李明源 王繼蓮 田世梅

（喀什大學生命與地理科學學院/新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 喀什 844000）

土壤鹽堿化是典型的非生物脅迫之一，嚴重影響植物養(yǎng)分運轉(zhuǎn)和分布，使植物的生殖生理過程受到抑制［1］。我國鹽堿土地面積大、分布廣，大多植物無法生長導致植被稀少，土地資源浪費的同時還伴隨嚴重的生態(tài)問題。研究發(fā)現(xiàn)，采用生物接種法，即接種對植物有益的菌群，能有效緩解鹽堿脅迫對植物的不利影響［2］，對幫助其在鹽堿土中生長及土壤性質(zhì)改良有積極作用［3］。目前，開發(fā)優(yōu)良微生物菌劑已成為提高非鹽生植物耐鹽堿性的一種有效策略［4］。

植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是一類廣泛存在于植物根際的有益菌，與宿主植物根系代謝活動聯(lián)系密切。它們不僅能通過直接的營養(yǎng)調(diào)控促進植物生長［5］，而且能通過復雜的根際互作網(wǎng)絡，表現(xiàn)出對有害致病菌的拮抗作用，增強宿主植物抵抗生物和非生物脅迫的能力［6］。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）是植物內(nèi)源激素乙烯合成的直接前體，當植物遭受逆境脅迫時會發(fā)生應激反應，產(chǎn)生大量ACC，導致高濃度乙烯的積累，進而抑制植物生長。而ACC 脫氨酶可以將ACC分解為丁酮酸和氨，減少乙烯的富集［7］。國內(nèi)外學者已相繼從不同鹽生植物根際分離到產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株，將該菌株作為促生菌劑接種到植物根際，能夠提高植物在鹽堿脅迫下的生長發(fā)育［8-9］?？梢姡_發(fā)具有ACC脫氨酶活性的PGPR菌株作為新型生物肥料菌種來源，對提升植物抗逆性、修復退化生態(tài)和促進鹽堿地改良有重要意義。

新疆常年氣候干旱，是我國鹽堿土地面積最大、種類最多，治理最困難的地區(qū)，尤其南疆地區(qū)土壤鹽堿化趨勢最嚴重，制約著區(qū)域農(nóng)牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。鹽爪爪（Kalidiumfoliatum）是藜科鹽爪爪屬的一類鹽生、旱生多汁小灌木，對鹽分適應性極強，貯水組織發(fā)達，多年來一直是我國西北荒漠地區(qū)的建群物種。研究證實，鹽爪爪根際蘊藏著豐富多樣的微生物類群，具有較強的鹽堿耐受性，很多菌株還具有解磷、固氮、分泌吲哚-3- 乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）等促生特性［10-12］。綜上，開展鹽爪爪根際促生菌資源挖掘，對研制耐鹽堿促生菌肥及鹽堿土壤改良有重要意義。因此，本研究擬從荒漠鹽堿地鹽爪爪根際篩選產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株，通過盆栽接種試驗驗證其對鹽堿脅迫下植物生長的影響，以期為豐富產(chǎn)ACC 脫氨酶菌種資源及開發(fā)適用于鹽堿地改良的微生物菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022年10月，在新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州鹽堿地（39°42′N，76°08′E）進行樣品采集。區(qū)域內(nèi)植被主要以鹽爪爪（Kalidiumfoliatum）、鹽節(jié)木（Halocnemum strobilaceum）、旱生蘆葦（Phragmitescommunis）、鹽穗木（Halostachyscaspica）等耐鹽堿植物為主，交錯連片集中分布。采用多點混合采樣法挖取鹽爪爪整株根系，輕輕抖落與根系結(jié)合較松散的土壤，再用毛刷小心收集與根系緊密結(jié)合的根際土，裝于無菌器皿并在低溫下運回實驗室。

盆栽供試土壤采集自喀什市郊未開墾的鹽堿地。土壤pH值8.41，全鹽含量1.61 g·kg-1，堿解氮、速效鉀和有效磷含量分別為24.52、109.14 和16.05 mg·kg-1，有機質(zhì)含量為15.10 g·kg-1。

1.2 培養(yǎng)基

DF和ADF培養(yǎng)基用于產(chǎn)ACC脫氨酶菌株篩選［13］；蒙金娜有機磷培養(yǎng)基［14］和無氮（nitrogen free medium，NFM）培養(yǎng)基［15］用于菌株解有機磷能力和固氮酶活性測定；King’s B培養(yǎng)基［16］用于菌株產(chǎn)IAA能力測定。菌種保藏與活化采用Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基。為利于耐鹽堿菌種篩選，所有培養(yǎng)基的pH值均調(diào)至8.0～8.5。

1.3 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的篩選及酶活力測定

稱取根際土壤5 g，置于裝有45 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，放入玻璃珠振蕩60 min，得到土壤懸液。將懸液梯度稀釋后，均勻涂布至LB 平板，每個稀釋度重復3次。25 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，挑取單菌落劃線純化直至獲得純培養(yǎng)菌株。將菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，25 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。分別吸取300 μL 菌懸液接種至裝有3 mL DF 和ADF 培養(yǎng)基的試管中，25 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)72 h，采用比濁法測定培養(yǎng)液吸光值OD600。在連續(xù)5次的培養(yǎng)過程中，若菌株在ADF培養(yǎng)基中的生長情況始終優(yōu)于DF培養(yǎng)基，則認為其能以ACC 為唯一氮源進行生長繁殖，即可產(chǎn)生ACC 脫氨酶。陽性菌株制備成甘油冷凍管于-80 ℃保存。

以2，4-二硝基苯肼為染料，產(chǎn)物α-丁酮酸為檢測指標，測定陽性菌株的ACC 脫氨酶活力［13］。用Bradford法測定菌體蛋白量［17］，試驗重復3次。以單位蛋白質(zhì)量的菌體在單位時間內(nèi)產(chǎn)生α-丁酮酸的量衡量ACC 脫氨酶活性。以每分鐘產(chǎn)生1 μmol 的α-丁酮酸量（μmol）為1 個酶活力單位（U），單位酶活力除以總蛋白含量即為比活力（U·mg-1）。各菌株的酶活性測定，均扣除樣品對照中自發(fā)產(chǎn)物后計算。

1.4 菌株鑒定

采用DNA提取試劑盒（天根生化，北京）提取ACC脫氨酶陽性菌株基因組，以通用引物27F 和1492R 擴增16S rRNA 基因序列。PCR 反應體系為50 μL：PCR Mix 25 μL，模板DNA 2 μL，正反引物各1 μL，ddH2O補齊至50 μL。反應條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃保持10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送由楊凌天潤奧科生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果拼接后在EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫中比對，利用MEGA7.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 植物接種試驗

以哥倫比亞型（Col，Columbia）擬南芥和新冬20小麥為供試植物，分別進行非鹽堿和鹽堿脅迫下盆栽接種試驗。供試菌株為ACC 脫氨酶活性最高的3 株菌。試驗處理分別為接種供試菌株培養(yǎng)液、滅活的培養(yǎng)液和無菌LB 液體（CK），每個處理5 次重復。接種前，供試菌株在LB 液體培養(yǎng)基中25 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)36～48 h，用無菌水調(diào)節(jié)菌液至OD600≈1（細胞濃度約1010CFU·mL-1）備用。

1.5.1 擬南芥接種試驗 擬南芥種子經(jīng)5%的NaClO溶液消毒5 min，無菌水漂洗3次。用無菌牙簽將種子點入育苗盤基質(zhì)，覆保鮮膜，待種子發(fā)芽長出6 片葉后進行接種處理。將制備好的菌液澆灌至擬南芥根部，使基質(zhì)中的菌濃度達到107CFU·g-1，每組5個重復。將苗盤置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)條件設置為25 ℃、光照14 h/黑暗10 h。定期定量補水，并隨機調(diào)整花盆位置以使其受光均勻。每隔7 d接種一次，30 d后收獲植株分別測量株高、莖粗、鮮重、干重等指標，驗證菌株對非鹽堿脅迫下擬南芥生長的影響。

1.5.2 鹽堿土栽培小麥接種試驗 將供試鹽堿土壤與基質(zhì)營養(yǎng)土按7∶3 混勻裝盆，每盆約1 kg。挑選飽滿的小麥種子同1.5.1 的方法進行消毒。處理后的種子置于放有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，先經(jīng)4 ℃春化24 h，再于光照培養(yǎng)箱中催芽育苗。5 d 后挑取長勢一致的幼苗移栽到花盆中，同1.5.1 方法進行接種處理。統(tǒng)一管理30 d 后收獲測定株高、莖粗、鮮重、干重等指標，采用乙醇浸提法測定葉綠素含量［18］，分析接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株對鹽堿土栽培小麥的促生效果。

1.6 其他促生潛能分析

1.6.1 解磷能力測定 產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株先經(jīng)LB液體培養(yǎng)24 h，再以5%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL 蒙金娜有機磷培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)液經(jīng)12 000 r·min-1離心10 min，取上清按照1∶20 （V/V）加入0.5 mol·L-1的碳酸氫鈉溶液浸提30 min，采用鉬銻抗比色法測定OD720吸光值［19］。發(fā)酵液的有效磷增量（mg·L-1）通過磷標準曲線計算得到。

1.6.2 固氮能力測定 將產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株轉(zhuǎn)接至NFM 培養(yǎng)基，能生長的菌株為有固氮能力。陽性菌株經(jīng)LB液體25 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)3 d，以pH 值7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）調(diào)整菌懸液濃度為106CFU·mL-1。按照微生物固氮酶檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）說明書測定菌株固氮酶活性。

1.6.3 分泌IAA能力測定 將產(chǎn)ACC脫氨酶菌株接種于King’s B 液體培養(yǎng)基，25 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液經(jīng)12 000 r·min-1離心10 min 取上清，采用Salkowski比色法測定菌株產(chǎn)IAA能力［19］。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析，Duncan 氏法進行多重比較。圖、表數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株篩選及酶活力

從鹽爪爪根際土壤共篩選到26 株產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株。結(jié)合α-丁酮酸測定法和Bradford 法對ACC 脫氨酶活力進行測定，結(jié)果顯示ACC 脫氨酶比活力為0.4～5.6 U·mg-1（圖1）。以PM24 酶活性最高，其次是PM16和PM14，分別為4.7和3.6 U·mg-1。

圖1 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株酶活性Fig.1 ACC deaminase activity of the isolates

2.2 菌株鑒定

基于菌落形態(tài)觀察，PM14 和PM16 呈乳白色，圓形略凸起，濕潤黏稠，邊緣較整齊。PM24菌落呈黃色，圓形半透明，濕潤黏稠。革蘭氏染色觀察PM14、PM16和PM24 均為短桿狀，PM14 為革蘭氏陰性，PM16 和PM24呈革蘭氏陽性（圖2）。

圖2 ACC脫氨酶菌株革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of ACC deaminase strains

基于EzBiocloud數(shù)據(jù)庫比對和系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3），PM14 歸屬腸桿菌屬（Enterobacter），與霍氏腸桿菌（Enterobacterhormaechei）序列的最大相似率為99.65%。PM16 屬于賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus），與細長賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillusmacroides）的相似度達到99.31%。PM24 屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），與澤澍假單胞菌（Pseudomonaszeshuii）序列的最大相似度為99.17%。

圖3 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic tree of 16S RNA sequence of strain with ACC deaminase activity

2.3 接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株對擬南芥幼苗生長的影響

接種產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株培養(yǎng)液和滅活培養(yǎng)液均對擬南芥幼苗生長有積極影響，且菌株培養(yǎng)液的促進作用更大（圖4）。接種PM14、PM16和PM24培養(yǎng)液后，株高和地上干重相比CK 分別提高了80.3%～87.4%和24.4%～33.1%，其中PM24 對地上干重促進作用最大，PM14 對株高促進最明顯。接種滅活培養(yǎng)液后株高相比CK提高了9.7%～25.0%；地上干重相比CK 略有降低，但均差異不顯著。

圖4 不同處理對擬南芥幼苗生長的影響Fig.4 Effects of different treatments on growth of Arabidopsis thaliana seedling

接種PM14、PM16 和PM24 培養(yǎng)液后，根長和根干重相比CK 分別增加了22.1%～42.5% 和23.7%～178.4%，尤以接種PM24 后根長最長，PM16 根干重最大。接種滅活培養(yǎng)液后的根長和根干重與CK 相比無顯著差異。由圖5 可見，接種處理明顯影響了擬南芥根系發(fā)育，其根毛數(shù)量相比CK 更多，且更長。綜合來看，接種菌株P(guān)M24對擬南芥幼苗促生效果最明顯。

圖5 不同處理對擬南芥幼苗的促生效果Fig.5 The growth-promoting effects of different treatments on Arabidopsis thaliana seedlings

2.4 接種產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株對鹽堿土栽培小麥生長的影響

相比CK，接種產(chǎn)ACC脫氨酶菌株培養(yǎng)液對小麥株高、莖粗、鮮重和地上干重都有積極作用（圖6和7），分別提高了38.7%～55.5%、16.0%～26.5%、35.1%～54.4%和42.8%～52.9%，尤以PM16作用最大。而接種滅活培養(yǎng)液對株高、莖粗、鮮重和地上干重的提高范圍分別為1.6%～5.6%、10.8%～18.6%、5.1%～25.7% 和2.6%～12.8%。除接種滅活的PM14外，所有接種處理均增加了葉綠素含量，增加范圍為39.5%～66.2%，以PM16影響最大。

圖6 不同處理對小麥幼苗生長的影響Fig.6 Effects of different treatments on wheat seedlings

接種菌株培養(yǎng)液使根干重增加了32.4%～178.8%，以PM14 最大。相比于CK，接種滅活培養(yǎng)液也有促進作用，但PM14 和PM24 差異不顯著。總體而言，PM16對鹽堿土栽培小麥的促生效果最突出。

2.5 菌株其他促生特性分析

2.5.1 解磷能力 菌株P(guān)M16 和PM24 具有溶有機磷能力，培養(yǎng)液中有效磷含量分別為34.7和69.5 mg·L-1，顯著高于空白對照5.7 mg·L-1（P＜0.05）。PM14 無溶解有機磷能力。

2.5.2 固氮能力 菌株P(guān)M14、PM16 和PM24 均可在NFM 無氮培養(yǎng)基生長，固氮酶活性分別為53.9、70.8和42.4 IU·L-1，顯著高于空白對照的2.6 IU·L-1（P＜0.05），說明三株菌均具有固氮能力，其中PM16 固氮酶活性最高。

2.5.3 分泌IAA 能力 Salkowski 法分析表明，菌株P(guān)M14、PM16 和PM24 均具有分泌IAA 能力，IAA 分泌量分別為27.96、18.34和20.77 μg·mL-1。

3 討論

自Honma 等［20］首次從土壤中分離出產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株并證實其促生特性以來，各國學者相繼從多種生境中篩選到產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株，其中以芽孢桿菌、假單胞菌和腸桿菌屬居多。本研究分離自鹽爪爪根際的3 株ACC 脫氨酶高活性菌株分別歸屬于腸桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，與分離自新疆和碩［11］和寧夏銀北鹽堿區(qū)［8］的鹽爪爪根際促生菌明顯不同，說明產(chǎn)ACC 脫氨酶PGPR 的分布存在生長環(huán)境和植物種類特異性。不同PGPR 的適應能力和作用范圍也不同，導致從一個地域的特定宿主根際分離的PGPR 在其他地理環(huán)境或宿主上不具備普適性。因此，從不同生境或植物根際分離PGPR 資源仍然是開發(fā)高效微生物肥料的基礎。

有報道表明，只有當菌株的ACC脫氨酶活性（以單位時間內(nèi)，單位質(zhì)量ACC脫氨酶所產(chǎn)生的α-丁酮酸的物質(zhì)的量計）≥20 nmol·mg-1·h-1時，才能起到促生作用［13］。本研究中PGPR菌株的酶活性為0.4～5.6 U·mg-1，遠高于從保護區(qū)野生稻［21］、荒漠區(qū)檸條［22］和鹽堿地花生［23］根際分離的菌株。但姬文秀等［24］和王偉楠等［25］分別從人參內(nèi)生菌和鹽穗木根際篩選的產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株酶活性高于本研究，且分類地位與植物促生特性各異。而梁翔宇等［12］從寧夏鹽堿地鹽生植物根際篩選的耐鹽促生菌雖然均為芽孢桿菌屬，但解磷、產(chǎn)IAA能力與本研究有顯著差異。由此說明產(chǎn)ACC脫氨酶菌株在自然界的分布及其促生功能極具多樣性，但不同菌株即便是同屬菌株，其促生特性也存在巨大差異。本研究中3 株高活性產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株為多功能促生菌，具有進一步開發(fā)的潛力。但菌株的具體作用機制尚不明確，接種處理對土壤特性、菌群結(jié)構(gòu)和植物生理響應等問題還需深入探究，以全面揭示其促生機理。

接種菌株P(guān)M14、PM16和PM24培養(yǎng)液對非鹽堿脅迫下的擬南芥幼苗和鹽堿土栽培小麥均有促生作用。但不同菌株對不同宿主植物的響應不同，如前人用腸桿菌E.cloacaePM23 接種玉米，在鹽脅迫下株高增加了23%～39%，鮮重提高了40%～51%，深入研究發(fā)現(xiàn)PM23 的接種提高了植株抗氧化酶活性和滲透保護劑（游離氨基酸、甜菜堿和脯氨酸）水平，顯著降低了鹽脅迫下玉米植株氧化應激標志物［26］。而從稻田分離的ACC脫氨酶菌株，顯著促進了鹽脅迫下水稻幼苗生長，且這種作用與抗氧化酶和脅迫誘導乙烯含量的減少有關(guān)［27］。本研究中腸桿菌PM14 能促進鹽堿土栽培小麥生長，尤其顯著促進了根干重，推測其促生機理也與ACC 脫氨酶減少了植株的乙烯含量有關(guān)，直接證據(jù)還需進一步從ACC 脫氨酶基因AcdS入手解答。此外，不同菌株ACC脫氨酶活性大小不同，影響其在植物根際定殖的關(guān)鍵因素也可能不同，因此造成菌株促生效果的差異。

有報道表明，PGPR的根際定殖受到多種生物環(huán)境因素共同影響，包括宿主植物種類、根系分泌物等［28-29］。而土壤溫度、含氧量等非生物因素也會影響PGPR 菌株的競爭能力［30］，以上可能綜合影響了菌株的促生效果。土壤鹽漬化會導致植物根系形態(tài)和生理特征發(fā)生改變，阻礙植物對土壤水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收［31］。接種PM14、PM16和PM24增加了小麥根干重并促進了根系側(cè)根發(fā)育，推測ACC 脫氨酶菌株可能通過改善根系形態(tài)，促使其在鹽堿脅迫環(huán)境中擴展，吸收充足的水分和營養(yǎng)來保證植物的正常生理需求。前人對鹽脅迫燕麥和強抗旱苜蓿根系形態(tài)特征的研究也得出了相似結(jié)果［32-33］。

目前，有關(guān)PGPR 產(chǎn)ACC 脫氨酶研究多集中在生理水平上闡明產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株對植物水分關(guān)系、養(yǎng)分平衡和相容性溶質(zhì)合成過程的改善，未來還需從核酸和蛋白水平上綜合分析其對植物體內(nèi)參與這些生理過程相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的影響，從而全面闡釋產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株應答植物鹽堿脅迫的機理?？傮w來看，菌株P(guān)M14、PM16 和PM20 在誘導植物耐鹽堿促生方面具有一定應用前景，但鑒于實驗室條件和大田環(huán)境的巨大差異，后續(xù)需考察、跟進這些PGPR 菌株的田間應用效果，以更好地改良低產(chǎn)鹽堿土壤。

4 結(jié)論

本研究從鹽爪爪根際篩選到26 株產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株，酶活性為0.4～5.6 U·mg-1，以PM14、PM16 和PM24 能力最強，分別歸屬于腸桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和假單胞菌屬。盆栽試驗表明，接種PM14、PM16和PM24 能明顯促進非鹽堿脅迫下擬南芥幼苗生長，并對鹽堿土栽培小麥幼苗有積極作用。3 株菌都有多種促生功能，在開發(fā)適用于鹽堿地應用的微生物肥料方面有一定潛力。