陳 菊

（黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州凱里 556000）

亞硝酸鹽是一種常用的食品添加劑，可以使食品的存儲(chǔ)時(shí)間得以延長。但亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的毒性，如果人體攝入過量就會(huì)出現(xiàn)昏迷、抽搐、呼吸麻痹、損害心臟功能、導(dǎo)致休克等危害[1]；另一方面，亞硝酸鹽在人體胃酸環(huán)境下會(huì)進(jìn)行亞硝化反應(yīng)生成亞硝胺，亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，能誘發(fā)人體和動(dòng)物的多種臟器官生成惡性腫瘤[2]。由于目前還沒有找到能完全代替亞硝酸鹽的替代物，因此要想辦法盡可能減少食品中亞硝酸鹽的含量，降低人們因從食物中攝入過量亞硝酸鹽帶來的危害。據(jù)研究表明[3-6]，各種新鮮蔬菜、水果等天然植物中的酚類、黃酮類、多糖類及維生素等活性物質(zhì)均具有一定程度清除亞硝酸鹽的作用。

秋葵為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，又稱羊角豆、洋辣椒。其花、嫩果莢、種子均可食用，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的藥食同源植物，被許多國家運(yùn)動(dòng)員作為首選的蔬菜。秋葵嫩莢肉質(zhì)柔嫩，富含維生素、果膠、糖類、酚類、黃酮等多種生物活性成分，具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、保護(hù)腸胃、提高人體免疫力及保護(hù)心血管系統(tǒng)等生理功能[7-10]，是生產(chǎn)保健食品的重要來源，但目前對(duì)秋葵產(chǎn)品的加工仍處于初級(jí)階段，其中營養(yǎng)活性成分的開發(fā)利用還不夠深入。為進(jìn)一步提高秋葵利用價(jià)值，以秋葵嫩莢為試驗(yàn)對(duì)象，在模擬人體胃液條件下，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究確定秋葵清除亞硝酸鹽的最佳條件，為開發(fā)秋葵作為天然亞硝酸鹽清除劑提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器設(shè)備

722 型可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)，上海梅香儀器有限公司產(chǎn)品；多功能粉粹機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司產(chǎn)品；分析天平，梅特勒托利多（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；SK8200HP 型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；101 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海雙旭儀器有限公司產(chǎn)品；HH-W420 型數(shù)顯恒溫三用水箱，常州市頂新實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑

秋葵嫩果，購自凱里市農(nóng)貿(mào)市場；抗壞血酸（AR）、胃蛋白酶（酶活力3 000 U/g），上海源葉生物有限公司提供；無水乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、濃鹽酸等試劑均為國產(chǎn)分析純；蒸餾水：實(shí)驗(yàn)室自制。

模擬人體胃液的制備：稱取2.0 g NaCl 和胃蛋白酶3.2 g，分別加蒸餾水溶解后再加入7 mL 濃鹽酸，用蒸餾水定容至1 000 mL 容量瓶中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 秋葵提取液制備

取適量秋葵嫩果于65 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后，過40 目篩。準(zhǔn)確稱取2.00 g 秋葵樣品，置于具塞三角瓶中，加入60 mL 的提取溶劑，浸泡30 min，于50 ℃條件下進(jìn)行超聲提取30 min，提取2 次，合并溶液，室溫冷卻后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心10 min，收集上清液于棕色瓶中，于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 亞硝酸鹽清除率的測定

參考文獻(xiàn)[11-12]，采用鹽酸萘乙二胺比色法測定亞硝酸鹽清除率，秋葵果莢中有效成分能夠與亞硝酸鈉作用消耗亞硝酸根，通過測定溶液吸光度，計(jì)算亞硝酸鹽清除率。取25 mL 具塞比色管，均加入模擬胃液10.0 mL，在37 ℃水浴條件下保溫10 min，加入一定體積的秋葵提取液，再加入質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL 的NaNO2溶液2.0 mL，搖勻，置于37 ℃水浴中反應(yīng)一定時(shí)間后取出，立即加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的對(duì)氨基苯磺酸2.0 mL，混勻，靜置5 min 后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液1.0 mL，再靜置15 min，加蒸餾水至刻度，充分搖勻。于波長538 nm 處測定吸光度A1，同時(shí)做以蒸餾水替代秋葵提取液的空白對(duì)照試驗(yàn)并測定吸光度A2，以蒸餾水替代NaNO2溶液的空白對(duì)照試驗(yàn)測吸光度A3，試驗(yàn)重復(fù)3 次，按下式計(jì)算秋葵提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率。

式中：A1——樣品的吸光度；

A2——蒸餾水代替秋葵溶液空白對(duì)照的吸光度；

A3——蒸餾水代替NaNO2溶液空白對(duì)照的吸光度。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

不同提取溶劑對(duì)亞硝酸鹽的清除率：準(zhǔn)確稱取2.00 g 秋葵樣品，分別置于7 個(gè)具塞三角瓶中，依次加入60 mL 的蒸餾水、60%甲醇及不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液：45%，55%，65%，75%，85%，按照“1.2.1”方法制備提取液。按照“1.2.2”方法，取2.5 mL 秋葵提取液，分別加入NaNO2溶液，37 ℃水浴中反應(yīng)90 min 后，測定不同溶劑提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率。

提取液不同用量對(duì)亞硝酸鹽的清除率：準(zhǔn)確稱取2.00 g 秋葵樣品，加入60 mL 體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液，按照“1.2.1”方法制備提取液。分別吸取秋葵提取液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，再各加入NaNO2溶液，對(duì)氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺溶液，按照“1.2.2”方法，測定亞硝酸鹽的清除率。

不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽的清除率：分別吸取秋葵提取液2.5 mL（65%的乙醇作提取劑），各加入NaNO2溶液2.0 mL，37 ℃水浴中分別反應(yīng)20，40，60，80，100，120，150 min，按照“1.2.2”方法，測定亞硝酸鹽的清除率。

不同pH 值對(duì)亞硝酸鹽的清除率：取7 支具塞比色管，分別加入pH 值為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 模擬胃液10 mL，加入2.5 mL 秋葵提取液（65%的乙醇作提取劑）與NaNO2溶液2.0 mL于37 ℃水浴中90 min，按照“1.2.2”方法，測定亞硝酸鹽的清除率。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇各影響因素提取溶劑（A）、提取液用量（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）、pH 值（D）的最佳處理?xiàng)l件，按照L9（34）進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)研究，優(yōu)選秋葵提取液清除亞硝酸鹽的最優(yōu)條件。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均是3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，采用Excel 軟件作圖和分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

提取溶劑對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響見圖1。

圖1 提取溶劑對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

由圖1 可知，提取溶劑不同對(duì)亞硝酸鹽的清除效果有差異，清除能力最弱的提取溶劑是甲醇，清除能力最強(qiáng)的提取溶劑是乙醇，且清除能力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈增強(qiáng)趨勢，這表明秋葵清除亞硝酸鹽的有效成分更易溶于乙醇溶劑中。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)65%時(shí)清除率最大，繼續(xù)增加體積分?jǐn)?shù)，對(duì)清除率的貢獻(xiàn)不再增加反而降低?？紤]成本，后續(xù)試驗(yàn)選用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液作提取溶劑。

2.2 提取液用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

提取液用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響見圖2。

圖2 提取液用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

由圖2 可知，當(dāng)秋葵提取液用量為0.5～2.5 mL，提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率隨用量的增加而升高，當(dāng)提取液用量為2.5 mL 時(shí)清除效果最好，說明提取液中的活性成分已把可以清除的亞硝酸鹽清除完全，再增加用量已無法提高清除率。因此，選擇秋葵提取液的用量為2.5 mL。

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

由圖3 可知，秋葵提取液與亞硝酸鹽的反應(yīng)時(shí)間為20～100 min，清除率與反應(yīng)時(shí)間呈正比，100 min后，隨著時(shí)間的延長，清除率開始下降。同時(shí)，由圖3 可知，反應(yīng)時(shí)間為60～100 min 時(shí)的曲線較平滑，清除率表現(xiàn)較緩慢，表明提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除反應(yīng)已逐漸達(dá)到平衡狀態(tài)。為確定秋葵提取液與亞硝酸鹽的最適宜反應(yīng)時(shí)間，宜選擇反應(yīng)時(shí)間為60～120 min 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 pH 值對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

pH 值對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響見圖4。

圖4 pH 值對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

由圖4 可知，隨著pH 值的降低，亞硝酸鹽清除率逐漸升高。當(dāng)pH 值為1.5 時(shí)，清除率最高，結(jié)合人體胃酸pH 值為1.2～3.0，選擇模擬胃液pH 值為1.0～2.0 進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.5 正交試驗(yàn)分析

秋葵提取液清除亞硝酸鹽正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析見表2，秋葵提取液清除亞硝酸鹽的方差分析見表3。

表2 秋葵提取液清除亞硝酸鹽正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表3 秋葵提取液清除亞硝酸鹽的方差分析

以清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)秋葵提取液清除亞硝酸鹽的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，由直觀分析可知，提取溶劑、提取液用量、反應(yīng)時(shí)間、pH 值這4 個(gè)因素對(duì)秋葵提取液清除亞硝酸鹽效果均有一定程度的影響，其中影響最大的因素是提取液用量，因素pH 值的影響最小，4 個(gè)因素影響程度由高到底依次為提取液用量、反應(yīng)時(shí)間、提取溶劑、pH 值。而且由表3 方差分析可知，4 個(gè)影響因素中除因素pH 值影響不顯著外，其他3 個(gè)影響因素對(duì)亞硝酸鹽清除效果的影響程度均達(dá)顯著水平。由此確定秋葵提取液清除亞硝酸鹽的最優(yōu)條件為A2B2C2D3，即提取溶劑為65%的乙醇，提取液用量為2.5 mL，反應(yīng)時(shí)間為1.5 h，pH 值為2.0。不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案中，需要做驗(yàn)證試驗(yàn)。因此，準(zhǔn)確稱取2.00 g 預(yù)處理后的秋葵樣品，在該條件下進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3 次，求得亞硝酸鹽清除率為90.99%，表明此方案可行。

2.6 秋葵提取液與抗壞血酸（維C）清除亞硝酸鹽能力的比較研究

維C 具有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)亞硝酸鹽有明顯的清除作用[13]。因此，以維C 為陽性對(duì)照，考查質(zhì)量濃度為0.08～0.40 mg/mL 時(shí)的秋葵提取液分別在pH值2.0 的模擬胃液條件下反應(yīng)1.5 h 對(duì)亞硝酸鹽的清除率。

秋葵提取液與維C 對(duì)亞硝酸鹽的清除作用見圖5。

圖5 秋葵提取液與維C 對(duì)亞硝酸鹽的清除作用

由圖5 可知，兩者對(duì)亞硝酸鹽的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，在相同質(zhì)量濃度條件下秋葵提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除能力大于抗壞血酸，在低質(zhì)量濃度條件下兩者的清除能力區(qū)別較大。說明秋葵體液對(duì)亞硝酸鹽有明顯的清除作用。

3 結(jié)論

近年來，有關(guān)天然植物提取物被證明為有效亞硝酸鹽清除劑的研究逐漸增多。曹楚珩等人[14]研究表明，大蒜浸提液對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽具有清除作用。付麗等人[15]研究表明，八角、桂皮、生姜提取液均對(duì)亞硝酸鹽的清除有著較好的效果。汪洪濤[16]研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果花提取液對(duì)亞硝酸鹽清除率可達(dá)56.83%。李米等人[17]的研究也表明，生姜中的姜辣素可作為一種高效、安全的亞硝酸鹽清除劑被利用。

有研究表明，秋葵提取液對(duì)亞硝酸鹽具有清除作用。試驗(yàn)從提取溶劑、提取液用量、反應(yīng)時(shí)間、pH 值4 個(gè)單因素對(duì)秋葵提取液清除亞硝酸鹽能力的影響進(jìn)行了考查，并結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，得出秋葵提取液清除亞硝酸鹽的最佳條件為選用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇為提取溶劑，提取液用量2.5 mL，反應(yīng)時(shí)間1.5 h，pH 值2.0，測得亞硝酸鹽清除率為90.99%。以維C 為陽性對(duì)照，在所考查的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，秋葵提取液均能較好的清除亞硝酸鹽，且效果高于維C。研究結(jié)果表明，秋葵嫩果具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽能力，是一種具有較大開發(fā)價(jià)值的天然植物。但由于秋葵中活性成分較多而復(fù)雜，有關(guān)秋葵清除亞硝酸鹽各活性成分的含量及其與清除亞硝酸鹽的關(guān)系還需進(jìn)一步研究探討。