楊興有, 丁安明, 余祥文, 謝 強(qiáng), 夏 春, 張永輝, 徐傳濤, 王衛(wèi)鋒, 陳志華*

(1.四川省煙草公司 煙草科學(xué)研究所, 四川 成都 610000; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所, 山東 青島 266101; 3.四川省煙草公司 瀘州市公司, 四川 瀘州 646000)

0 引言

【研究意義】青枯病是煙草生產(chǎn)中常見的一種典型細(xì)菌性土傳病害,其病原菌是雷爾氏青枯菌(Ralstoniasolanacearu)[1]。青枯菌的寄主范圍比較廣泛,主要有煙草、番茄、馬鈴薯等植物,青枯病破壞性強(qiáng),防治比較困難[2]。在高溫高濕環(huán)境中,青枯菌通過根部或莖部的傷口進(jìn)入煙株,隨后進(jìn)入木質(zhì)部,通過脂多糖識(shí)別寄主細(xì)胞,并產(chǎn)生大量的胞外多糖導(dǎo)致維管束堵塞,同時(shí)分泌胞外蛋白酶降解細(xì)胞壁,最終引起煙草維管束發(fā)生病變,導(dǎo)致植物萎蔫死亡[3]。煙草是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一,其青枯病的發(fā)生嚴(yán)重威脅煙草生產(chǎn)。因此,有效預(yù)防青枯病的發(fā)生是煙草生產(chǎn)與科學(xué)研究的重要工作。【前人研究進(jìn)展】目前,防治青枯病的方法主要有化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治和生物防治3種?；瘜W(xué)防治效果不理想,化學(xué)農(nóng)藥對(duì)土壤環(huán)境和水質(zhì)產(chǎn)生污染,且長(zhǎng)期使用導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性[4]。農(nóng)業(yè)防治主要采用與小麥、玉米、水稻的輪作,但輪作存在年限較長(zhǎng)的缺點(diǎn)[5-6]。生物防治是施用微生物菌劑控制植物病害,優(yōu)點(diǎn)是對(duì)人畜植物安全,無污染[7],備受歡迎?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前篩選的煙草青枯病生防菌大多拮抗能力較弱,且大田防治效果不佳。【擬解決的關(guān)鍵問題】從煙草根際土壤中分離對(duì)煙草青枯病菌具有拮抗作用的細(xì)菌并對(duì)菌株進(jìn)行分類、鑒定,通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其生防效果以及對(duì)煙草的促生作用,為煙草青枯病防治提供新的拮抗菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 供試土樣采自四川省瀘州市古藺縣大寨鄉(xiāng)大寨村煙田,采用五點(diǎn)取樣法收集健壯煙株根際土壤樣品5份并編號(hào),放入無菌密封袋中,做好標(biāo)記并放置于4 ℃環(huán)境保存。

1.1.2 煙草品種與病原菌 供試煙草品種為煙草青枯病易感品種翠碧一號(hào)(CB-1);供試煙草青枯病病原菌為Y45,由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基均購自海博生物技術(shù)(青島)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 煙草根際土壤中細(xì)菌的分離及純化 采用梯度稀釋法并涂布于NA培養(yǎng)基上以分離土壤中的細(xì)菌。稱量1 g土壤樣品于10 mL無菌水中制備成濃度為10-1土壤懸液,振蕩培養(yǎng)30 min,然后靜置30 min。用無菌水稀釋至10-3土壤稀釋液,吸取100 μL均勻涂布于細(xì)菌培養(yǎng)基上,倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。挑取形狀、大小、顏色不同的單菌落于NB液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的菌液在細(xì)菌培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng),放置于28 ℃培養(yǎng)箱,待長(zhǎng)出單菌落后經(jīng)過多次劃線培養(yǎng),得到細(xì)菌的純培養(yǎng)物,并保存菌種。

1.2.2 青枯菌拮抗菌的篩選、鑒定與拮抗活性測(cè)定 采用抑菌圈法篩選煙草青枯病菌的拮抗細(xì)菌。取200 μL青枯病菌懸液均勻涂布于NA平板上,平板中央放置直徑為5 mm的無菌濾紙片,滴加10 μL濃度為1×108cfu/mL的待測(cè)菌液,待培養(yǎng)基充分吸收后,倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,觀察抑菌效果并測(cè)量抑菌圈的直徑。設(shè)置重復(fù)3次。

將拮抗菌接種于NA培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣、表面、透明度等,并進(jìn)行革蘭氏和甲基紅染色。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 拮抗菌的16S rDNA序列采用PCR方法擴(kuò)增[8]。PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌的通用引物,其中正向引物序列為BSF(27F)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物序列為BSR(1942R)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系:27F 1 μL,1942R 1 μL,ddH2O 21 μL,PCR Mix 25 μL,菌株DNA模板2 μL,合計(jì)50 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s,55 ℃復(fù)性15 s,72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、分離和純化PCR產(chǎn)物,并送派森諾生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將測(cè)序獲得的DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析,下載同源序列并通過Clustal和MEGA7.0進(jìn)行多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,確定其分類地位。

1.2.5 拮抗菌對(duì)煙草青枯病的室內(nèi)防效試驗(yàn) 采用盆栽試驗(yàn)研究拮抗菌對(duì)煙草青枯病的影響,盆栽試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所溫室內(nèi)進(jìn)行。在3個(gè)已滅菌的500 mL三角瓶中加入LB液體培養(yǎng)基,接入拮抗菌菌液并置于28℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(220 r/min),直到OD600=0.5～0.8。在加入拮抗菌前保持盆栽煙草幼苗(CB-1)土壤中含有充足的水分。量取50 mL菌液灌溉盆栽苗根部,對(duì)照(CK)則接入50 mL的NB培養(yǎng)基。間隔3 d后重復(fù)接種1次。之后間隔3 d接入青枯菌Y45菌液50 mL/盆(OD600=1.0),對(duì)照也接入50 mL Y45菌液[9-10]。每個(gè)處理10盆,3次重復(fù)。接種青枯菌后,蓋上保溫蓋放置在30 ℃培養(yǎng)箱中,將煙苗在高溫高濕的條件下分別培養(yǎng)7 d、14 d和21 d并依據(jù)《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》(GB/T 23222—2008)[11]記錄盆栽苗的發(fā)病情況。統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、病情指數(shù)和生防效果,其計(jì)算公式如下:

病情指數(shù)=∑(各病級(jí)株數(shù)×各病情指數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×青枯病最高病情指數(shù))×100

生防效果=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.2.6 拮抗菌對(duì)煙草幼苗的促生試驗(yàn) 采用灌溉接種的方式分析拮抗菌對(duì)煙草的促生作用[12],方法略有改動(dòng)。首先將拮抗菌搖至OD600=0.5。在煙草生根期移植盆中對(duì)其進(jìn)行灌根處理,每盆加入拮抗菌液20 mL,每處理10盆,3次重復(fù)。對(duì)照用NB培養(yǎng)基進(jìn)行灌溉,間隔7 d澆灌1次,共澆灌3次,然后放在26 ℃條件下培養(yǎng),觀察煙草的生長(zhǎng)狀況。3周后分別取對(duì)照組和處理組,除去土壤,清水洗凈,吸干水分,測(cè)量株高、葉片長(zhǎng)寬、莖圍、根系長(zhǎng)度、根系生物量等促生指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用學(xué)生t-檢驗(yàn)[13]進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根際細(xì)菌對(duì)青枯菌的拮抗活性

對(duì)采集健康煙株根際土壤中細(xì)菌進(jìn)行分離、純化,共得到土壤細(xì)菌54株。利用抑菌圈法對(duì)獲得的54株細(xì)菌進(jìn)行青枯菌拮抗活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)1株細(xì)菌對(duì)煙草青枯病菌具有抑制作用,命名為TBWR1(圖1)。該菌株產(chǎn)生的抑菌圈較為明顯且透明,直徑達(dá)21 mm以上。

注：*,**和***分別表示在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平下顯著,下同。

2.2 拮抗菌株TBWR1的形態(tài)鑒定

菌株TBWR1在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后,鏡檢觀察菌體發(fā)現(xiàn)其呈短棒狀,菌落為黃乳白色,呈圓形,表面略有褶皺,生長(zhǎng)無規(guī)則,革蘭氏染色陽性、甲基紅染色為陰性。

2.3 拮抗菌株TBWR1的分子鑒定

以TBWR1菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)單一DNA條帶,為16S rDNA序列,大小約為1.5 kb。序列基因登錄號(hào)為EF562603。通過序列比對(duì)分析,菌株TBWR1與枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖2)表明,菌株TBWR1與枯草芽孢桿菌BacillussubtilisKC849252和BacillussubtilisMN062963在同一分支上且同源性達(dá)85%。因此,初步鑒定菌株TBWR1為枯草芽孢桿菌。

2.4 拮抗菌對(duì)煙草青枯病的防治效果

從圖3看出,煙株接菌后第7天,對(duì)照組開始發(fā)病,出現(xiàn)萎蔫、枯死的癥狀,而TBWR1處理組鮮有發(fā)病;接菌后第14天,對(duì)照組病情指數(shù)為40,TBWR1處理組僅為16;接菌后第21天,對(duì)照組煙株全部發(fā)病,且有超過50%煙株死亡,TBWR1處理組的病情指數(shù)為25。拮抗菌TBWR1的生防效果在第21天達(dá)71.1%。拮抗菌TBWR1對(duì)盆栽試驗(yàn)中煙草青枯病具有較好的防治效果,明顯降低接種青枯菌后煙株的發(fā)病率和死亡率。

圖 2 TBWR1菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖 3 拮抗菌TBWR1對(duì)青枯病菌的生防效果

2.5 TBWR1菌株的促生作用

由圖4可見,與對(duì)照組相比,TBWR1拮抗菌株處理后的煙株整體生長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)、在處理后第7天、14天、21天與對(duì)照相比有顯著差異,其中,第21天對(duì)照株高平均達(dá)4.8 cm,TBWR1處理組達(dá)6.6 cm,株高顯著增加(圖4和圖5)。說明,拮抗菌能顯著促進(jìn)煙草株高的生長(zhǎng)。

對(duì)煙草葉片(自下而上數(shù)第3片葉)的長(zhǎng)度和寬度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),TBWR1拮抗菌株處理能顯著增加葉片長(zhǎng)度,而對(duì)葉片寬度無顯著促生作用。同樣,TBWR1拮抗菌株處理能顯著增加煙株的莖圍(圖5)和根系鮮重(圖6)。表明,TBWR1拮抗菌對(duì)煙草地上部分和地下部分均表現(xiàn)出顯著促生作用。

圖 4 TBWR1拮抗菌對(duì)煙草生長(zhǎng)勢(shì)的促進(jìn)作用

圖 5 TBWR1拮抗菌株處理煙草葉片的發(fā)育和莖圍

圖 6 TBWR1拮抗菌對(duì)煙草根系發(fā)育的促生效果

3 討論

青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的典型土傳病害且不易防治。由于該病菌致死率高、寄主范圍比較廣,普遍分布于世界烤煙種植區(qū),特別在熱帶和亞熱帶煙區(qū)易造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅煙草生產(chǎn)[4,14]。有研究認(rèn)為,根際微生態(tài)失衡是青枯病發(fā)生的主要原因[15]。植物土壤微生物所形成的相互依存的生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞,而根際微生態(tài)失衡對(duì)土壤微生物的環(huán)境造成進(jìn)一步惡化,更不利于植物的健康生長(zhǎng),造成病原微生物大量繁殖,最終導(dǎo)致土傳病害暴發(fā)[16]。

植物根際土壤中有不計(jì)其數(shù)的細(xì)菌,這些細(xì)菌有的促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育,提高植物的抗病性,維持正常的生態(tài)平衡;有的抑制植物生長(zhǎng)[7,13,17]。土壤中存在寄主或病原菌,有可能存在拮抗的生防菌株。拮抗菌株具有和病原菌生長(zhǎng)環(huán)境相同,因此利用拮抗菌防治青枯病是具有應(yīng)用前景的防治措施[18]。拮抗菌中研究較多的是芽孢桿菌屬,芽孢桿菌具有較強(qiáng)的定殖能力,這類菌株有抗逆性強(qiáng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求較簡(jiǎn)單,且產(chǎn)生內(nèi)孢子,也易分離篩選,對(duì)植物的病害防治有重要作用[12,19-20]。研究從煙田健壯煙株根際土壤中分離篩選對(duì)煙草青枯病菌拮抗作用相對(duì)較強(qiáng)的菌株TBWR1,通過系統(tǒng)發(fā)育分析該菌株屬于芽孢桿菌屬,在培養(yǎng)皿內(nèi)抑菌試驗(yàn)和盆栽防效試驗(yàn)中對(duì)煙草青枯病菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果,并進(jìn)一步通過促生試驗(yàn),證明拮抗菌TBWR1能顯著促進(jìn)煙草生長(zhǎng)勢(shì),對(duì)株高、莖圍、葉長(zhǎng)等地上部分和根系等地下部分生長(zhǎng)均具有顯著的促進(jìn)作用。研究結(jié)果為煙草青枯病的生物防治提供了新的生防菌株。

段燕萍等[18]研究表明,枯草芽孢桿菌SH7菌株產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)為蛋白多肽類物質(zhì),對(duì)煙草青枯病的防治效果達(dá)66%。有研究報(bào)道,番茄中解淀粉芽孢桿菌對(duì)青枯菌有較強(qiáng)的拮抗作用,防治效果在70%以上,能較好抑制番茄青枯病的侵害[6,21];枯草芽孢桿菌可以在番茄的根系上定殖并提高植株的株高、葉綠素含量和生物量以及果實(shí)的產(chǎn)量[22];接菌枯草芽孢桿菌YBM-4后,與對(duì)照相比,煙苗根系更豐富,莖稈更粗壯,從而有利于吸收更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)得到較大提高[23]。表明,枯草芽孢桿菌屬的多個(gè)菌株在幫助植物抵御病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面具有積極作用[24]。這些與本研究結(jié)果一致,但同時(shí)研究拮抗菌的生防效果和促生效果還鮮有報(bào)道。研究用拮抗細(xì)菌TBWR1處理后,煙株的抗病性顯著增強(qiáng),生防效果達(dá)71.1%,同時(shí)施加TBWR1促進(jìn)了煙草的株高、葉長(zhǎng)和莖圍的增加以及根系的生長(zhǎng)。推測(cè)其原因可能是拮抗菌TBWR1的施加改善了土壤根部有益細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境,與病原真菌相互競(jìng)爭(zhēng)[25-26],而且產(chǎn)生了抑制病原細(xì)菌的生長(zhǎng)和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的物質(zhì),如抗菌脂肽類、核酸類、多烯類等物質(zhì)[27-28]。拮抗菌TBWR1抗病相關(guān)功能基因及抗病相關(guān)機(jī)理需要進(jìn)一步研究,同時(shí)需要進(jìn)行田間試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)煙草青枯病的防治效果,為豐富拮抗菌種資源提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)論

從煙田抗病煙株根際土壤中分離純化出1株對(duì)煙草青枯病具有良好拮抗作用的枯草芽孢桿菌TBWR1。拮抗菌TBWR1對(duì)青枯病的生防效果達(dá)71.1%,并能顯著促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)勢(shì)。說明,拮抗菌TBWR1在煙草青枯病生物防治中具有潛在利用價(jià)值。