韋瑤，張瑞門，安強(qiáng)，王樂(lè)怡，張永旺，鄒超霞，張爾康，莫碧云，石德順，楊素芳，鄧彥飛，韋英明

CircCEP85L對(duì)牛肌肉干細(xì)胞增殖、成肌分化的調(diào)控

韋瑤1，張瑞門1，安強(qiáng)1，王樂(lè)怡1，張永旺1，鄒超霞1，張爾康1，莫碧云2，石德順1，楊素芳1，鄧彥飛，韋英明

1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；2欽州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西欽州 535099；3廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，南寧 530004

【目的】目前，越來(lái)越多的研究證明環(huán)狀RNA（circRNA）在牛肌肉發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色，但其分子調(diào)控機(jī)理尚未完善。通過(guò)挖掘與牛肌肉發(fā)育相關(guān)的circRNA的作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明其調(diào)控牛肌肉發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳郧捌诜治龅脑鲋称?GM)與成肌分化期（DM）黃牛肌肉干細(xì)胞（MuSCs）的RNA-seq測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，篩選出顯著差異表達(dá)的circRNA，circCEP85L。采集新鮮黃牛胎牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腸和胃的組織樣本，分離培養(yǎng)黃牛肌肉干細(xì)胞并誘導(dǎo)成肌分化，收集黃牛體外培養(yǎng)的GM與DM細(xì)胞，分別提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）檢測(cè)circCEP85L在不同組織及不同細(xì)胞狀態(tài)的表達(dá)規(guī)律。同時(shí)，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增circCEP85L全長(zhǎng)，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體p-circCEP85L，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MuSCs后收集過(guò)表達(dá)circCEP85L細(xì)胞樣本。以過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCD5-ciR細(xì)胞樣本為對(duì)照，采用qRT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot及免疫熒光等技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)黃牛MuSCs增殖、凋亡及成肌分化的影響?！窘Y(jié)果】PCR電泳結(jié)果證明circCEP85L環(huán)化位點(diǎn)真實(shí)存在。CircCEP85L在多種組織中表達(dá)，并在DM期的表達(dá)量顯著高于GM期（＜0.001）；為了進(jìn)一步探究對(duì)circCEP85L黃牛MuSCs的影響。將過(guò)表達(dá)載體p-circCEP85L與對(duì)照載體pCD5-ciR轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的黃牛MuSCs，繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，EdU結(jié)果表明過(guò)表達(dá)circCEP85L能顯著降低EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（＜0.001）；流式周期檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)circCEP85L增加了G0/G1期細(xì)胞比例，顯著減少S期細(xì)胞比例（＜0.001）；流式凋亡結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)circCEP85L顯著抑制MuSCs的凋亡率（＜0.05）。QRT-PCR及Western blot檢測(cè)黃牛MuSCs增殖及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況,結(jié)果表明過(guò)表達(dá)circCEP85L后顯著降低了黃牛MuSCs增殖及凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平（＜0.001）,凋亡蛋白BAX的表達(dá)量也顯著降低（＜0.01）。此外，為了檢測(cè)過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)黃牛MuSCs成肌分化的影響，在轉(zhuǎn)染24h后更換分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化，Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)circCEP85L后顯著促進(jìn)分化標(biāo)志基因的表達(dá)水平（＜0.001），細(xì)胞融合形成肌管的數(shù)量和大小均顯著高于對(duì)照組?！窘Y(jié)論】研究表明，circCEP85L通過(guò)抑制黃牛MuSCs增殖和凋亡、促進(jìn)細(xì)胞成肌分化，從而影響黃牛骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，為circRNA調(diào)控黃牛骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

circCEP85L；肌肉干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；成肌分化

0 引言

【研究意義】骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育與牲畜的產(chǎn)肉量密切相關(guān)，它的發(fā)育受許多基因、轉(zhuǎn)錄因子及一些非編碼RNA（ncRNA）的調(diào)控[1-4]。最新的研究表明circRNA在骨骼肌細(xì)胞增殖、成肌分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，研究動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)circRNA的調(diào)控機(jī)制對(duì)于促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】circRNA是不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA分子[5]。circRNA最初是通過(guò)電子顯微鏡在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)的[6]，長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是沒(méi)有功能的RNA分子。隨著生物學(xué)的快速發(fā)展，circRNA在腦、心臟、骨骼肌等許多組織中被發(fā)現(xiàn)[7]，具有高度的保守性和穩(wěn)定性。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)circRNA以多種方式參與調(diào)控動(dòng)物骨骼肌的發(fā)育。首先，作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）發(fā)揮作用，如circZfp609通過(guò)吸附miR-194-5p調(diào)節(jié)小鼠成肌細(xì)胞分化[8]；CDR1as通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7促進(jìn)山羊骨骼肌的發(fā)育[9]；circHIPK3、circFGFR2和circSVIL通過(guò)吸附miRNA促進(jìn)雞骨骼肌的發(fā)育[10-12]；circTUT7可作為miR-30a海綿調(diào)節(jié)豬骨骼肌的發(fā)育[13]; circMYBPC1、circRILPL1和circTTN等[14-18]結(jié)合miRNA參與牛骨骼肌的發(fā)育。其次，circRNA能與特定的RNA結(jié)合蛋白（RBP）結(jié)合進(jìn)而調(diào)控RBP及目的分子的作用，如circ-FOXO3可以和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（）與形成circ-FOXO3-CDK2-P21三元復(fù)合物，從而抑制細(xì)胞周期[19]。此外，circRNA可編碼蛋白質(zhì)，如circ- ZNF609可翻譯成微肽并在肌生成中發(fā)揮作用[20]。以上研究表明，circRNA在調(diào)控肌肉發(fā)育方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。【本研究切入點(diǎn)】目前circRNA在癌癥、腫瘤和其他醫(yī)學(xué)方面的研究較為廣泛，但在黃牛肌肉發(fā)育方面的研究鮮見報(bào)道，其調(diào)控機(jī)制尚不完善。在之前的一項(xiàng)研究中，黃牛肌肉干細(xì)胞（MuSCs）增殖、成肌分化的circRNA表達(dá)譜已經(jīng)被揭示[17]，本研究從中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的circRNA，circCEP85L可能對(duì)MuSCs有關(guān)鍵的調(diào)控作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】進(jìn)一步探究circCEP85L的表達(dá)特征及其對(duì)黃牛MuSCs的功能影響，為后續(xù)深入研究circCEP85L在黃牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2022年4—9月在廣西大學(xué)廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

胚胎期（3月齡）的黃牛胎兒來(lái)源于廣西南寧市屠宰場(chǎng)、欽州市欽北區(qū)嘉德富肉牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社。收集肌肉、肝臟、心臟、肺臟、腸、腎臟、脾臟和胃組織，并立即投入液氮中冷凍，運(yùn)回到實(shí)驗(yàn)室再將各組織整理后置-80℃保存?zhèn)溆?。大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞、環(huán)狀RNA過(guò)表達(dá)載體pCD5-ciR、內(nèi)切酶（RI和HI）及連接酶均由廣西大學(xué)廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃牛MuSCs的分離、培養(yǎng)和成肌分化 黃牛MuSCs的分離、培養(yǎng)：胚胎期（3月齡）的黃牛胎兒從體內(nèi)取出后，用一次性無(wú)菌袋包裝后在恒溫條件下于2—3 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。將黃牛胎兒用含雙抗（1%青霉素和鏈霉素）的PBS緩沖液沖洗，并用75%酒精擦拭胎兒皮膚表面，眼科剪和鑷子分離出背最長(zhǎng)肌肌肉組織。將組織轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中，用含雙抗的PBS緩沖液漂洗組織塊3次，再放入75%酒精中漂洗20—30 s，隨即將組織塊用含雙抗的PBS緩沖液漂洗3—5次。剔除筋膜后將組織放到小皿中剪碎至1 mm3，采用兩步酶消化法（先0.2%I型膠原蛋白酶消化1 h, 再0.25%胰蛋白酶消化0.5 h）消化后[21]，加入2倍體積的含10%胎牛血清（FBS; Thermo Fisher Scientific, HyClone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM（Gibco, Logan, UT, USA）終止消化；使用70 μm細(xì)胞濾器進(jìn)行過(guò)濾，除去多余的組織塊和其他雜質(zhì)，離心并棄上清；將細(xì)胞鋪至100 mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2 h后取上清液至另一新的培養(yǎng)皿進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。原代細(xì)胞用含10%FBS和雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

黃牛MuSCs傳代培養(yǎng)及成肌分化誘導(dǎo)：當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后，處于增殖狀態(tài)的MuSCs標(biāo)記為GM樣本（n=3），并收集備用；當(dāng)MuSCs長(zhǎng)至90%時(shí)將培養(yǎng)基更換為成肌分化培養(yǎng)基（含2%HS的高糖DMEM）用于細(xì)胞誘導(dǎo)分化，每天更換分化培養(yǎng)基，4 d后收集成肌分化的細(xì)胞并標(biāo)記為DM樣本（n=3）。

1.3.2 總RNA的提取及cDNA的合成 采用Trizol試劑（Vazyme, 南京）提取各樣本的總RNA，并使用ND-100超微量紫外可見分光光度計(jì)（Miulab, 杭州）測(cè)定RNA濃度及純度。將質(zhì)量和濃度檢測(cè)合格的RNA樣品根據(jù)HiScript? Ⅲ RT SuperMix for qPCR試劑盒（Vazyme, 南京）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank基因序列，使用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，具體引物信息如表1所示，均由上海生工生物工程有限公司合成。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme, Nanjing, China）進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。作為內(nèi)參，qRT-PCR采用2-ΔΔt方法計(jì)算。

1.3.4 qRT-PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系為20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA模板（100 ng·μL-1）1 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)[22]。

1.3.5 circCEP85L的鑒定及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 bta_ circ_0003271是來(lái)源于其宿主基因CEP85L，因此命名為circCEP85L，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為657 nt的環(huán)狀RNA。設(shè)計(jì)并合成circCEP85L的全長(zhǎng)序列引物（circCEP85L F：5′CGGAATTCTAATACTTTCAGTGATGTGCAGAG TCAGAGT-3′; circCEP85L R:5′CGGGATCCAGTTGTTCTTACTCAAGAGTTGGAAGATCAG-3′）。擴(kuò)增circCEP85L全長(zhǎng)序列。使用RI和HI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pCD5-ciR載體，酶切產(chǎn)物純化后利用同源重組酶進(jìn)行連接。取10 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化完成后在37℃搖床培養(yǎng)1 h，將菌液于含氨芐抗性的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取10個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液擴(kuò)增，菌液PCR完成后，將能擴(kuò)出circCEP85L的菌液送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。把正確連接的單克隆菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒（天根, 北京）抽提質(zhì)粒，并將載體命名為p-circCEP85L。

表1 qRT-PCR基因引物合成序列

1.3.6 黃牛MuSCs的轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 將細(xì)胞接種于孔板中，細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右時(shí)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（轉(zhuǎn)染試劑ExFect Transfection Reagent（Vazyme, 南京））分別將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒p-circCEP85L和對(duì)照質(zhì)粒pCD5- ciR與轉(zhuǎn)染試劑ExFect Transfection Reagent（Vazyme, 南京）加入高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（每組3個(gè)重復(fù)），室溫孵育15 min，將孵育好的混合物分別加到MuSCs細(xì)胞孔板中并輕輕混勻，12 h后更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度為90%以上時(shí)，使用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)黃牛MuSCs分化。

1.3.7 EdU試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右，分別用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒p-circCEP85L和對(duì)照質(zhì)粒pCD5-ciR轉(zhuǎn)染MuSCs細(xì)胞，12 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后參照銳博EdU試劑盒（RiboBio, 廣州）說(shuō)明書，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育、固定、通透等處理，染色完成后加PBS緩沖液避光保存待用。每個(gè)樣品隨機(jī)選擇3個(gè)視野，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。增殖率=（新增殖的細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目）×100%。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡 在12孔板中接種細(xì)胞，分別用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒p-circCEP85L和對(duì)照質(zhì)粒pCD5-ciR轉(zhuǎn)染黃牛MuSCs細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，Cell Cycle Staining Kit（Multi Sciences, 杭州）試劑盒用來(lái)檢測(cè)不同試驗(yàn)組的細(xì)胞周期分布情況。AnneXin V-FITC/PI Staining Kit（Multi Sciences）試劑盒用來(lái)檢測(cè)黃牛MuSCs細(xì)胞凋亡率。在試劑盒孵育細(xì)胞完成后使用Attune? NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀（Invitrogen, Singapore）檢測(cè)細(xì)胞周期以及凋亡率。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果使用Flow Jo v10（Tree Star, Inc, Ashland, OR）軟件分析。

1.3.9 免疫印跡（Western blot, WB）檢測(cè) 收集細(xì)胞，用含1% PMSF（GenStar, 北京）的RIPA（Beyotime, 上海）裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，用BCA試劑盒（Beyotime, 上海）測(cè)定蛋白濃度，并經(jīng)4×SDS上樣緩沖液（Solarbio? Life Sciences, 北京）變性。提取到的蛋白經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉處理膜，室溫封閉2 h。稀釋一抗PCNA、MyH6、CDK2、BAX、β-Actin（1﹕2 000 Dilution；ABclonal Technology,武漢），稀釋后的一抗與PVDF膜共同在4 ℃孵育過(guò)夜。用1×TPST清洗膜后，再次將PVDF膜與山羊抗兔二抗（1﹕5 000 Dilution；ABclonal Technology）共同室溫孵育2 h。用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理PVDF膜，進(jìn)行曝光和顯影。作為對(duì)照樣本，用ImageJ軟件（National Institutes of Health, Baltimore, MD, USA）分析蛋白灰度值。相對(duì)蛋白表達(dá)量以目的條帶灰度值與條帶的比值表示。

1.3.10 免疫熒光試驗(yàn) 使用4%多聚甲醛固定處理的細(xì)胞30 min，去除4%多聚甲醛后用1%TritonX-100通透處理10 min，1%BSA用來(lái)封閉細(xì)胞，1h后加入兔抗MyH6（1﹕200 Dilution, ABclonal Technology）、PAX7（1﹕200 Dilution, ABclonal Technology），4℃孵育過(guò)夜。PBS清洗后加入山羊抗兔抗體（1﹕100 Dilution, ABclonal Technology），避光室溫孵育1.5 h，最后用10 μg·mL-1DAPI染色10 min，加入少量PBS緩沖液覆蓋細(xì)胞，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇3 個(gè)視野進(jìn)行拍照觀察。

1.3.11 統(tǒng)計(jì)分析 qRT-PCR數(shù)據(jù)使用t檢驗(yàn)評(píng)估組間差異，并使用Prism8.0版（GraphPad Software, USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?！?.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，*＜0.05； **＜0.01；***＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 黃牛MuSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

3月齡黃牛胎兒用于分離MuSCs（圖1-A）；貼壁培養(yǎng)24 h的P1代黃牛MuSCs，呈紡錘形，形態(tài)均一性較好（圖1-B）；對(duì)培養(yǎng)的MuSCs進(jìn)行分化誘導(dǎo)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)4 d細(xì)胞融合產(chǎn)生大量肌管（圖1-C）。細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)P1代黃牛MuSCs中PAX7的表達(dá)情況，結(jié)果顯示MuSCs能表達(dá)其特異性蛋白PAX7（圖1-D），由此說(shuō)明，本研究所分離獲得的細(xì)胞為高純度黃牛MuSCs，可作為后續(xù)研究的試驗(yàn)材料。

A：3月齡黃牛胎兒；B：黃牛MuSCs的增殖期（GM）生長(zhǎng)狀態(tài)；C：黃牛MuSCs的分化期（DM）生長(zhǎng)狀態(tài)；D：細(xì)胞免疫熒光顯示黃牛MuSCs表達(dá)其特異性蛋白PAX7。標(biāo)尺=100/400 μm

2.2 circCEP85L的表達(dá)譜特征

circCEP85L在黃牛胎牛組織中的表達(dá)分析顯示（圖2-A），circCEP85L在各組織中均有表達(dá)，在脾臟中表達(dá)最高，其次是心臟、肌肉、腸、胃、肺臟和腎臟，在肝臟中表達(dá)最低。對(duì)培養(yǎng)的增殖期黃牛MuSCs進(jìn)行分化誘導(dǎo)4 d后收樣，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2-B），circCEP85L在DM期的表達(dá)量極顯著高于GM期（＜0.001）。

A：circCEP85L的組織表達(dá)譜；B：circCEP85L在黃牛MuSCs分化前后的表達(dá)情況。圖表‘a(chǎn)bcd’表示差異的顯著性，首先按照平均值從大到小排列，最大的標(biāo)為'a'，任何不顯著的差異標(biāo)為'a'，直到與之有顯著差異的標(biāo)為'b'（P＜0.05），以此類推；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001, 無(wú)*表示差異不顯著（P＜0.05）。下同

2.3 circCEP85L的鑒定及過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序所得的circCEP85L基因序列，擴(kuò)增circCEP85L全長(zhǎng)序列為657 bp，將circCEP85L全長(zhǎng)克隆到pCD5-ciR，獲得其過(guò)表達(dá)質(zhì)粒p-circCEP85L。circCEP85L基因序列PCR電泳結(jié)果和質(zhì)粒p-circCEP85L電泳鑒定結(jié)果如圖3所示。

M1：Supercoiled DNA ladder marker；Ⅰ：cirCEP85L的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M2：DL2000 Plus DNA marker；Ⅱ：pCD5-ciR質(zhì)粒；Ⅲ：p-circCEP85L質(zhì)粒

2.4 過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)黃牛MuSCs增殖的影響

將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒p-circCEP85L和空白對(duì)照質(zhì)粒pCD5-ciR分別轉(zhuǎn)染黃牛MuSCs，轉(zhuǎn)染48 h后通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證circCEP85L的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示（圖4-A），轉(zhuǎn)染了p-circCEP85L的細(xì)胞中circCEP85L的表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。EdU檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4-B、C），過(guò)表達(dá)circCEP85L極顯著降低EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（＜0.001）；過(guò)表達(dá)circCEP85L在mRNA水平上和蛋白水平上顯著抑制了增殖標(biāo)記基因、的表達(dá)（圖4-D—F）（＜0.001）。此外，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)黃牛MuSCs周期分布的影響，結(jié)果顯示（圖4-G、H），過(guò)表達(dá)circCEP85L增加G0/G1期細(xì)胞比例，顯著減少S期細(xì)胞比例（＜0.001）。表明，過(guò)表達(dá)circCEP85L能夠抑制黃牛MuSCs的增殖。

A：circCEP85L的過(guò)表達(dá)效率；B、C：EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；D：細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA的表達(dá)情況檢測(cè)；E、F：增殖相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況檢測(cè)；G、H：使用流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)估過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。標(biāo)尺=400 μm

2.5 過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)黃牛MuSCs凋亡的影響

檢測(cè)過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)黃牛MuSCs中凋亡相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示（圖5-A—C），過(guò)表達(dá)circCEP85L后使凋亡標(biāo)記基因（、）的mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.001），同時(shí)，凋亡標(biāo)記基因（）的蛋白表達(dá)水平也顯著降低（＜0.01）。此外，通過(guò)細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)一步評(píng)價(jià)過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)MuSCs凋亡的影響，流式凋亡結(jié)果顯示（圖5-D、E），過(guò)表達(dá)circCEP85L在黃牛MuSCs中具有顯著抑制細(xì)胞凋亡的特性（＜0.05）。表明，過(guò)表達(dá)circCEP85L能夠抑制黃牛MuSCs細(xì)胞的凋亡。

A：細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)情況檢測(cè)；B、C：凋亡標(biāo)記基因BAX蛋白的表達(dá)情況檢測(cè)；D、E：使用流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)估過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.6 過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)黃牛MuSCs分化的影響

對(duì)轉(zhuǎn)染pCD5-ciR與p-circCEP85L的黃牛MuSCs進(jìn)行分化誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p-circCEP85L組的肌管數(shù)量及大小高于pCD5-ciR組（圖6-A），且免疫熒光和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化后分化標(biāo)志基因的蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）（圖6-B—D）。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)circCEP85L能夠促進(jìn)黃牛MuSCs的分化。

A：誘導(dǎo)分化4 d后黃牛MuSCs的形態(tài)；B：免疫熒光顯示誘導(dǎo)分化后MyH6的表達(dá)情況；C、D：Western Blot檢測(cè)誘導(dǎo)分化后分化標(biāo)志基因MyH6蛋白表達(dá)情況檢測(cè)，標(biāo)尺=100/400 μm

3 討論

3.1 CircRNA調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育

MuSCs作為骨骼肌的基本形成單位，它通過(guò)成肌分化、相互融合形成肌管以影響骨骼肌的發(fā)育過(guò)程，這個(gè)過(guò)程受到肌肉發(fā)育調(diào)節(jié)因子和調(diào)控通路多層次的精細(xì)調(diào)節(jié)。CircRNA作為一類新型的非編碼RNA已被大量研究證實(shí)在生物過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，同樣也被證實(shí)作為調(diào)控因子參與骨骼肌的發(fā)育過(guò)程[23]。與線性RNA不同，circRNA由于其獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)而具有更高的穩(wěn)定性、抗RNase R和更長(zhǎng)的半衰期等特性，同時(shí)表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)和組織特異性表達(dá)的特征，在不同的組織中表現(xiàn)出不同的功能[24-25]。在肌肉發(fā)育過(guò)程中，雖然已經(jīng)報(bào)道了許多功能性circRNA，但仍有許多未知的circRNA有待發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控機(jī)制尚不明確。筆者根據(jù)前期的測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選出了一個(gè)新的circRNA ——circCEP85L，在MuSCs的DM細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于GM細(xì)胞，表明circCEP85L在DM細(xì)胞中可能發(fā)揮重要的作用。此外，circCEP85L在黃牛不同組織中均有表達(dá)，這提示circCEP85L在黃牛骨骼肌發(fā)育過(guò)程具有潛在的調(diào)控作用。

3.2 CircCEP85L調(diào)控MuSCs的增殖與凋亡

有研究表明circRNA在細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，如circSNX29經(jīng)過(guò)表達(dá)后可以抑制牛成肌細(xì)胞的增殖[26]；circEch1過(guò)表達(dá)促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖[27]；circLMO7增加了成肌細(xì)胞S期的細(xì)胞的數(shù)量，降低了G0/G1期細(xì)胞的比例[28]；circHUWE1和circINSR可以促進(jìn)牛成肌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[29-30]；circ-13267通過(guò)let-7-19/ERBB4通路調(diào)控蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞凋亡[31]。為了探究circCEP85L在MuSCs中的作用，筆者使用EdU初步證實(shí)了過(guò)表達(dá)circCEP85L抑制黃牛MuSCs；通過(guò)qRT-PCR、Western Blot技術(shù)從mRNA、蛋白水平上檢測(cè)增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及凋亡情況進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)circCEP85L抑制黃牛MuSCs增殖和凋亡。

3.3 CircCEP85L對(duì)MuSCs成肌分化的影響

CircRNA除了調(diào)控肌肉細(xì)胞增殖和凋亡，它對(duì)細(xì)胞的分化調(diào)控也發(fā)揮重要作用。circ-CDR1as可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7阻礙下調(diào)來(lái)促進(jìn)山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（SMSCs）分化[9]。小鼠成肌細(xì)胞細(xì)胞系（C2C12）中，circZfp609通過(guò)吸附miR-194-5p以解除對(duì)下游靶基因的抑制作用，并通過(guò)影響和的表達(dá)間接抑制成肌細(xì)胞的分化[8]。此外，circFGFR4是形成的環(huán)狀RNA，它在牛肌肉中高表達(dá)并競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-107調(diào)控Wnt3a的表達(dá)，間接促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的分化[32]。本試驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)circCEP85L后，黃牛MuSCs成肌分化融合形成明顯的肌管，且肌管數(shù)量顯著高于對(duì)照組；分化標(biāo)記基因的蛋白表達(dá)水平也上調(diào)。這表明過(guò)表達(dá)circCEP85L對(duì)黃牛MuSCs的成肌分化具有顯著促進(jìn)作用。

3.4 CircCEP85L可能調(diào)控的下游機(jī)制

CircRNA有多種調(diào)控機(jī)制，包括：調(diào)控其宿主基因的表達(dá)；吸附miRNA；調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白的活性；翻譯短肽發(fā)揮功能；結(jié)合基因啟動(dòng)子影響其轉(zhuǎn)錄。CEP85L基因是circCEP85L的親本基因，circCEP85L可以通過(guò)影響CEP85L基因的轉(zhuǎn)錄從而對(duì)肌肉干細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。同時(shí)，circCEP85L還可以通過(guò)吸附miRNA對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控。另外，circCEP85L也可通過(guò)RNA結(jié)合蛋白進(jìn)而影響下游基因的活性。盡管circCEP85L對(duì)黃牛肌肉干細(xì)胞的作用已明確，但是其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

成功分離了黃牛肌肉干細(xì)胞，根據(jù)之前已有的黃牛circRNA測(cè)序結(jié)果，篩選得到可能存在關(guān)鍵作用的circRNA——circCEP85L，對(duì)其在黃牛胎牛以及黃牛肌肉干細(xì)胞中的表達(dá)特征進(jìn)行了分析，并且證明了circCEP85L是調(diào)控黃牛MuSCs增殖和成肌分化的關(guān)鍵分子，為研究circRNA的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，為肉牛的分子育種新增候選分子靶標(biāo)。

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CircCEP85L Regulates the Proliferation and Myogenic Differentiation of Bovine MuSCs

1State Key Laborator for Conservation and Untilization of Subtropical Agro-bioresources /College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004;2Qinzhou Center for Animal Disease Control and Prevention, Qinzhou 535099, Guangxi;3Research Institute of Agriculture and Animal Husbandry Industry Development, Guangxi University, Nanning 530004

【Objective】At present, studies have proved that circRNA plays important roles in the development of bovine muscle, but its molecular regulation mechanism remain elusive.Screening circRNAs related to bovine muscle development can lay a foundation for further elucidating the molecular mechanism of bovine muscle development.【Method】In this study, RNA-seq sequencing results of proliferating (GM) and myogenic differentiation (DM) yellow bovine muscle stem cells (MuSCs) analyzed in the previous stage were used to screen for significantly differentially expressed circRNA, circCEP85L. Tissue samples of heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, intestine and stomach were collected aseptically from fresh yellow fetal calves, and yellow muscle stem cells were isolated and cultured and induced into myogenic differentiation. GM and DM cells cultured in vitro from yellow calves were collected, RNA was extracted and reverse transcribed into cDNA, respectively. Quantitative real time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression of circCEP85L in different tissues and different cell states. Meanwhile, specific primers were designed to amplify the full length of circCEP85L, and the overexpression vector p-circCEP85L was constructed. The plasmid was transfected into MuSCs and overexpressed circCEP85L cell samples were collected. Using overexpression plasmid pCD5-ciR cell samples as control, qRT-PCR, flow cytometry, Western Blot and immunofluorescence were used to detect the effects of overexpression of circCEP85L on proliferation, apoptosis and myogenic differentiation of yellow bovine MuSCs.【Result】The electrophoresis of PCR product proved the existence of circCEP85L. CircCEP85L was expressed in various tissues, and the expression level in DM stage was significantly higher than that in GM stage (＜0.001). To further investigate the effect on circCEP85L scallion MuSCs. The overexpression vector p-circCEP85L was transfected with the control vector pCD5-ciR in vitro cultured yellow bovine MuSCs and the EdU results showed that overexpression of circCEP85L significantly reduced the proportion of EdU positive cells (＜0.001) after continuing the culture for 24 h. Flow cycle analysis showed that overexpression of circCEP85L increased the proportion of cells in G0/G1 phase and significantly decreased the proportion of cells in S phase (＜0.001). Flow cytometry showed that overexpression of circCEP85L significantly inhibited the apoptosis rate of MuSCs (＜0.05). qRT-PCR and western blot were used to detect the expression of proliferation and apoptosis-related genes in MuSCs, respectively. The results showed that overexpression of circCEP85L significantly reduced the mRNA expression levels of proliferation and apoptosis-related genes in bovine MuSCs (＜0.001), and the expression of apoptotic protein BAX was also significantly reduced (＜0.01). In addition, in order to detect the effect of circCEP85L overexpression on myogenic differentiation of cattle MuSCs, the differentiation medium was replaced 24 hours after transfection to induce cell differentiation. Western blot and immunofluorescence results showed that overexpression of circCEP85L significantly promoted the expression level of differentiation marker gene MyH6 (＜0.001), and the number and size of myotubes formed by cell fusion were significantly higher than those of the control group.【Conclusion】The results of this study indicate that circCEP85L affects the growth and development process of skeletal muscle in cattle by inhibiting the proliferation and apoptosis of MuSCs and promoting myogenic differentiation of cells, which is expected to be a key circRNA for subsequent mechanistic studies to regulate the growth and development process of skeletal muscle in cattle.

circCEP85L; muscle stem cells; cell proliferation; myogenic differentiation

2022-11-01；

2023-05-16

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（nycytxgxcxtd-09-01）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD110010）、廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2021JJD130097）、巴馬縣人才科技計(jì)劃項(xiàng)目（202101263）

韋瑤，E-mail：1612985655@qq.com。通信作者韋英明，E-mail：dkywym@163.com。通信作者鄧彥飛，E-mail：yanfei-dun@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.014

（責(zé)任編輯 林鑒非）