張金龍,閆林杰,贠艷鴿,李云香,介藝澤,陳向東,胡喜貴,周 鋒,郭冉冉,茹振鋼

(1.河南科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院/河南科技學(xué)院小麥中心/河南省雜交小麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南新鄉(xiāng)453003;2.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

骨干親本在農(nóng)作物品種選育過程中發(fā)揮著重要的作用,自新中國(guó)成立到2000年止,我國(guó)大約一半的小麥(TriticumaestivumL.)品種是由16個(gè)骨干親本衍生出來的[1]。百農(nóng)64因其高產(chǎn)、抗病、適應(yīng)性廣,在黃淮麥區(qū)累計(jì)種植533萬hm2,成為黃淮麥區(qū)骨干親本之一,獲得了河南省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。截止2021年,以百農(nóng)64為親本,選育出的優(yōu)良一代衍生品種達(dá)30多個(gè),其中子一代衍生品種百農(nóng)207累計(jì)種植面積約430萬hm2,獲得了河南省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)標(biāo)記在各個(gè)物種中分布廣、易獲得且通量高,已越來越多的用于評(píng)價(jià)骨干親本對(duì)其衍生后代遺傳貢獻(xiàn)。Jiang等[2]利用小麥90K SNP芯片,解析寧麥9號(hào)對(duì)其17個(gè)衍生品種(系)的遺傳貢獻(xiàn),結(jié)果表明,除楊輻麥4號(hào)外,16個(gè)衍生后代與寧麥9號(hào)遺傳相似系數(shù)均超過了0.7。李玉剛等[3]利用SSR和SNP標(biāo)記分析魯麥14對(duì)其衍生品種青農(nóng)2號(hào)的遺傳貢獻(xiàn),SNP芯片結(jié)果顯示魯麥14與青農(nóng)2號(hào)的一致性達(dá)72.55%,高于另一親本煙農(nóng)15,且遺傳貢獻(xiàn)率大于50%的染色體有18對(duì)。白彥明等[4]利用660K SNP芯片分析了4份螞蚱麥、1份小白麥及其136份衍生品種(系)的遺傳多樣性,結(jié)果表明,在小麥三個(gè)基因組中,多態(tài)性最高的為B基因組,在7個(gè)同源群中,多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最多的是第3同源群,供試材料間遺傳多樣性較低,育種家應(yīng)繼續(xù)努力豐富小麥遺傳資源。高 艷等[5]利用小麥55K SNP芯片,分析周麥22及其80個(gè)衍生品種(系)的遺傳多樣性,結(jié)果表明周麥22對(duì)其衍生后代的遺傳貢獻(xiàn)平均為0.658,且衍生系間遺傳多樣性存在差異。

近年來,已經(jīng)開發(fā)了許多特異單鏈寡核苷酸(single strand oligonucleotide,SSON)探針,這種探針可由公司合成、分辨率高、成本低,通過一次熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)能夠清晰地區(qū)分小麥21對(duì)染色體[6-9]。杜海梅等[10]利用5個(gè)單鏈寡核苷酸探針,通過非變性熒光原位雜交(ND-FISH)技術(shù),鑒定了小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系在9個(gè)綿麥37衍生品種中的遺傳傳遞情況,結(jié)果顯示其傳遞率為100%。Wu等[11]利用單鏈寡核苷酸探針套-熒光原位雜交技術(shù)(ONMP-FISH),分析了6個(gè)6VS/6AL易位系材料及其32個(gè)衍生后代品種(系),發(fā)現(xiàn)其中27個(gè)衍生后代含6VS/6AL易位系。Du等[6]開發(fā)了可以清晰地區(qū)分小麥21對(duì)染色體的SSON探針套,Huang等[8]對(duì)該探針套略作修改,利用FISH技術(shù),在373份中國(guó)栽培小麥品種中鑒定出14種染色體結(jié)構(gòu)變異,167種染色體多態(tài)(block)類型,表明SSON探針在小麥及其近緣物種染色體多樣性和結(jié)構(gòu)變異鑒定研究中具有高效性。然而,目前分析骨干親本對(duì)其衍生品種遺傳貢獻(xiàn)的研究主要集中在農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀和分子標(biāo)記水平上,鮮有將SNP芯片和FISH技術(shù)相結(jié)合,同時(shí)從分子和染色體水平揭示骨干親本對(duì)其衍生后代遺傳貢獻(xiàn)的研究。

本研究旨在通過將FISH和小麥55K SNP芯片技術(shù)相結(jié)合,探討百農(nóng)64對(duì)其衍生后代的遺傳貢獻(xiàn),揭示生產(chǎn)上選育新品種過程中對(duì)染色體片段選擇的偏好性,以期為小麥遺傳研究和新品種選育過程中的親本選配提供理論支撐,輔助育種家選育出綜合性狀好的優(yōu)良品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用百農(nóng)64(BN64)及其4個(gè)子一代衍生品種百農(nóng)207(BN207)、百農(nóng)160(BN160)、華育198(HY198)和04中36(04Z36),衍生品種的親本材料周麥11(ZM11)、周麥16(ZM16)、溫麥6號(hào)(WM6)共8份小麥材料為研究對(duì)象。百農(nóng)207來源于雜交組合周麥16/百農(nóng)64,而華育198是從其反交組合百農(nóng)64/周麥16中選育而成;04中36來源于百農(nóng)64/周麥11雜交組合;百農(nóng)160來源于多抗893/溫麥6號(hào)//百農(nóng)64/溫麥6號(hào)。所用試驗(yàn)材料均由河南科技學(xué)院小麥中心提供。

1.2 根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體制片

小麥種子發(fā)根程序參照王丹蕊等[7],根尖分生區(qū)細(xì)胞用纖維素酶和果膠酶酶解,制成懸浮液滴于載玻片上,有絲分裂中期染色體制片程序參照Zhao等[12]和Komuro等[13]。

1.3 寡核苷酸探針和熒光原位雜交

本研究利用的SSON探針和序列參見Huang等[8],分別為TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine,紅色)修飾的pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3和AFA-4,FAM(6-carboxyfluorescein,綠色)修飾的pSc119.2-1和(GAA)10,共8個(gè)SSON探針。探針由南京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司(TSINGKE biological technology,南京)合成。每張制片的探針用量和熒光原位雜交程序見Huang等[8]。

FISH分析后的根尖有絲分裂中期染色體制片在BX51(Olympus,日本)熒光顯微鏡下進(jìn)行鏡檢,通過Coolcube 1攝像系統(tǒng)及Isis核型分析系統(tǒng)(MetaSystems,德國(guó))等攝取染色體FISH核型高清圖像,并進(jìn)行染色體排隊(duì),利用Adobe Photoshop CS6對(duì)各個(gè)品種染色體FISH核型進(jìn)行剪切和排列。每個(gè)試驗(yàn)材料至少選取6粒種子的根尖細(xì)胞進(jìn)行觀察,攝取6～12個(gè)染色體形態(tài)較好的分裂相,從中選取1個(gè)染色體完整且形態(tài)良好的分裂相進(jìn)行核型排隊(duì),少數(shù)試驗(yàn)材料由于部分染色體重疊,選取了兩個(gè)分裂相進(jìn)行染色體排隊(duì)。

1.4 DNA提取和芯片檢測(cè)

取各個(gè)品種幼葉,每個(gè)品種20株混合取樣,采用CTAB法[14]提取葉片基因組DNA,將濃度及純度達(dá)標(biāo)的DNA用于SNP芯片標(biāo)記檢測(cè)。利用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥基因組與基因資源研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的小麥55K SNP芯片,對(duì)供試小麥葉片全基因組DNA進(jìn)行掃描,SNP芯片檢測(cè)在中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

SNP芯片數(shù)據(jù)初步過濾由公司完成,設(shè)置閾值DQC≥0.82 &&CR≥95進(jìn)行SNP位點(diǎn)質(zhì)控,獲得基因型原始數(shù)據(jù)。篩選閾值Best and Recommended=1 &Best Probeset=1 &Conversion Type=Poly High Resolution &call rate≥97的標(biāo)記,得到初步過濾后的基因型數(shù)據(jù);同時(shí)刪除沒有匹配到參考基因組物理位置或匹配到多個(gè)物理位置的SNP標(biāo)記,初步獲得32 498個(gè)分布于小麥21條染色體上有特異位置的SNP位點(diǎn)。

利用Tassel V5.2.81軟件[15](http://www.maizegenetics.net/),去除最小等位基因頻率小于1%的SNP標(biāo)記,共獲得23 323個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析。利用Tassel V5.2.81軟件,設(shè)置檢測(cè)窗口500 bp,步長(zhǎng)100 bp,計(jì)算核苷酸多樣性指數(shù)(nucleotide diversity,Pi)。利用Power marker V3.0 軟件[16]計(jì)算SNP位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(polymorphic information content,PIC)、基因多樣性(gene diversity,D)、主要等位基因頻率(major allele frequency,MAF),同時(shí)計(jì)算供試材料之間Nei1983遺傳距離,基于該遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類樹,使用MEGA V5.02繪制聚類樹。遺傳相似系數(shù)(genetic similarity,GS)采用NTSYSpc V2.10e 軟件計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 百農(nóng)64對(duì)其衍生后代染色體結(jié)構(gòu)變異和多態(tài)性的影響

本研究構(gòu)建了百農(nóng)64、4個(gè)衍生品種及其親本的SSON探針FISH核型(圖1)。與Huang等[8]檢測(cè)到的小麥染色體結(jié)構(gòu)變異相比,百農(nóng)64含臂間倒位perInv6B(圖1箭頭所示),在其衍生品種中僅百農(nóng)207檢測(cè)到了此結(jié)構(gòu)變異,且百農(nóng)207和華育198的6B染色體短臂端部紅色信號(hào)強(qiáng),百農(nóng)64與4個(gè)衍生后代間6B染色體FISH核型均有差異。除百農(nóng)207之外,其他3個(gè)衍生品種都含有小麥-黑麥T1RS/1BL易位,且在親本材料周麥11和周麥16中均鑒定到了此易位系(圖1箭頭所示)。

綠色信號(hào)為FAM修飾的寡核苷酸探針pSc119.2-1和(GAA)10,紅色信號(hào)為TAMRA修飾的寡核苷酸探針pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3和AFA-4,背景為藍(lán)色(DAPI);箭頭所指分別為T1RS/1BL易位系和perInv6B染色體。

分析所研究材料的染色體多態(tài)性(圖2),共鑒定了48種多態(tài)類型(block),B基因組染色體block類型最多,為20種,其次是A基因組有18種,D基因組最少10種(圖2)。不同染色體間block類型也有差異,變異范圍為1～4;1A和6B染色體的block類型最多,有4種;3A、3D、5D、6D和7D最少,只有1種。其衍生后代中,5A染色體中僅百農(nóng)160,5B染色體中僅華育198,1B、7A染色體中僅百農(nóng)207與百農(nóng)64染色體核型相似;1A染色體僅04中36,2D、4B、4D、7B染色體僅百農(nóng)160,2A、6A染色體僅百農(nóng)207與百農(nóng)64不同;百農(nóng)160和04中36的3B染色體與百農(nóng)64不同。

探針顏色同圖1。

用“1”和“0”分別表示每個(gè)小麥品種21對(duì)染色體“是”和“否”為某一種染色體block類型,利用Power marker V3.0 軟件計(jì)算了供試材料間48種染色體block類型的MAF、D和PIC的值(表1),MAF變異范圍為0.500～1.000,平均值為0.797;D值變異范圍為0.000～0.500,平均值為0.289;PIC變異范圍在0.000～0.375 之間,平均值為0.237。

表1 供試材料間的遺傳差異參數(shù)比較Table 1 Comparison of genetic diversity parameters among the test varieties

2.2 供試材料多態(tài)性SNP位點(diǎn)分布及其多態(tài)性

利用Tassel V5.2.81軟件篩選后,共獲得均勻分布于小麥21條染色體上的23 323個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析。在每條染色體上多態(tài)性SNP分布變幅為429～1780,最少的是4D,最多的是2A,平均為1 110個(gè)(圖3a),不同染色體上SNP分布差異明顯。多態(tài)性SNP標(biāo)記在7個(gè)染色體同源群中分布變幅為2 569(第6同源群)～3 950(第2同源群)個(gè),按照SNP從多到少分布順序依次是2>5>7>3>1>4>6(圖3b)。在小麥三個(gè)基因組中,A和B基因組多態(tài)性SNP標(biāo)記較多,分別為8 504和9 726個(gè),D基因組最少,為5 093個(gè)(圖3c)。

基于23 323個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn),利用Tassel V5.2.81軟件計(jì)算得到供試材料核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)變異范圍為0.259～0.512,平均值為0.419。利用Power marker V3.0 軟件計(jì)算了23 323個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)的MAF、D和PIC值(表1),MAF變異范圍為0.500～0.938,平均值為0.725;D值變異范圍為0.117～0.500,平均值為0.370;PIC范圍在0.110～0.375 之間,平均值為0.295。

2.3 百農(nóng)64 特異SNP位點(diǎn)在其衍生品種基因組上的分布

比較百農(nóng)64與衍生品種的另外3個(gè)親本周麥11、周麥16和溫麥6號(hào)間的差異SNP標(biāo)記,獲得3 646個(gè)百農(nóng)64特異SNP位點(diǎn),其中A、B和D基因組分別為1 341、1 108和1 197個(gè)(表2),用于分析百農(nóng)64特異性SNP位點(diǎn)在其衍生后代染色體上的分布。分別比較4個(gè)衍生品種與百農(nóng)64的相同SNP位點(diǎn)比例(SSLR),結(jié)果顯示,同一衍生品種不同染色體之間的SSLR差異明顯,比如04中36,3D染色體僅為1.6%,而4B染色體高達(dá)100.0%;同一染色體不同品種之間的SSLR差異也明顯,以6B染色體為例,華育198為10.0%,而百農(nóng)207高達(dá)92.7%。4個(gè)衍生后代與百農(nóng)64在21對(duì)染色體上SSLR平均值變幅為21.5%～85.4%,其中2B,3D,6D低于30.0%;在30.1%～50.0%之間的最多,有12對(duì)染色體;超過50.0%的有6對(duì)染色體,其中6A染色體達(dá)到了85.4%。A、B和D三個(gè)基因組之間SSLR平均值也有差異,分別為54.2%、46.9%和36.5%。除百農(nóng)160外,其它3個(gè)衍生品種的21對(duì)染色體SSLR平均值均超過了50.0%。

2.4 百農(nóng)64及其衍生后代的遺傳相似性分析

將供試材料FISH鑒定的48種染色體block類型作為細(xì)胞學(xué)標(biāo)記,結(jié)合23 323個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn),共23 371個(gè)標(biāo)記,利用NTSYSpc V2.10e軟件計(jì)算了供試材料間的GS值(表3)。百農(nóng)207、華育198和04中36三個(gè)衍生品種與百農(nóng)64的GS都超過了0.700,華育198最高為0.762,這表明百農(nóng)64對(duì)其后代遺傳貢獻(xiàn)率高。百農(nóng)160與百農(nóng)64的GS值為0.564,而溫麥6號(hào)對(duì)百農(nóng)160貢獻(xiàn)較高,兩者之間GS為0.613。四個(gè)衍生系之間的GS變幅為0.464～0.652,平均值為0.544,華育198與百農(nóng)207之間GS最高,為0.652,華育198與百農(nóng)160之間GS最低,為0.464。

表3 供試材料間遺傳相似系數(shù)Table 3 Genetic similarity of the test varieties

2.5 聚類分析

基于供試材料染色體多態(tài)性block類型和多態(tài)性SNP共23 371個(gè)標(biāo)記,利用Power marker V3.0軟件,計(jì)算了Nei1983遺傳距離,并根據(jù)遺傳距離構(gòu)建了UPGMA聚類樹,在Nei1983遺傳距離0.20處,可分為三大類群(圖4)。百農(nóng)64及其4個(gè)衍生后代均屬于類群Ⅰ,華育198與百農(nóng)64遺傳距離最近。溫麥6號(hào)也聚在了類群Ⅰ,且百農(nóng)160與其遺傳距離較近,這與其系譜及遺傳相似系數(shù)相吻合。周麥11和周麥16各為一類,與其它材料遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。Nei1983遺傳距離與遺傳相似系數(shù)結(jié)果一致。

圖4 供試材料基于48種染色體多態(tài)性block和23 323個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記的聚類分析

3 討論

依據(jù)重復(fù)序列探針在不同小麥品種的豐度和分布不同,利用FISH技術(shù)可以清晰地檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)變異和多樣性,對(duì)解析小麥基因組結(jié)構(gòu)和組成具有重要參考價(jià)值[7-8]。利用pSc119.2和pAs1兩個(gè)重復(fù)DNA質(zhì)粒探針,對(duì)21個(gè)小麥品種進(jìn)行FISH分析,以中國(guó)春(CS)核型作為參考,鑒定到7對(duì)B組染色體均存在染色體多態(tài)性[17]。Huang等[8]對(duì)CS和373份中國(guó)栽培小麥品種進(jìn)行FISH分析,從中鑒定出167種染色體多態(tài)(block)類型,其中A組和B組較多,分別為78種和64種,而D組只有25種。Carvalho等[18]利用(AAC)5作為探針,對(duì)葡萄牙5個(gè)面包小麥和5個(gè)硬粒小麥進(jìn)行FISH核型分析,發(fā)現(xiàn)5個(gè)面包小麥的1B和6B染色體具有多態(tài)性。本研究與前人研究結(jié)果相似,A和B基因組染色體多態(tài)Block類型差異不大,D基因組最少,這表明D基因組序列比較保守。本研究在百農(nóng)64中鑒定出了臂間倒位perInv6B,且遺傳給了其子代品種百農(nóng)207,在百農(nóng)64及其衍生品種間6B染色體多態(tài)性較豐富。同時(shí),本研究在親本材料周麥11、周麥16和3個(gè)衍生品種中均鑒定出了小麥-黑麥T1RS/1BL易位,表明華育198和04中36的T1RS/1BL易位分別來自其親本周麥16和周麥11。百農(nóng)160含T1RS/1BL易位,而其親本百農(nóng)64和溫麥6號(hào)都不含,其易位可能來自另一親本多抗893。小麥育種過程中,小麥-黑麥T1RS/1BL易位系被育種家廣泛選擇。本研究表明FISH核型可以追蹤小麥品種系譜。

本研究利用小麥55K SNP芯片,對(duì)百農(nóng)64及其衍生品種進(jìn)行全基因組掃描,結(jié)果顯示在3個(gè)基因組中,B基因組多態(tài)性SNP標(biāo)記最多,A基因組與B基因組差異不大,D基因組最少,且D與A和B兩個(gè)基因組差異較大,這與本研究的FISH染色體多態(tài)性block類型結(jié)果一致,同時(shí)與之前大多數(shù)研究結(jié)果一致[4,19-20]。這與D基因組來源單一,序列比較保守有一定關(guān)系[19],且在六倍體小麥進(jìn)化過程中,A和B基因組組裝到一起形成四倍體的時(shí)間較早,而AABB與D基因組結(jié)合形成六倍體栽培小麥的時(shí)間較短[21]。Jia等[21]通過對(duì)小麥D基因組供體材料節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiL.)進(jìn)行全基因組測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)其基因家族與抗病性、非生物脅迫及谷物品質(zhì)相關(guān),而育種家在品種選育過程中,偏向于選擇具有這些優(yōu)良性狀的品系,這種長(zhǎng)期的定向選擇導(dǎo)致了其遺傳多樣性比A、B基因組低。白彥明等[4]、曹廷杰等[19]和劉易科等[20]研究均表明,小麥第四同源群多態(tài)性SNP標(biāo)記最少,且4D染色體上的多態(tài)性SNP標(biāo)記最少,而本研究結(jié)果顯示第四和第六同源群多態(tài)性標(biāo)記數(shù)均少,多態(tài)性標(biāo)記最少的染色體同樣是4D染色體。已有報(bào)道顯示4D染色體上攜帶控制育種目標(biāo)性狀的基因較多,多年來育種家的定向選擇導(dǎo)致了4D染色體遺傳多樣性降低[19]。

FISH技術(shù)可以從細(xì)胞學(xué)上鑒定染色體結(jié)構(gòu)變異和多態(tài)性,而染色體結(jié)構(gòu)變異和多態(tài)性在品種環(huán)境適應(yīng)性、抗病性、抗逆性、馴化和優(yōu)良農(nóng)藝性狀形成等過程中發(fā)揮的作用比SNP大;SNP標(biāo)記可在單核苷酸水平上檢測(cè)物種遺傳差異,且在各個(gè)物種全基因組水平上均有廣泛分布。將這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合起來,可以用于構(gòu)建重組自交系群體遺傳圖譜[12],也可進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)變異和農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析[22],但鮮有將兩種技術(shù)結(jié)合起來研究骨干親本遺傳貢獻(xiàn)的報(bào)道。本研究將FISH和SNP芯片技術(shù)相結(jié)合,從細(xì)胞學(xué)和單核苷酸等不同水平分析百農(nóng)64與其衍生一代品種之間的遺傳相似性。除百農(nóng)160與百農(nóng)64遺傳相似系數(shù)小于0.6外,其它的品種都超過了0.7,且百農(nóng)64特異性SNP位點(diǎn)在百農(nóng)207、04中36和華育198染色體上分布的平均比例均超過了50%,這與核型分析結(jié)果一致,這3個(gè)品種分別有16、14、17對(duì)染色體核型與百農(nóng)64一致。百農(nóng)64及其4個(gè)衍生品種聚為一類,聚類分析結(jié)果與遺傳相似系數(shù)結(jié)果一致。SNP標(biāo)記和核型分析結(jié)果均表明百農(nóng)64對(duì)這些衍生品種的遺傳貢獻(xiàn)較高,生產(chǎn)上育成新品種的遺傳構(gòu)成不是理論上的雙親平均值,而是偏向于綜合性狀好的骨干親本,骨干親本許多優(yōu)良性狀被育種家定向選擇,遺傳給了子代[23-24]。對(duì)百農(nóng)160遺傳貢獻(xiàn)率最高的親本是溫麥6號(hào),兩者之間遺傳相似系數(shù)為0.613,聚類分析結(jié)果顯示百農(nóng)160與溫麥6號(hào)遺傳距離最近,這是因?yàn)榘俎r(nóng)160是以溫麥6號(hào)為共同親本與另外兩個(gè)親本進(jìn)行三親本雙交選育而成的,這些研究結(jié)果與其系譜信息相吻合。