張鈺佳，崔凱文，段力升，曹愛萍,2，謝全亮,2，沈海濤,2，王斐,2，李鴻彬,2

海島棉CAD和CAD-Like基因家族的鑒定、表達及其對大麗輪枝菌的響應

張鈺佳1，崔凱文1，段力升1，曹愛萍1,2，謝全亮1,2，沈海濤1,2，王斐，李鴻彬

1石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832003；2綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團重點實驗室，新疆石河子 832003

【目的】肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素合成途徑中的關鍵酶，在增強植物機械強度、抵御病原菌入侵等方面發(fā)揮重要作用。鑒定海島棉GbCAD、GbCAD-LIKE（GbCADL）基因家族成員，并對其表達特征及其在黃萎病抗性中的作用進行分析，為棉花抗黃萎病機制的解析及抗病育種提供參考?！痉椒ā坷蒙镄畔W方法對海島棉GbCAD、GbCADL基因家族成員進行鑒定，并對其染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關系、基因結構、啟動子順式元件的預測進行系統(tǒng)分析。通過獲得公開釋放的轉錄組數(shù)據(jù)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析GbCAD基因及GbCADL基因的表達特征。利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術對GbCAD基因及GbCADL基因進行功能分析?！窘Y果】從海島棉中鑒定到25個GbCAD基因（分布在10條染色體）和34個GbCADL基因（分布在17條染色體）。GbCAD基因分為3個亞組，GbCADL基因分為4個亞組，同一個組內(nèi)基因含有相似的外顯子-內(nèi)含子結構和保守結構域。GbCAD基因和GbCADL基因具有不同的轉錄表達特征，其啟動子中含有多種激素和脅迫響應元件。轉錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR顯示，、、、、的表達受大麗輪枝菌誘導，尤其是、、、的表達在大麗輪枝菌處理后顯著增加。利用VIGS技術，將顯著受大麗輪枝菌誘導表達的、、、分別在棉花中沉默，分析VIGS株系對大麗輪枝菌抗性的變化。結果顯示，與對照植株相比，VIGS株系對大麗輪枝菌的抗性顯著降低。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色結果顯示，在未受到黃萎病侵染時，VIGS植株和對照植株的染色程度無顯著差異；在大麗輪枝菌處理6 h后，與對照植株相比，沉默株系、、、均表現(xiàn)出較深的著色，表明在沉默株系中有較高的活性氧累積。莖的切片結果顯示，大麗輪枝菌處理后，TRV:、TRV:、TRV:、TRV:沉默株系的莖維管組織表現(xiàn)出明顯的深褐色，表明其對大麗輪枝菌的抗性顯著降低?！窘Y論】抑制、、、的表達可以顯著降低棉花對大麗輪枝菌的抗性。

海島棉；肉桂醇脫氫酶；基因家族；表達特征；基因沉默；大麗輪枝菌

0 引言

【研究意義】大麗輪枝菌（）引起的黃萎病是一種具有破壞性的土傳維管束病害，對植物具有廣泛的侵害性，通常會引起植物發(fā)育不良、枯萎、維管束褐變等，最終導致植物生長發(fā)育受到嚴重影響甚至死亡[1]。棉花是重要的經(jīng)濟作物和天然纖維作物，在種植過程中容易受黃萎病的危害，該真菌病害嚴重影響棉花的生長、品質(zhì)以及產(chǎn)量。中國棉田中的黃萎病主要由大麗輪枝菌侵染所致[2]。研究棉花中響應大麗輪枝菌的關鍵基因及其功能，對于抗病機制解析及抗病棉花材料培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】木質(zhì)素（lignin）是一種植物體內(nèi)重要的大分子有機物質(zhì)，主要存在于次生加厚的細胞壁中[3]，能增強植物體機械強度及細胞壁的硬度，進而增強植物抵御生物和非生物脅迫[4]。當植物受到病原菌侵害時，會啟動一系列信號通路誘導植物防御相關基因的表達和一些化合物的產(chǎn)生，如萜類和苯丙烷[5]，苯丙烷途徑進一步可合成木質(zhì)素單體，進而增強植物的抗病性[6-7]。木質(zhì)素主要由香豆醇、松柏醇、芥子醇3種木質(zhì)醇單體聚合而成，根據(jù)這3種不同單體最終形成3種類型的木質(zhì)素，分別是對-羥基苯基丙烷木質(zhì)素（H-木質(zhì)素）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G-木質(zhì)素）、紫丁香基木質(zhì)素（S-木質(zhì)素）[8]。木質(zhì)素可通過增強植物機械強度、增厚細胞壁形成物理屏障以抑制病原體入侵[9-12]。木質(zhì)素對黃萎病的抗性與活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號介導的植物防御反應密切相關[13-14]。肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是一類NADPH依賴性酶，是調(diào)控木質(zhì)素單體生物合成的關鍵酶，對于木質(zhì)素的合成發(fā)揮著重要作用[7]。當植物受到外界環(huán)境的刺激或誘導時，植物各組織會產(chǎn)生復雜的生理生化反應，形成特定的機制，木質(zhì)化過程或木質(zhì)素大量沉積也是對逆境脅迫的一種響應機制[15]。研究發(fā)現(xiàn)，香瓜抗病材料PMR-45在接種白粉病菌24 h后，被侵入的表皮細胞發(fā)生木質(zhì)化[16]。亞麻CAD基因在不同組織器官對鐮刀菌侵染具有不同程度的響應[17]。通過對3個玉米品種接種串珠鐮刀菌（），發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量與品種抗莖腐病的能力呈顯著正相關[18]。大麗輪枝菌誘導的木質(zhì)化賦予植物對黃萎病的抗性[19]。棉花轉錄組學研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌誘導了木質(zhì)素生物合成基因的上調(diào)[20]。木質(zhì)素合成基因能夠通過調(diào)節(jié)木質(zhì)化和酚含量參與對黃萎病的抗性；木質(zhì)素合成受到轉錄因子GhMYB4的調(diào)控，進而參與對大麗輪枝菌的響應[21-22]。擬南芥有9個CAD基因和8個CADL基因，一些已被證明與木質(zhì)素生物合成有關[23-24]。和在花、莖的木質(zhì)素合成中發(fā)揮作用[25]；甜瓜和的表達受干旱的誘導，并可以促進木質(zhì)素的生物合成[26]；抑制擬南芥和小麥CAD基因的表達，顯著降低植物對病原菌的抗性[27-28]。【本研究切入點】海島棉具有較好的黃萎病抗性，目前，關于海島棉GbCAD基因和GbCADL基因參與棉花大麗輪枝菌響應的研究及調(diào)控機制鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究基于海島棉全基因組信息，通過生物信息學方法對GbCAD基因和GbCADL基因家族成員進行鑒定，分析GbCAD基因和GbCADL基因在海島棉不同組織和大麗輪枝菌侵染下的表達特征，利用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術抑制GbCAD基因和GbCADL基因的表達，分析其在海島棉響應大麗輪枝菌處理下的功能，為棉花抗病遺傳改良提供有效的候選基因，為棉花抗黃萎病機制解析及抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為海島棉品種新海21號，其種子由石河子大學生命科學學院103實驗室提供。

1.2 數(shù)據(jù)庫下載與分析工具

從Cottongen（https://www.cottongen.org/）下載海島棉基因組數(shù)據(jù)，通過本地BLAST構建本地數(shù)據(jù)庫。從TAIR（https://www.arabidopsis.org/index.jsp）下載擬南芥同源CAD、CADL蛋白質(zhì)序列，以擬南芥同源CAD、CADL蛋白序列為命中序列，使用BLASTP命令（e-value：1e-30）調(diào)取海島棉的CAD、CADL蛋白序列。取相似度大于50%的蛋白序列，提交Pfam（https://pfam.xfam.org/）進行在線預測，有CAD、CADL保守結構域的確定為CAD基因和CADL基因家族成員。

1.3 CAD基因和CADL基因的系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN軟件對海島棉和擬南芥的CAD、CADL蛋白質(zhì)序列進行比對。利用MEGA7.0軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap重復次數(shù)設置為1 000，將生成的無根樹提交ITOL（http://itol.embl.de/）形成環(huán)形進化樹。

1.4 GbCAD基因和GbCADL基因的染色體定位分析

利用本地BLAST從海島棉基因組數(shù)據(jù)庫中獲取GbCAD基因和GbCADL基因的染色體定位信息，運用TBtools軟件作圖。

1.5 GbCAD基因和GbCADL基因的結構分析

從海島棉基因組數(shù)據(jù)庫中（https://cottonfgd.org/）下載海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的信息，基于MEGA7.0軟件構建進化樹。利用MEME（http:// meme-suite.org/tools/meme）進行motif預測，設置查找10個motif，利用TBtools軟件進行可視化。

1.6 啟動子順式元件組成分析

使用TBtools中的Gff3 Sequence Extractor 提取GbCAD基因和GbCADL基因起始密碼子前2 000 bp的啟動子區(qū)序列，并提交在線分析軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/）分析啟動子的順式作用元件組成，通過TBtools中的Simple BioSequence Viewer軟件進行可視化。

1.7 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的表達特征

利用海島棉轉錄組測序數(shù)據(jù)分析GbCAD基因和GbCADL基因在海島棉根、莖、葉、花瓣、花藥、柱頭、胚珠和纖維（0 d的胚珠及開花后10、15、18、21和28 d的纖維）的表達特征。

1.8 總RNA的提取和cDNA的制備

選取海島棉品種新海21號，分別在大麗輪枝菌浸染處理前（0 h）和處理后6、24、48和72 h取棉花的葉片和根，采用多酚多糖植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取RNA，再利用反轉錄試劑盒（寶生物，大連）將提取的RNA反轉錄為cDNA，用于后續(xù)qRT-PCR試驗分析。

1.9 GbCAD基因和GbCADL基因響應大麗輪枝菌處理的表達分析

基于海島棉轉錄組測序數(shù)據(jù)結果，選擇顯著優(yōu)勢表達的、、、、和，使用Primer Premier 5.0設計特異引物，檢測其在響應大麗輪枝菌浸染不同時期的表達特征。按照熒光定量試劑盒（全式金，北京）說明書設置qRT-PCR反應體系和反應程序。以作為內(nèi)參基因，每個反應設置3個重復，采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達值。

1.10 GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D和GbCADL7A/D VIGS沉默載體的構建

根據(jù)、、和的序列，選取特異目的片段，以海島棉cDNA為模板進行PCR擴增，將純化后產(chǎn)物與TRV沉默載體連接，并轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中。將測序正確的載體轉化農(nóng)桿菌感受態(tài)LBA4404中，將TRV:、TRV:、TRV:和TRV:分別轉化海島棉。

1.11 大麗輪枝菌浸染處理棉花

將TRV:、TRV:、TRV:、TRV:、TRV:、PDS和輔助菌液在含有卡那霉素、鏈霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床過夜培養(yǎng)（28 ℃，16 h），使用離心機收集菌體（4 000 r/min，10 min），再用重懸液（MES、乙酰丁香酮、MgCl2）進行重懸，測OD值為1.1左右時，將各個載體重懸液和輔助載體重懸液按照1﹕1進行混合，室溫黑暗培養(yǎng)3 h以上。選取子葉完全展開的棉花幼苗進行注射，注射之后黑暗處理24 h，隨后置于23 ℃的溫室（16 h光照，8 h黑暗）繼續(xù)培養(yǎng)。三葉期對試驗組和對照組分別進行大麗輪枝菌浸染處理，試驗重復3次。

1.12 DAB染色

配制二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色液，按照Ａ液﹕Ｂ液＝19﹕1混勻備用。分別取棉花接種大麗輪枝菌0、6和12 h后的葉片，用無菌水沖洗干凈后，將葉片置于離心管中，加入適量的染色液于室溫避光染色9 h，隨后用95%的酒精脫色。每天更換無水乙醇，2—3 d后，用無菌水洗脫后拍照記錄。

1.13 沉默植株表型觀察

在海島棉三葉期進行大麗輪枝菌浸染15 d后，觀察沉默植株與空載植株的表型。用滅菌后的鋒利刀片對沉默植株和空載對照植株的莖部進行縱剖，然后使用光學顯微鏡觀察其感病程度，從而比較不同植株維管束被黃萎病侵害后的差異。

1.14 抗病性分析

采用灌根法接種大麗輪枝菌，其發(fā)病情況調(diào)查使用5級分級標準[29]。0級：葉片無病斑；1級：1—2片葉片出現(xiàn)萎蔫；2級：3—5片葉片出現(xiàn)萎蔫；3級：大部分葉片出現(xiàn)萎蔫；4級：植株萎凋枯死或即將萎凋枯死[30]。病情指數(shù)指標可作為植株抗病能力的評定標準，病情指數(shù)=∑（發(fā)病級數(shù)×株數(shù)）/（最高發(fā)病級數(shù)×總株數(shù)）×100%[31]。

2 結果

2.1 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的全基因組鑒定

在海島棉基因組中共篩選得到25個GbCAD基因和34個GbCADL基因，分別分布在10條染色體和17條染色體（或scaffold）（圖1）。根據(jù)每個基因在染色體的位置及序列的同源性，將海島棉GbCAD基因命名為—，將海島棉GbCADL基因命名為—。

2.2 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的系統(tǒng)進化分析

為了進一步分析海島棉GbCAD基因、GbCADL基因的系統(tǒng)進化關系，將擬南芥AtCAD基因、AtCADL基因與海島棉GbCAD基因、GbCADL基因整合，進行系統(tǒng)進化分析（圖2）。CAD基因可分為A、B和C 3個亞組，包含9個AtCAD基因和25個GbCAD基因。CADL基因可分為D、E、F和G 4個亞組，包含8個AtCADL基因和34個GbCADL基因。

2.3 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因結構與保守基序分析

CAD基因和CADL基因聚類為2個不同的類群（圖3-A）；基因結構分析發(fā)現(xiàn)，GbCAD基因的外顯子數(shù)目為3—6個，內(nèi)含子數(shù)目為2—5個。GbCADL基因的外顯子數(shù)目和內(nèi)含子數(shù)目相較于GbCAD基因較多，外顯子數(shù)目為7—10個，內(nèi)含子數(shù)目為6—9個（圖3-B），表明CAD基因和CADL基因家族成員的基因結構具有多樣性。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，GbCAD基因均含有motif1、motif4和motif10 3個保守基序，GbCADL基因均含有motif1、motif5、motif6和motif9 4個保守基序。不同組CAD基因和CADL基因之間的基序類型存在一定差異，但在同一聚類組中的成員表現(xiàn)出相似的基序組成模式（圖3-C）。

圖1 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的染色體定位

圖2 海島棉和擬南芥CAD及CADL基因的系統(tǒng)進化分析

A：系統(tǒng)發(fā)育樹；B：基因結構分析；C：保守結構域分析

2.4 啟動子順式作用元件組成分析

啟動子順式作用元件組成結果顯示，海島棉GbCAD基因和GbCADL基因中含有多種激素相關的響應元件和脅迫響應元件（圖4），如脫落酸響應元件、生長素響應元件、赤霉素響應元件、茉莉酸甲酯響應元件和水楊酸響應元件等。還發(fā)現(xiàn)了一些與脅迫相關的順式作用元件，如干旱響應元件、低溫響應元件、防御應激元件以及厭氧響應元件等。結果表明，GbCAD基因和GbCADL基因的啟動子區(qū)域包含不同順式作用元件，可能在調(diào)節(jié)植物逆境脅迫響應和激素的響應等過程中發(fā)揮著潛在的重要作用。

2.5 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的表達分析

基于轉錄組分析GbCAD基因和GbCADL基因在海島棉的根、莖、葉、花瓣、花藥、柱頭、胚珠和纖維的表達特征，結果顯示，、、、、、在根、莖、葉、胚珠和纖維組織中優(yōu)勢表達；和在花瓣、花藥和柱頭中優(yōu)勢表達，和在花瓣、花藥、柱頭和纖維中顯著累積，在纖維表現(xiàn)出獨特的特異性高表達（圖5）；表明這些基因在組織器官發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。大麗輪枝菌脅迫不同時間的轉錄組分析顯示，、、、、和的表達顯著累積（圖6）；進一步對這些基因在大麗輪枝菌處理不同時間的表達進行qRT-PCR驗證，結果顯示，、、、的表達均顯著受到大麗輪枝菌處理的誘導（圖7），表明這些GbCAD基因和GbCADL基因在棉花響應大麗輪枝菌過程中的重要作用。

圖4 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因啟動子的順式作用元件組成分析

2.6 抑制GbCAD基因和GbCADL基因的表達降低海島棉對大麗輪枝菌的抗性

利用VIGS技術對顯著響應大麗輪枝菌處理誘導表達的、、和進行抑制表達，分析這些基因表達的變化與大麗輪枝菌抗性之間的聯(lián)系。棉花的沉默，導致棉花后期新出現(xiàn)的真葉表現(xiàn)白化（圖8-A），表明抑制基因表達的遺傳轉化成功有效。取陽性植株與對照植株接種大麗輪枝菌0、6和12 h后的棉花葉片進行DAB染色，空載體對照植株和轉化植株在未受到黃萎病侵染時，染色結果無差異；在接菌后6 h，與對照植株相比，VIGS轉化株系TRV: G、TRV:、TRV:、TRV:表現(xiàn)出顯著加深的棕褐色（圖8-B），表明這些基因的沉默表達導致了細胞內(nèi)活性氧的累積；

圖5 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的組織表達特征分析

圖6 GbCAD基因和GbCADL基因響應大麗輪枝菌處理的表達分析

GbUBQ7為內(nèi)參基因，不同字母間表示樣本的顯著差異（p＜0.05）。下同

與對照植株相比，VIGS轉化株系在受到大麗輪枝菌浸染后葉片枯萎，表現(xiàn)出對大麗輪枝菌敏感性的增加（圖8-C）。對海島棉莖縱切面的觀察結果顯示，在大麗輪枝菌處理后，與對照相比，VIGS轉化株系TRV:G、TRV:、TRV:、TRV:表現(xiàn)出莖維管組織顯著的深褐色和更高的病情指數(shù)（圖8-D和圖8-E）。結果表明，抑制、、和的表達降低了棉花對大麗輪枝菌的抗性，暗示它們在棉花響應大麗輪枝菌過程中的重要作用。

3 討論

3.1 GbCAD基因和GbCADL基因家族的鑒定與表達分析

肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素合成途徑中最早研究的酶類，是木質(zhì)素單體合成過程中的最后一步關鍵酶[32]，在木質(zhì)素種類和功能多樣性中發(fā)揮重要作用[33]。目前，在許多物種中鑒定到CAD基因，如擬南芥有9個CAD基因和8個CADL基因[34]，水稻有12個CAD基因[35]，高粱有14個CAD基因[36]，楊樹有15個CAD基因[37]，陸地棉有19個CAD基因和27個CADL基因[38]。

本研究在海島棉基因組中鑒定得到25個GbCAD基因和34個GbCADL基因，分布在不同的染色體上（圖1）；擬南芥和海島棉CAD基因和CADL基因分別可分為3個亞組和4個亞組（圖2），、、聚類于A組，、與木質(zhì)素的合成過程密切相關[39]；在紫丁香假單胞菌（）侵染擬南芥的過程中，該基因受到誘導表達[28]，在和缺失的雙突變體中木質(zhì)素的含量顯著降低[25]，表明它們不僅與擬南芥木質(zhì)素合成相關，還與植物木質(zhì)素防御途徑相關[23]。棉花/在根、莖中具優(yōu)勢表達，且受到大麗輪枝菌的誘導表達（圖5和圖6），表明/可能通過調(diào)控木質(zhì)素的合成進而參與棉花對大麗輪枝菌的響應過程。同組的CAD基因和CADL基因具有相似的基因結構和保守結構域（圖3），表明它們可能具有功能的相似性。

A：陽性對照植株葉片表型；B：大麗輪枝菌處理后的葉片DAB染色分析；C：大麗輪枝菌浸染后的棉花植株表型分析；D：大麗輪枝菌浸染后的棉花莖縱剖圖；E：大麗輪枝菌浸染后的棉花病情指數(shù)統(tǒng)計

3.2 GbCAD基因和GbCADL基因功能發(fā)揮與植物的抗病響應密切相關

在對患易碎葉病的棗椰樹的研究中發(fā)現(xiàn)，易碎葉病誘導了棗椰樹和在根中的表達，與木質(zhì)素合成相關的在感病植株的葉片和根中的表達也顯著增強[40]。擬南芥木質(zhì)素合成的主要基因和是防御細菌性葉斑病的主要成分，的表達也受細菌性葉斑病處理的誘導[41]。沉默小麥植株后，植株葉片組織更易感小麥白粉病菌[42]。這表明CAD基因在植物抗病過程中起著重要作用。接種細菌性葉斑病的雙突變體與野生型相比，水楊酸（SA）通路基因的表達水平在接種病菌時被顯著誘導，且雙突變體中的SA含量減少，表明SA可能是參與抗病的信號分子[41]。外源SA處理誘導感病香蕉品種和耐病香蕉品種根組織中苯丙烷類途徑與木質(zhì)素產(chǎn)生，提高對TR4的抗病性[43]，表明CAD基因可能通過水楊酸激素信號途徑調(diào)控其對病原菌的抗性。本研究中GbCAD基因和GbCADL基因的啟動子序列中含有多個激素和脅迫響應元件（圖4），可能在植物逆境脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用；、、和的表達顯著受到大麗輪枝菌處理的誘導（圖6和圖7），暗示這些基因在棉花對大麗輪枝菌響應過程中的重要功能。

在擬南芥中過量表達導致植物對寄生疫霉菌和辣椒疫霉菌的抗性減弱，的沉默抑制了疫霉菌的侵染[44]。本研究中，分別抑制、、和表達的棉花株系表現(xiàn)出對大麗輪枝菌抗性顯著降低的現(xiàn)象，莖維管組織表現(xiàn)出深褐色（圖8），表明它們在棉花響應大麗輪枝菌過程中的重要作用。

4 結論

海島棉GbCAD基因和GbCADL基因具有不同的組織表達特征和受到大麗輪枝菌的誘導表達，抑制、、和的表達顯著降低海島棉對大麗輪枝菌的抗性。

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Identification and expression of CAD and CAD-Like gene families fromand Their response to

ZHANG YuJia1, CUI KaiWen1, DUAN LiSheng1, CAO AiPing1,2, XIE QuanLiang1,2, SHEN HaiTao1,2, WANG Fei, LI HongBin

1College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang;2Key Laboratory of Oasis Town and Mountain-Basin System Ecology of Xinjiang Production and Construction Corps, Shihezi 832003, Xinjiang

【Objective】Cinnamyl alcohol dehydrogenas(CAD) is a key enzyme in lignin synthesis pathway, which plays an important role in enhancing plant mechanical strength and resisting pathogen invasion. The aim of this study is to identifyCAD and CAD-Like (CADL) gene family members inand to analyze their expression characteristics and their role inwilt resistance, which provides reference for the mechanism elucidation and disease resistance breeding of cotton againstwilt. 【Method】The CAD andCADLgene family members ingenome were identified by bioinformatics method, and their chromosomal location, phylogenetic relationship, gene structure and promoter-element prediction were systematically analyzed. The expression characteristics of GbCAD and GbCADL were analyzed by obtaining publicly released transcriptome data and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). Functional analysis of GbCADandGbCADL genes was performed by viral-induced gene silencing (VIGS) technique. 【Result】A total of 25 GbCAD and 34 GbCADL genes were identified fromand distributed on 10 and 17 different chromosomes, respectively. GbCAD and GbCADL genes are divided into 3 and 4 subgroups, respectively. The genes in the same group contain similar exon-intron structures and conserved domains. GbCAD and GbCADL genes have different transcriptional expression characteristics, and the promoters of GbCAD and GbCADL genes contain various hormone response elements and stress response elements. Transcriptome data and qRT-PCR showed that the expressions of,,,, andwere induced byespecially the,,, andindicated significant increased expressions undertreatment. The genes of,,, andwere respectively silenced in cotton by virus-induced gene silencing (VIGS) technology, to analyze the changes of VIGS plant lines againsttreatment. The results showed that, compared with the control plants, the VIGS plant lines indicated significant decreased resistance toThe results of diaminobenzidine (DAB) histochemical stain displayed that, both control and VIGS plants showed similar normal phenotype withoutaddition; after 6 h treatment of, the VIGS plant lines silencing,,,expressions demonstrated a deeper brown coloring, indicating a higher reactive oxygen species (ROS) accumulation in the VIGS plant lines. The results of stem sectioning showed that, the stem vascular tissues of VIGS plant lines TRV:,TRV:,TRV:,and TRV:showed obvious dark brown enrichment aftertreatment, indicating the significant decreased resistance to【Conclusion】 Suppressing the expressions of,,,could significantly reduce the cotton resistance to.

; cinnamyl alcohol dehydrogenase; gene family; expression characteristics; gene silencing;

2022-12-31；

2023-04-06

國家自然科學基金（31960413）、兵團科技計劃（2016AC017）

張鈺佳，E-mail：1427740428@qq.com。通信作者王斐，E-mail：feiw@shzu.edu.cn。通信作者李鴻彬，E-mail：lihb@shzu.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.19.005

（責任編輯 李莉）