36～183.55 g之間，其數(shù)值與提取溫度有關(guān)[24]。此外，Hu Zizi等[25]報(bào)道顯示羅非魚明膠的凝膠強(qiáng)度高于600 g，商業(yè)豬皮明膠凝膠強(qiáng)度為779.77 g。對比上述研究可知，當(dāng)提取pH值在3～7之間，豬皮明膠具有良好的凝膠強(qiáng)度，可在工業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用。

提取pH值能顯著影響豬皮明膠凝膠強(qiáng)度（圖1B），即凝膠強(qiáng)度隨著提取pH值的升高而升高。本實(shí)驗(yàn)的變化趨勢與Cho等[26]的研究結(jié)果類似。豬皮明膠的凝膠強(qiáng)度可能與其分子質(zhì)量變化情況相關(guān)，明膠分子鏈越長，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越強(qiáng)，凝膠強(qiáng)度則會越大[27]。并且，提取過程中使用強(qiáng)酸條件處理會過度水解膠原分子[22]，使得形成凝膠所需的作用力降低，最終導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度降低，所以pH值為1時(shí)提取的豬皮明膠凝膠強(qiáng)度顯著低于其余豬皮明膠的凝膠強(qiáng)度。

課題組前期研究結(jié)果表明分子質(zhì)量分布對鳙魚魚鱗明膠凝膠強(qiáng)度有重要影響[14]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明豬皮明膠的分子質(zhì)量分布和凝膠強(qiáng)度之間存在一定的相關(guān)性。除提取pH 1以外，其他pH值提取的豬皮明膠均有明顯的α鏈、β鏈和HMWP條帶，且pH 5提取的豬皮明膠條帶最為清晰。α鏈、β鏈和高分子質(zhì)量組分有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，進(jìn)而使明膠的凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)[14]。值得說明的是，提取pH值為7時(shí)的豬皮明膠凝膠強(qiáng)度最高，可能是因?yàn)榇藭r(shí)提取pH值接近豬明膠的等電點(diǎn)（7～9.3）[28]，明膠聚合物更接近中性電荷，因此形成了更緊湊、更堅(jiān)硬的凝膠，Cho等[26]也驗(yàn)證了在等電點(diǎn)附近產(chǎn)生的明膠具有較高的凝膠強(qiáng)度。

2.3 提取pH值對豬皮明膠凝膠-融膠轉(zhuǎn)變溫度的影響

如圖2所示，所有的豬皮明膠樣品在凝膠和融膠過程中儲能模量（G’）和損耗模量（G”）均隨著溫度升高而降低，隨著溫度降低而升高。在降溫模式中，豬皮明膠在初始溫度（45 ℃）下，G’和G’的值較低，且G”＞G’，表明此時(shí)明膠分子呈單鏈排列，樣品呈現(xiàn)溶液狀態(tài)；當(dāng)溫度下降到5 ℃時(shí)，G’和G”均急劇增加至保持穩(wěn)定不變，此時(shí)G”＜G’，G’的增加是由三螺旋形成引起，表明了凝膠的形成。在升溫模式中，所有豬皮明膠都顯示出熱可逆行為，隨著溫度的升高，豬皮明膠的三螺旋結(jié)構(gòu)逐漸解聚形成單鏈，其狀態(tài)則由凝膠態(tài)逐漸融化為液態(tài)。

圖2 提取pH值對豬皮明膠凝膠-融膠轉(zhuǎn)變溫度的影響Fig.2 Effect of extraction pH on gel-sol transition temperature of pigskin gelatin

在冷卻和加熱過程中，分別有一個(gè)G’和G”處于平衡的幾何點(diǎn)，冷卻和加熱曲線上的G’和G”交叉點(diǎn)分別定義為凝膠點(diǎn)和膠融點(diǎn)[29]，分別對應(yīng)明膠的凝膠溫度和膠融溫度[30]。本實(shí)驗(yàn)中pH 1、3、5、7提取的豬皮明膠凝膠溫度分別為17.81、27.81、29.06、27.06 ℃，膠融溫度分別為26.17、36.18、39.18、35.93 ℃。隨著提取pH值酸性逐漸減弱，豬皮明膠凝膠溫度和膠融溫度先增高后降低，這與Derkach等[12]的研究結(jié)果趨勢一致。隨著提取環(huán)境中的酸度增加，膠原蛋白的降解加劇，產(chǎn)生的小分子組分相互作用減弱，導(dǎo)致提取pH值為1、3的豬皮明膠凝膠溫度和膠融溫度均低于提取pH 5的明膠樣品。而pH值為7時(shí)提取的豬皮明膠凝膠溫度和膠融溫度低于提取pH 5時(shí)的豬皮明膠，與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sodium sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中提取pH 7的豬皮明膠分子質(zhì)量條帶比提取pH 5的豬皮明膠更淺的結(jié)果一致，說明豬皮明膠的分子質(zhì)量分布情況對膠融溫度、凝膠溫度會產(chǎn)生影響。

2.4 提取pH值對豬皮明膠特征性多肽鑒定的影響

2.4.1 不同pH值提取的豬皮明膠特征性多肽總體分析

在工業(yè)生產(chǎn)中，針對不同的產(chǎn)品需要不同性質(zhì)（如凝膠強(qiáng)度、膠融溫度等）的明膠，控制提取pH值可以獲得性能不同的明膠[31]。然而，提取pH值的變化可能會產(chǎn)生不同的特征性多肽，本研究利用HPLC-MS/MS鑒定不同pH值條件下提取的豬皮明膠特征性多肽，采用Venn圖分析不同豬皮明膠樣品間的相同和差異之處，結(jié)果如圖3A所示。在提取pH值為1、3、5、7的豬皮明膠中分別檢測到62、71、79、76 條特征性多肽。隨著提取環(huán)境酸性的減弱，豬皮明膠樣品的特征性多肽先增多后減少。其中有37 條特征性多肽同時(shí)出現(xiàn)在不同pH值提取的所有明膠樣品中，這些多肽被稱為共有特征性多肽。相應(yīng)地，只在1、2 種或3 種提取pH值情況下檢測到的多肽稱為非共有特征性多肽，提取pH值為1、3、5、7的豬皮明膠分別有25、34、42、39 條非共有特征性多肽。明膠中含有豐富的氨基酸修飾，包括脯氨酸殘基的羥基化等情況[2]。為研究提取pH值對原始氨基酸序列裂解差異的影響，通過去除豬皮明膠的氨基酸修飾，以序列中氨基酸位置為橫坐標(biāo)，比較不同pH值提取的豬皮明膠特征性多肽分布情況。如圖3B、C所示，在所有豬皮明膠中，α2鏈均比α1鏈擁有更多的斷裂片段。本課題組之前的研究表明，豬和牛膠原蛋白中α1和α2鏈肽的相似度分別為95.9%和95.3%[32]。此外，Zhang Guifeng等[3]也報(bào)道了豬與牛膠原蛋白之間α1鏈的同源性高于α2鏈。因此，相似性閾值的差異可能有助于鑒定出更多豬皮明膠α2鏈中的特征性多肽。同時(shí)，當(dāng)提取環(huán)境由中性向酸性變化，兩條鏈的斷裂片段數(shù)目整體上趨勢是先增加后減少，說明提取環(huán)境酸性程度增強(qiáng)會導(dǎo)致豬明膠的α1和α2鏈出現(xiàn)不同程度的降解或出現(xiàn)新的序列片段。極端的酸性環(huán)境可能會加劇明膠水解導(dǎo)致更多低分子質(zhì)量肽的片段出現(xiàn)或完全水解碎片分子至其失去特征性，例如可以觀察到在pH 1條件下提取的豬皮明膠的斷裂片段明顯少于前3 組樣品且片段多以為短片段為主。

圖3 不同pH值條件下提取的豬皮明膠特征性多肽的Venn分析及片段分布Fig.3 Venn analysis and fragment distribution of characteristic peptides of porcine skin gelatin extracted under different pH conditions

2.4.2 不同pH值提取的豬皮明膠非共有特征性多肽分析

正如預(yù)期的那樣，在豬皮明膠樣品中觀察到許多非共有特征性多肽（圖3A）。在提取pH值為1、3、5、7的豬皮明膠樣品中，分別檢測到26、34、42、39 條非共有特征性多肽。其中，分別有9、12、12、13 條特征性多肽僅單獨(dú)存在于pH值為1、3、5、7的豬皮明膠中。同時(shí)存在于兩種pH值提取的豬皮明膠非共有特征性多肽情況有6 種，包括提取pH 1 & pH 3、p H 1 & p H 5、p H 1 & p H 7、p H 3 & p H 5、pH 3 & pH 7、pH 5 & pH 7，它們分別共同擁有1、6、3、6、3、4 條特征性多肽。其中，pH 5提取的明膠與其他3 組明膠樣品擁有的共同特征性多肽較多，可能因?yàn)閜H 5適合用于豬皮明膠的提取，該條件下檢測到的明膠特征性多肽最多導(dǎo)致Venn圖重疊率較高。與此同時(shí)，在3 種提取pH值中同時(shí)存在的特征性多肽有4 種情況，其中pH 1 & pH 3 & pH 7、pH 1 & pH 5 & pH 7、pH 3 & pH 5 & pH 7的共同特征性多肽數(shù)分別為2、4、10 條，在提取pH 1 & pH 3 & pH 5時(shí)沒有共同的特征性多肽。分析3 種pH值提取明膠的共有特征性多肽時(shí)，不難發(fā)現(xiàn)，共有條件中包含提取pH值為1會導(dǎo)致共同擁有的特征性多肽數(shù)銳減，可能是pH值為1時(shí)提取明膠環(huán)境較為極端，導(dǎo)致膠原蛋白水解程度加劇，形成了更多的短肽，因而與其他的溫和環(huán)境下提取的樣品特征性多肽差異性較大。非共有特征性多肽會隨著提取pH值的變化而變化，即它的存在具有不穩(wěn)定性，因此不可以作為鑒定的識別肽段。

2.4.3 不同pH值提取的豬皮明膠共有特征性多肽分析

如前所述，在所有提取的樣品中，37 條共有特征性多肽被準(zhǔn)確檢測，其中16 條特征性多肽來自α1鏈，21 條特征性多肽來自α2鏈（表1）。上述共有特征性多肽出現(xiàn)在不同pH值提取的豬皮明膠樣品中，不隨提取pH值的變化而變化，在豬皮明膠溯源鑒定中具有重要的參考價(jià)值。

表1 pH值為1、3、5、7時(shí)提取的豬皮明膠的共有特征性多肽Table 1 Common characteristic peptides of porcine skin gelatin extracted at pH 1, 3, 5, and 7

這些共有特征性多肽可以被分為兩類，第1類是未修飾的特征性多肽，在3 7 條共有特征性多肽中，觀察到6 個(gè)未經(jīng)修飾的特征性多肽，其中3 條來自α1鏈，3 條來自α2鏈。α1鏈未修飾的共有特征性多肽分別為174SAGISVPGPMGPSGPR189、784G E T G P S G P A G P T G A R798、1052GETGPAGPAGPVGPVGAR1069，α2鏈中未修飾的共有特征性多肽分別是85GVGAGPGPMGLMGPR99、676G A P G A V G A P G P A G A N G D R693、831TGETGASGPPGFAGEK846。由于這些未修飾的共有特征性多肽易于識別和匹配碎片離子，因此在豬皮明膠的鑒定中具有重要的應(yīng)用前景。第2類是包含修飾情況的共有特征性多肽，共鑒定出31 個(gè)含脯氨酸羥基化修飾的共同特征性多肽，其中13 條來自α1鏈、18 條來自α2鏈。值得說明的是，在各類修飾情況中，存在序列相同但修飾程度不同的特征性多肽片段，又可分為不同數(shù)量的羥基化修飾位點(diǎn)和相同修飾數(shù)量但不同修飾位置2 種類型，這些復(fù)雜修飾加劇了準(zhǔn)確識別肽段序列的困難。例如，從1022GESGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGK1047中準(zhǔn)確地找到了4 個(gè)質(zhì)譜峰，分別具有1、2、3、4 個(gè)脯氨酸羥基化修飾位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選取擁有脯氨酸羥基化位點(diǎn)最多（含4 個(gè)脯氨酸羥基化修飾位點(diǎn)）的1022GESGPAG*PPG A*PGA*PGA*PGPVGPAGK1047肽段進(jìn)行舉例說明，此條特征性多肽的實(shí)際相對分子質(zhì)量與理論相對分子質(zhì)量（2 170.029 1）匹配良好，誤差僅為0.003 83‰。如圖4A所示，HCD碎裂產(chǎn)生的y和b系列離子準(zhǔn)確地證明了此特征性多肽的序列和修飾，Pro1029、Pro1033、Pro1036和Pro1039的羥基化位點(diǎn)可分別被y18-y17、y15-y14、y12-y11和y9-y8離子證明。復(fù)雜的氨基酸殘基修飾將會顯著增加明膠鑒定的難度，Zhang Guifeng等[3]指出，由脯氨酸羥基化引起的質(zhì)量轉(zhuǎn)移可能與一些氨基酸殘基的質(zhì)量差異相混淆，如羥脯氨酸和亮氨酸殘基。而高分辨率質(zhì)譜可以較好地克服以上問題，并顯著提高識別特征性多肽的準(zhǔn)確性。例如，Kleinnijenhuis等[9]研究顯示，Orbitrap分析儀可以提供高分辨率，輕松識別羥脯氨酸和亮氨酸殘基之間的細(xì)微差別。Orbitrap質(zhì)量分析器能夠使得一級質(zhì)譜峰m/z200分辨率達(dá)到70 000，HCD二級質(zhì)譜圖中m/z200分辨率達(dá)到17 500，這種高分辨率的測量結(jié)果使豬皮明膠特征性多肽的鑒定具有很高的準(zhǔn)確性。

圖4 豬皮明膠特征性多肽的二級質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary mass spectra of characteristic peptides of porcine skin gelatin

2.5 豬皮明膠共有特征性多肽的對比分析

本課題組前期研究表明，提取溫度、時(shí)間以及提取批次會對豬皮明膠特征性多肽的鑒定產(chǎn)生顯著影響，并且確定了不隨提取次數(shù)、溫度、時(shí)間變化的共有特征性多肽[2,24,33]。為進(jìn)一步探究不隨提取條件變化而改變的穩(wěn)定共有特征性多肽，對不同pH值、溫度、時(shí)間和多階段提取過程下制備的豬皮明膠特征性多肽進(jìn)行了對比分析，以建立更準(zhǔn)確的豬皮明膠特征性多肽數(shù)據(jù)庫。

如表2所示，通過比較4 種不同條件提取的豬明膠特征性多肽，共得到17 條共有特征性多肽，包括7 條α1鏈肽和10 條α2鏈肽。這些共有特征性多肽穩(wěn)定存在于不同提取條件（如提取溫度、pH值、次數(shù)）得到的豬皮明膠酶解物中，說明它們具有良好的穩(wěn)定性。因此，這些特征性多肽可以為豬明膠的鑒定提供重要的數(shù)據(jù)支撐。以往的文獻(xiàn)也報(bào)道了一些豬明膠的特征性多肽，例如，Kleinnijenhuis等[9]鑒定出了特征性多肽574GI*PGEFGL*PGPAGPR588（*P表示脯氨酸羥基化），本研究也檢測到了該特征性多肽（表2）。此外，Grundy等[5]從豬明膠中發(fā)現(xiàn)了5 種特征性多肽。其中，有4 條特征性多肽出現(xiàn)在最終的共有特征性多肽表中，包括920GS*PGADGPAGA*PGTPGPQGIAGQR943（α1）、1052G E T G PA G PA G P V G P V G A R1069（α1）、592G*PPGESGAAGPAGPIGSR609（α2）、979GEPGPAGSVGPAGAVGPR996（α2）（沒有展示脯氨酸羥基化的修飾）。同樣，Cheng Xianlong等[34]檢測到了m/z為925.432 612＋的片段451GEPGPTGVQGPPGPAGEEGK470（α1），該片段在不同提取pH值處理中被保留（表2），但在不同提取溫度處理中不穩(wěn)定[24]，這可能是由于兩種方法的提取條件不同造成的。因此，為了提高豬明膠鑒定的準(zhǔn)確性，需要對質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行逐一匹配，盡可能多地探索共有特征性多肽。

表2 不同條件提取的豬皮明膠的共有特征性多肽Table 2 Common characteristic peptides of porcine skin gelatin extracted under different conditions

在1 7 條共有特征性多肽中， 未經(jīng)修飾的共有特征性多肽有2 條， 分別是來自α1鏈的1052G E T G PA G PA G P V G P V G A R1069和來自α2鏈的979GEPGPAGSVGPAGAVGPR996，圖4B、C中MS/MS產(chǎn)生的一系列y離子和b離子證實(shí)了上述多肽序列的正確性。這些未經(jīng)修飾的特征性多肽易識別、干擾少，對豬皮明膠的實(shí)際鑒定具有十分重要的意義。此外，為了方便起見，表2中列出了共有特征性多肽價(jià)態(tài)為＋1、＋2、＋3、＋4時(shí)對應(yīng)的理論m/z值，以幫助后續(xù)實(shí)際應(yīng)用過程中特異性多肽的快速識別。

3 結(jié) 論

提取pH值顯著影響豬皮明膠的分子質(zhì)量分布、凝膠性能和鑒定效果。當(dāng)提取pH值由7降低到1時(shí)，凝膠強(qiáng)度從997.51 g降低到242.78 g，膠融溫度由35.93 ℃降低到26.17 ℃，凝膠溫度也從27.06 ℃顯著降低到17.81 ℃。同時(shí)，SDS-PAGE結(jié)果表明，α鏈、β鏈和高分子質(zhì)量組分的含量在酸作用下略有下降，提取pH 5時(shí)豬皮明膠條帶最為清晰，pH 1時(shí)豬皮明膠沒有出現(xiàn)上述典型條帶。HPLC-MS/MS結(jié)果顯示從提取pH值為1、3、5、7的豬皮明膠中分別鑒定出62、71、79、76 條特征性多肽，其中有37 條共有特征性多肽。此外，進(jìn)一步與其他提取條件（溫度、時(shí)間、提取次數(shù)）下豬皮明膠的特征性多肽進(jìn)行對比，獲得了17 條共有特征性多肽，它們在不同條件下提取的豬皮明膠中均可被鑒定出，具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，可作為豬皮明膠溯源的重要依據(jù)。后續(xù)可進(jìn)一步探究這些特征性多肽在食品加工過程中的穩(wěn)定性，以提高豬皮明膠溯源鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。