趙勇,楊丁龍,高感,武書杰,向斌,和鳳平,李 蕾,楊亮宇**,張立梅**

寵物源性大腸桿菌分離鑒定和耐藥性分析

趙勇1,2,楊丁龍1*,高感1,2,武書杰1,2,向斌1,2,和鳳平1,2,李 蕾1,2,楊亮宇1,2**,張立梅1,2**

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明 650201 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽疫病防控中心, 云南 昆明 650201

為了分析昆明市寵物源性大腸桿菌的耐藥情況，并為臨床合理使用抗菌藥物提供依據(jù)，本研究對(duì)采自昆明市3家寵物醫(yī)院犬貓的26份棉拭子和5份灌洗液樣品進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定，并基于腸桿菌基因間重復(fù)共有序列（ERIC-PCR）對(duì)分離株進(jìn)行分型；使用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)分離菌株的耐藥性，并檢測(cè)了其耐藥基因攜帶情況。共分離到30株大腸桿菌，分離率為96.77%，其中犬源性14株，貓?jiān)葱?6株；ERIC-PCR分型顯示將30株大腸桿菌可分為9個(gè)亞型，健康犬貓與非健康犬貓?jiān)葱源竽c桿菌分型差異較大。耐藥性實(shí)驗(yàn)顯示分離株對(duì)氨芐西林（93.33%）耐藥率最高，其次較高的是紅霉素（90.00%）、四環(huán)素(83.33%)、復(fù)方新諾明(76.67%)，而對(duì)多粘菌素B、亞胺培南均不耐藥；分離株中26株菌（86.67%）為多重耐藥菌，且具有多種耐藥譜；ESBLs基因檢出率：（70%）、（36.67%）其它耐藥基因檢出率分別為（73.33%），（33.33%），（26.67%），（26.67%）。綜上健康與非健康犬貓?jiān)葱源竽c桿菌基因型差異明顯；昆明寵物源性大腸桿菌多重耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，臨床中對(duì)氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、和復(fù)方新諾明應(yīng)減少或停止使用。

寵物; 大腸桿菌; 耐藥基因

20世紀(jì)40年代以來，以青霉素為代表的抗生素藥物被廣泛運(yùn)用于感染性疾病的治療[1]。但是隨著抗生素的不恰當(dāng)使用，病原菌的耐藥問題越來越突出[2]。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,引起了全世界各界的廣泛關(guān)注,被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是21世紀(jì)最大的公共衛(wèi)生安全問題之一[3]。隨著國內(nèi)寵物產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，寵物用抗生素的使用量與日俱增，寵物源性抗生素耐藥問題越來越突出，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全[4]。大腸桿菌作為條件致病菌，在自然環(huán)境中廣泛存在，一般認(rèn)為其對(duì)大部分常規(guī)使用的抗生素藥物均較為敏感，但研究卻發(fā)現(xiàn)普遍存在大腸桿菌耐藥菌[5]。人類感染大腸桿菌一部分被歸因于在寵物動(dòng)物園、開放式農(nóng)場(chǎng)和動(dòng)物表演中與狗、羊、等動(dòng)物的直接接觸[6]。由于大腸桿菌普遍存在且容易攜帶多種耐藥基因，所以在治療和預(yù)防疾病的過程中給人們帶來了很大困難[7]。為了了解昆明市寵物源性大腸桿菌的耐藥情況，本研究從3家寵物醫(yī)院共收集了31份健康或患病犬貓的泄殖腔棉拭子或灌洗液樣品，用于大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性分析，本研究對(duì)于規(guī)范和指導(dǎo)寵物醫(yī)院抗生素的正確使用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材

LB肉湯、MH瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、麥康凱瓊脂均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒購艾克瑞生物公司，鏈霉素（STR）、四環(huán)素（TET）、復(fù)方新諾明（SXT）、氧氟沙星（OFX）、多粘菌素B（PB）、氨芐西林（AMP）、頭孢西叮（FOX）、慶大霉素（GEN）、紅霉素（EM）、頭孢他啶（CTA）、氟苯尼考（FIC）、亞胺培南（IPM）12種藥敏片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司，ESBLs檢測(cè)試劑盒購自北京普納德科技有限公司，比濁管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司、DNA Marker DL2000 、premix Tap購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱購（DHP-500BS）自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司、氣浴恒溫震蕩器(THZ-82B)購自常州市國旺儀器制造有限公司、梯度PCR儀（T100）購自BIORAD欣博盛生物科技有限公司、凝膠成像系統(tǒng)(SH-510)購自杭州申花科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1樣品的來源 寵物取自昆明市3家寵物所，一次性無菌棉簽采集犬貓肛腔拭子或直腸灌洗液(表1)。

表1 樣品類型及來源

1.3.2大腸桿菌的分離采集樣品加入到肉湯中，以37 ℃、220 rpm的條件培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的樣品劃線接種于麥康凱瓊脂，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取(粉)紅色、邊緣光滑的可疑菌落劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂進(jìn)行純化，分離獲得的大腸桿菌使用LB肉湯甘油于-20 ℃冰箱保存[8]。

1.3.3 特異性PCR鑒定對(duì)疑似大腸桿菌菌株進(jìn)行特異性PCR鑒定，分離菌株DNA提取采用細(xì)菌DNA提取試劑盒。引物序列見表2，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為756 bp。配置25 μL的PCR反應(yīng)體系：2 μL DNA模板，上下引物各1 μL，12.5 μL Premix Taq，8.5 μL ddH20。退火溫度：55 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行比對(duì)。

表2 大腸桿菌鑒定及ERIC分型引物

1.3.4 革蘭氏染色和鏡檢革蘭氏染色后記錄細(xì)菌在鏡下的形態(tài)特征。

1.3.5 腸桿菌基因間重復(fù)共有序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ERIC-PCR條帶聚類分析）對(duì)大腸桿菌進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物見表2[9]，配置25 μL的PCR反應(yīng)體系：2 μL DNA模板，上下引物各1 μL，12.5 μL Premix Taq，8.5 μL ddH20。退火溫度：54 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析電泳圖條帶，有條帶記作“1”，無條帶記作“0”。使用NTsys2.10e軟件分析確定菌株間的相似性，對(duì)ERIC產(chǎn)物進(jìn)行聚類分析。

1.3.6 耐藥表型試驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株對(duì)12種抗菌藥物的敏感性,測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，結(jié)果判斷參照CLSI（2018標(biāo)準(zhǔn)）[10]。待檢測(cè)的細(xì)菌對(duì)三類或者超過三類的抗生素表現(xiàn)耐藥，就可將其判定是多重耐藥菌（MDR）[11]。

1.3.7 大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)7類9種耐藥基因的引物參照文獻(xiàn)[12-16]設(shè)計(jì)，耐藥基因引物序列見表3。配置10 μL的PCR反應(yīng)體系：0.5 μL DNA模板，上下引物各0.5 μL，5 μL mix，3.5 μL ddH20。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌培養(yǎng)特性及形態(tài)

大腸桿菌接種選擇性培養(yǎng)基后的菌落形態(tài)如圖1所示。麥康凱瓊脂平板上呈大顆菌落，淡粉色突起；伊紅美藍(lán)瓊脂平板上呈金屬光澤黃綠色且邊緣整齊的菌落。

2.2 大腸桿菌鏡下的形態(tài)鑒定及PCR鑒定結(jié)果

將上述菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，可看到紅色、點(diǎn)狀、短桿狀密集分布的菌體（圖2）。使用大腸桿菌鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后可見約765 bp的條帶（圖3），PCR產(chǎn)物測(cè)序后在NCBI BLAST比對(duì)后鑒定為大腸桿菌。

圖2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

圖3 部分菌株的鑒定引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 大腸桿菌分離結(jié)果

31份樣品中共分離出30株大腸桿菌，檢出率為96.77%。貓中檢出16株，犬中檢出14株，其中非健康貓分出11株菌(35.48%)，非健康犬分出10株菌(32.26%)，健康貓分出5株菌(16.13%)，健康犬分出4株菌(12.90%)，綜合來看，非健康犬貓來源的大腸桿菌占比更高（圖4）。

2.4 大腸桿菌ERIC-PCR圖譜分析

ERIC-PCR擴(kuò)增序列用NTsys2.10e軟件進(jìn)行聚類分析，總相似度介于0.35～1.0，相似度0.84處可以分為9個(gè)基因型（圖5）。除了II型、VI型和IX型外，犬貓來源的大腸桿菌分型差別不大；而健康與非健康犬貓來源的大腸桿菌基因型差異較大。其中，健康犬源性大腸桿菌分為III型和VIII型，非健康犬源性大腸桿菌為I、IV、V、VII和IX型；健康貓?jiān)葱源竽c桿菌以II型、VII型為主，非健康貓?jiān)葱源竽c桿菌為I、IV、V和VI型（表4）。

圖5 菌株UPGMA樹狀圖

表4 大腸桿菌ERIC基因分型的分布

2.5 大腸桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

30株菌對(duì)于AMP、EM、TET、SXT的耐藥率已超過70%，分別為93.33%、90.00%、83.33%、76.67%，對(duì)FOX、CTA、FIC、GEN 、STR、OFX耐藥性較低，耐藥率不超過50%，對(duì)IPM和PB不耐藥（圖6）。

圖6 分離菌株對(duì)12種藥敏紙片的耐藥率

健康犬貓與非健康犬貓?jiān)葱源竽c桿菌對(duì)AMP、EM、TET耐藥率均在80%以上，對(duì)PB、IPM耐藥率均為0，表明犬貓來源的大腸桿菌耐藥性差異不大（表5）。

表5 不同來源大腸桿菌的耐藥性比較

2.6 多重耐藥分析

有26株菌株屬于多重耐藥菌株，占比86.67%。30株大腸桿菌共存在8種耐藥類型，17個(gè)耐藥譜，其中6耐占比高達(dá)56.67%。耐藥譜為TET-SXT-AMP-GEN-EM-CTA，占比最大，為23.33%（表6）。

2.7 大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

用9對(duì)耐藥基因引物對(duì)30株大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果六種耐藥基因可被檢測(cè)到，PCR擴(kuò)增后的耐藥基因產(chǎn)物片段與預(yù)期片段大小基本一致（圖7）。

M.DL2000 DNA Marker；－.陰性對(duì)照；1-8（1-3）.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DL2000 DNA Marker; －.negative control; 1-8（1-3）.PCR amplification product

2.8 大腸桿菌耐藥基因的統(tǒng)計(jì)分析

的檢出率最高，為73.33%，其次的檢出率為70%，的檢出率為36.67%，的檢出率為33.33%，sul1和的檢出率為26.67%，而、和均未檢出（圖8）。共存在10種耐藥基因譜，其中（20%）（20%）為主要耐藥基因譜，同時(shí)含有3種以上耐藥基因譜的菌株有19株（63.33%），提示本研究中分離的菌株具有較高的多重耐藥潛力（表7）。

健康犬貓大腸桿菌耐藥基因譜以（33.3%）、（44.4%）為主，非健康犬貓大腸桿菌耐藥基因譜以（28.6%）、（28.6%）為主，健康犬貓與非健康犬貓?jiān)葱源竽c桿菌基因型差異明顯。（表8）

圖8 分離菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

表7 大腸桿菌耐藥基因譜

表8 不同健康情況犬貓分離菌耐藥基因譜對(duì)比

3 討 論

本研究從昆明市寵物醫(yī)院采集了健康或非健康犬貓的肛拭子和灌洗液共 31份樣品，共分離到 30 株大腸桿菌。ERIC-PCR將大腸桿菌分為9個(gè)亞型，犬貓?jiān)葱源竽c桿菌基因型差異不顯著，而健康犬貓與非健康犬貓?jiān)葱缘拇竽c桿菌的基因型差異明顯，提示大腸桿菌基因型與宿主無關(guān)，而與宿主的健康狀態(tài)相關(guān)。

30株大腸桿菌對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、紅霉素的耐藥率均在80%以上，可能與寵物醫(yī)院常用β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類藥物可能有關(guān)，因?yàn)榭股氐膲毫κ羌?xì)菌產(chǎn)生耐藥的主要驅(qū)動(dòng)力[17]。其中非健康犬貓?jiān)葱源竽c桿菌對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、紅霉素耐藥性更高，這可能與其用藥有關(guān)。

產(chǎn)ESBLs菌株最早于1982年在英格蘭發(fā)現(xiàn)，此后世界各地均相繼報(bào)道，且各地的ESBLs類型的流行情況各不相同[18]。研究發(fā)現(xiàn)我國以CTX-M型ESBLs為主[19]，本研究中blaCTX-M（36.67%）較少，而blaTEM（70%）較多。本研究中86.67%的菌株為多重耐藥菌，耐藥譜多達(dá)13種，提示本地寵物源性大腸桿菌抗生素耐藥現(xiàn)狀嚴(yán)峻。

4 結(jié) 論

昆明地區(qū)健康犬貓與非健康犬貓?jiān)葱源竽c桿菌耐藥表型大致相同，而基因型差異明顯；大腸桿菌多重耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，臨床中對(duì)氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、和復(fù)方新諾明應(yīng)減少或停止使用。

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Isolate, Identify and Drug Resistance Analysis offrom Pets

ZHAO Yong1,2, YANG Ding-long1*, GAO Gan1,2, WU Shu-jie1,2, XIANG Bin1,2, HE Feng-ping1,2,LI Lei1,2, YANG Liang-yu1,2**, ZHANG Li-mei1,2**

1.650201,2.650201,

In order to analyze the drug resistance of pet-derivedin Kunming and to provide a basis for the rational use of antimicrobial drugs in clinical practice, 26 cotton swabs and 5 irrigation fluid samples collected from dogs and cats in three pet hospitals in Kunming were used for the isolation and identification of, and the isolates were typed based on intergenic repetitive shared sequences ( ERIC-PCR ) of;the drug resistance of the isolated strains was detected using the paper diffusion method, and their drug resistance gene carriage was examined. A total of 30strains were finally isolated, with an isolation rate of 96.77%, including 14 strains of canine origin and 16 strains of feline origin；ERIC-PCR typing showed that 30 strains ofcould be classified into nine subtypes, with large differences in the typing of healthy and non-healthy canine- and cat-derived.Resistance assays showed that the isolates were most resistant to ampicillin ( 93.33% ), followed by erythromycin ( 90.00% ), tetracycline ( 83.33% ), cotrimoxazole ( 76.67% ), while they were not resistant to polymyxin B and imipenem;26 of the isolates (86.67%) were multi-drug resistant bacteria with multiple resistance profiles;the detection rates of ESBLs genes: blaTEM (70%), blaCTX-M (36.67%) and other resistance genes were tetA ( 73.33% ), qnrS ( 33.33% ), acc(6')-Ib-cr (26.67%), and sul1 ( 26.67% ), respectively.In summary healthy and non-healthy dog and cat-derived E. coli genotype differences are obvious; Kunming pet-derived E. coli multi-drug resistance situation is serious, clinical use of ampicillin, erythromycin, tetracycline, and cotrimoxazole should be reduced or discontinued.

Pet;; drug resistance

S855.1

A

1000-2324(2023)04-0530-09

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.04.008

2023-07-03

2023-08-04

云南省“萬人計(jì)劃”產(chǎn)業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才專項(xiàng)(YNWR-CYJS-2019-020)

趙勇(2000-),男,碩士研究生,主要從事動(dòng)物臨床疾病研究. E-mail:3067916283@qq.com

同等貢獻(xiàn)作者:楊丁龍(2000-),男,本科生,主要從事動(dòng)物疫病的檢測(cè)工作. E-mail:1730174087@qq.com

通訊作者:Authors for correspondence. E-mail:745863086@qq.com; 20073175@163.com