劉溶榮，陳煒曦，尹濟容，李姿燕，王季春,3,4，薦紅舉,3,4*，呂典秋,3,4*

（1.西部（重慶）科學城種質創(chuàng)制大科學中心，西南大學，重慶 400715；2.西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715；3.西南大學南方山地農業(yè)教育部工程研究中心，重慶 400715；4.西南大學薯類生物學與遺傳育種重慶市重點實驗室，重慶 400715）

近年來，極端天氣頻發(fā)，干旱作為全球變暖帶來的十大危害之一，嚴重影響了農業(yè)生產[1]。馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）作為淺根系作物，對水分十分敏感，干旱在馬鈴薯各個生育時期都有可能發(fā)生，且在各時期對馬鈴薯不同品種會造成不同程度的影響，最終影響其產量和品質[2-4]。

miRNA是一類長度為18～25 nt的內源性非編碼單鏈小分子RNA，越來越多的證據(jù)表明，miRNA 參與調控植物對非生物脅迫的響應[5]。干旱脅迫上調了擬南芥中miR156、miR159、miR167、miR168、miR171、 miR172、 miR319、 miR393、 miR394a、miR395c、miR395e、miR396 和miR397 的表達水平，降低了miR161、miR168a、miR168b、miR169、miR171a 和miR319c 的表達水平[6,7]。但在某些情況下，miRNA 對干旱脅迫的響應取決于物種。例如，干旱脅迫下miR156 表達豐度在水稻[8]和玉米[9]中下調，而在擬南芥[6]、大麥[10]和野生二粒小麥[11]中上調。在擬南芥中，miR319-TCP4通過介導茉莉酸和生長素的合成途徑參與干旱脅迫[12]。在抗旱能力不同的煙草品種中，miR398 在干旱脅迫后呈現(xiàn)出不同的表達模式，但是均可抑制其靶標銅鋅超氧化物歧化酶基因（Cu/Zn-SOD，CSD）的表達[13]。Yang等[14]預測了干旱脅迫下馬鈴薯中脯氨酸積累相關的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR172、miR396a、miR396c和miR4233 調控吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS），miR2673 和miR6461 分別調控吡咯啉-5-羧酸還原酶基因（P5CR）和脯氨酸脫氫酶基因（ProDH）；Zhang 等[15]通過深度測序對馬鈴薯干旱脅迫下保守和新型的miRNAs 進行了鑒定，確定了4 個調控干旱相關基因（miR811、miR814、miR835、miR4398）。鑒定到3 個stu-miR159 成員（stu-miR159a、 stu-miR159b 和stu-miR159c）均在馬鈴薯干旱脅迫處理25 d后表達量顯著降低，預測的3 個靶基因GAMyb-like 家族成員（StGAMyb1、StGAMyb-like2.1和StGAMyb-like2.2）表達量顯著增加[16]。因此，關于響應馬鈴薯干旱相關的miRNA及其靶基因還有待深入挖掘。

本研究旨在通過20% PEG6000 模擬干旱處理，對0，1，3，6，12，24和48 h共7個時間點的馬鈴薯組培苗進行sRNA文庫構建和測序，利用生物信息學分析的方法，鑒定響應干旱脅迫的miRNA及其靶基因，探究miRNA 及其靶基因在馬鈴薯干旱脅迫下的調控作用，為后期miRNA 的功能驗證奠定基礎，同時為闡明馬鈴薯參與干旱響應的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以馬鈴薯品種‘克新18 號’組培苗為試驗材料，供試材料為重慶市薯類生物學與遺傳育種重點實驗室保存。

1.2 試驗方法

在Murashige & Skoog（MS）培養(yǎng)基（3%蔗糖）進行組培苗的生長，14 d后移出，煉苗2 d后使用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液水培5 d（16 h 光照/8 h 黑暗；22℃/18℃）。

使用20% PEG6000 替換營養(yǎng)液，在0，1，3，6，12，24 和48 h 分別取相同部位葉片，各處理2次生物學重復，每個生物學重復使用3 株葉片混合，液氮速凍后于-80℃保存。

1.3 sRNA文庫的構建與測序

將上述14 個樣本送至百邁客生物科技有限公司，提取RNA，質檢合格后，使用Illumina HiSeq 2500平臺進行sRNA文庫構建和測序。對獲得的原始測序數(shù)據(jù)進行質量控制，去除未知堿基N（N 為無法識別的堿基）含量大于等于10%的和沒有3′接頭序列的Reads，剪切掉3′接頭序列，獲得18～30個核苷酸的高質量值序列（即Clean reads）。

1.4 sRNA測序數(shù)據(jù)分析

利用Bowtie 軟件，將Clean reads 分別與Silva數(shù)據(jù)庫、GtRNAdb數(shù)據(jù)庫、Rfam數(shù)據(jù)庫和Repbase數(shù)據(jù)庫進行序列比對，過濾核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA（tRNA）、核內小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）等非編碼RNA（ncRNA）以及重復序列，獲得包含miRNA 的Unannotated reads。利用Bowtie 軟件將Unannotated reads 與馬鈴薯雜合二倍體參考基因組（RH89_039_16_v2）進行序列比對，獲取在參考基因組上的位置信息（即Mapped reads）。

將Mapped reads與miRBase（v22）數(shù)據(jù)庫中已知miRNA的成熟序列及其上游2 nt與下游5 nt的范圍進行比對，最多允許一個錯配，鑒定到已知miRNA（Known-miRNAs）；利用miRDeep2 軟件包，通過Reads 比對到基因組上的位置信息得到可能的前體序列，基于Reads 在前體序列上的分布信息（基于miRNA產生特點、Mature、Star、Loop）及前體結構能量信息（RNAfold randfold），采用貝葉斯模型經打分最終實現(xiàn)新miRNA（Novel-miRNAs）的預測?；谛蛄械南嗨菩允褂胢iRDeep2軟件對檢測到的已知miRNA和新miRNA進行miRNA家族分析。

1.5 干旱脅迫下miRNA的差異表達分析

對各樣本中miRNA 進行表達量的統(tǒng)計，并用TPM 算法對表達量進行歸一化處理。TPM 歸一化處理公式為：

式中：Read count 表示比對到某一miRNA 的Reads數(shù)目。

使用皮爾森相關系數(shù)對樣品間相關性進行計算，計算公式為：

使用|log2（FC）|≥0.58；P-value≤0.05 作為篩選標準，采用Benjamini-Hochberg 校正方法對原有假設檢驗得到的顯著性P值（Pvalue）進行校正，使用DESeq2 進行樣品組間的差異表達分析，獲得差異表達miRNA集。

1.6 miRNA 靶基因預測及差異表達miRNA 靶基因KEGG通路富集

根據(jù)Known-miRNAs 和Novel-miRNAs 與RH89_039_16_v2的基因序列信息，使用TargetFinder軟件進行靶基因預測。使用BLAST 軟件將預測靶基因序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG、KOG和Pfam數(shù)據(jù)庫比對，獲得靶基因的注釋信息。

利用富集因子（Enrichment factor）分析差異表達miRNA 靶基因在某一通路上的富集程度，并利用Fisher 精確檢驗方法計算P值，經FDR 矯正P值后得到Q值（Qvalue）。其中富集因子的計算公式為：

富集因子=（單個Pathway中的差異表達miRNA靶基因數(shù)/單個Pathway 中的所有靶基因數(shù)）/（所有Pathway中的差異表達miRNA靶基因數(shù)/所有Pathway中的所有靶基因數(shù)）

選取富集顯著性最可靠（即Qvalue 最小）的前20 個通路進行結果展示，得到差異表達miRNA 靶基因的KEGG通路富集結果，利用聯(lián)川生物云平臺（https://www.omicstudio.cn/home）進行作圖展示。

1.7 總RNA、miRNA提取及cDNA第一條鏈合成與逆轉錄

使用EASY spin 植物microRNA 快速提取試劑盒（艾德萊，中國）對20%PEG6000 處理0，3，12和48 h 的葉片提取包含miRNA 的總RNA；使用該公司的增強型miRNA 反轉錄試劑盒進行miRNA 3′末端的PolyA加尾和逆轉錄反應。

1.8 引物設計及qPCR驗證

參照加PloyA 尾法[17]，對篩選出的差異表達miRNA 設計正向熒光定量PCR 引物，以馬鈴薯18S rRNA 為內參基因。miRNA 上游引物見表1，下游為北京艾德萊生物科技公司熒光定量檢測試劑盒中提供的通用引物。反應體系及反應程序參照試劑盒說明書。

表1 miRNA熒光定量PCR上游引物序列Table 1 Forward primer sequences for miRNA qPCR

每個miRNA 選擇兩個靶基因，通過Spud DB（http://spuddb.uga.edu/）獲得靶基因的CDS 序列，使用Beacon Designer 7.9 軟件進行定量引物設計（表2），以馬鈴薯EF1α作為內參基因。每個樣品設3 次生物學重復、3 次技術重復，采用2-ΔΔCt算法計算基因的相對表達量。

1.9 數(shù)據(jù)處理與作圖

利用Excel Microsoft 365 軟件進行數(shù)據(jù)整理分析，使用GraphPad Prism 9軟件進行作圖展示。

2 結果與分析

2.1 sRNA文庫數(shù)據(jù)初步分析

對14 個樣品的sRNA 測序原始數(shù)據(jù)進行質控，從各樣品中獲得了高質量值序列（表3）。14個樣品中功能未注釋的序列數(shù)在12 628 838（63.86%）～16 227 826 個（77.15%），rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 等ncRNA 以及重復序列占比較少。一般在植物中rRNA 低于60%被認為是合格品，本測序結果的14 個樣本中rRNA 數(shù)目在4 314 282（20.51%）～6 763 846個（34.20%），說明sRNA文庫的構建是合格的，可以進行下一步分析。

表3 小RNA的種類和數(shù)量Table 3 Categorization of unique reads and total reads of small RNA

將未注釋的序列與馬鈴薯雜合二倍體參考基因組（Solanum_tuberosumRH89_039_16_v2）進行序列比對，獲取在參考基因組上的位置信息（表4）。各樣本比對到參考基因組上的Reads數(shù)在6 651 941（56.47%）～8 612 998個（60.93%），比對到正鏈上的Reads數(shù)占所有Unannotated reads的比例在39.54%～42.48%，比對到負鏈上的Reads 數(shù)占比在16.93%～18.53%?？傮w來看，14 個樣本中一半以上的未注釋序列可以比對到參考基因組上，且大多數(shù)序列比對到基因組正鏈上。

表4 參考基因組比對信息Table 4 Distribution of sequence reads mapped to genome

2.2 馬鈴薯中已知和新miRNA鑒定及序列長度分布

14 個樣品共得到621 個miRNAs，其中已知miRNAs（Known-miRNAs）308 個，新預測miRNAs（Novel- miRNAs）313 個。 CK、 D1、 D3、 D6、D12、D24 和D48 樣品中分別發(fā)現(xiàn)了286、291、275、272、269、272和265個Known-miRNAs，CK和D1 中Known-miRNAs 的數(shù)量明顯多于其他處理，隨著處理時間的延長，Known-miRNAs的數(shù)量逐漸減少；各處理中發(fā)現(xiàn)的Novel-miRNAs 數(shù)量相同，均為313個（圖1A）。不同大小的miRNAs在各處理中分布相似，大都在20～24 nt 分布。且Known-miRNAs 和Novel-miRNAs 的長度都集中在21 和24 nt，但Known-miRNAs 在長度為21 nt 的序列含量最高，其次為24 nt 的序列，并且干旱脅迫處理3 h 后，21 nt 的Known-miRNAs 數(shù)目明顯減少；Novel-miRNAs 則相反，在長度為24 nt的序列含量最高，其次為21 nt；在22 和23 nt 的KnownmiRNAs和Novel-miRNAs的序列數(shù)目相似（圖1B）。

圖1 miRNAs鑒定結果Figure 1 Results of identified miRNAs

2.3 miRNA家族分析

miRNA在物種間具有高度保守性，基于序列的相似性對檢測到的Known-miRNA 和Novel-miRNA進行miRNA 家族分析，研究miRNA 在進化中的保守性。250 個已知miRNAs 屬于69 個家族，166 個新預測miRNAs 屬于59個家族?？偣茶b定到104個miRNA家族，其中有24個家族是Known-miRNA和Novel-miRNA所共有的（表5和圖2A）。

圖2 miRNA家族分析Figure 2 Analysis of miRNA family

表5 miRNA家族統(tǒng)計Table 5 Summary of miRNA family

miR399家族含有的Known-miRNA最多，有30個，其次為miR398 含有15 個Novel-miRNA。在處理后，共有16 個家族的miRNA 發(fā)生了變化，其中miR399 家族的miRNA 在干旱處理3 h 時明顯減少，miR7982 家族的miRNA 在干旱處理6 h 后未檢測到，miR7993和miR8005家族的miRNA也在干旱處理后出現(xiàn)不同程度的減少，miR169_1 家族的miRNA 在干旱3 h 前數(shù)目增加，3 h 后開始減少，另外，miR158 和miR6425 家族的miRNA 在干旱處理后才被檢測到（圖2B）。

2.4 干旱脅迫響應相關miRNA差異表達分析

對鑒定到的621 個miRNAs 進行差異表達分析，共鑒定到40 個差異表達miRNA，其中上調表達的12個，下調表達的28個（圖3A）。干旱處理前6 h，上調的miRNA 逐漸減少，6 h 時全為下調表達的miRNA，6 h 后逐漸增加；干旱處理3 h 時，下調的miRNA減少，之后增加，干旱處理3 h時的差異miRNA數(shù)目最少（圖3B）。

圖3 響應干旱脅迫miRNAs差異表達分析Figure 3 Analysis of differentially expressed miRNAs in response to drought stress

對篩選出的40 個差異表達miRNA 做層次聚類分析，將具有相同或相似表達行為的miRNA 進行聚類，總共分為7 大類。Type Ⅰ為下調表達的miRNA，其中2 個Known-miRNA（stu-miR482a-5p和stu-miR391-3p），7 個為Novel-miRNA，他們大多在干旱脅迫6 h 及以后表達量下降；Type Ⅱ為先下調后上調表達的miRNA，其中有3 個KnownmiRNA，1 個Novel-miRNA，他們在干旱脅迫3～12 h 被下調，12 h 后開始上調表達；Type Ⅲ為先下調后上調再下調表達的miRNA，2 個都為Known-miRNA（stu-miR162a-5p 和stu-miR162b-5p），他們在干旱脅迫3～6 h 下調表達，12 h 被上調，12 h 后又被下調；Type Ⅳ為表達無明顯規(guī)律的miRNA，總體呈上升趨勢，包括5 個KnownmiRNA 和2 個Novel-miRNA；TypeⅤ為先下調后上調再下調再上調的miRNA，共13 個，大多數(shù)都是Novel-miRNA，只有1 個Known-miRNA（stumiR8016）；TypeⅥ為上調表達的miRNA，2 個都是 Known- miRNA（stu- miR477b- 3p 和 stumiR477b-5p），他們在干旱脅迫6 h 開始逐漸被上調表達；TypeⅦ為先上調后下調表達的miRNA，包括1 個Known-miRNA（stu-miR477a-5p）和2 個Novel-miRNA，他們在24 h 后逐漸開始下調表達（圖3C）。

2.5 miRNA靶基因預測

靶基因的預測對于理解miRNA 的功能至關重要。鑒定到的621個miRNAs中有555個miRNAs被預測到了共9 222 個靶基因，其中分別有280 個Known-miRNAs 和275 個Novel-miRNAs 被預測到了6 889個和3 010個靶基因（表6）。對靶標基因只有1 個和2 個的miRNA 分析發(fā)現(xiàn)，Known-miRNA中同一家族的miRNA 靶基因相同，多個不同的Novel-miRNA 靶標同一基因，推測靶標同一基因的不同Novel-miRNA可能屬于同一家族。

表6 miRNA靶基因數(shù)目預測統(tǒng)計Table 6 Prediction statistics of the number of miRNA target genes

2.6 差異表達miRNA 的靶基因及KEGG 通路富集分析

對差異表達的40個miRNAs的靶基因進行分析，共有16個Known-miRNAs和21個Novel-miRNAs分別預測到558 和631 個靶基因。聯(lián)合靶基因預測結果和轉錄組數(shù)據(jù)，對上述miRNA 所對應的靶基因與轉錄組中差異表達的基因取交集，最終分別對16 個已知（表7）和17 個新miRNA（表8）的81 個和70個靶基因進行了功能注釋。

表8 差異表達新的miRNAs及其靶基因Table 8 Differential expression of novel-miRNAs and their target genes

由表7可以看出，靶基因中大多是與植物生長代謝有關的蛋白基因，例如：細胞色素P450、GDSL 脂酶、NADH 依賴性谷氨酸合成酶和UDP 糖基轉移酶超家族蛋白。參與馬鈴薯干旱脅迫響應及氧化還原的一些蛋白和酶類有漆酶、2-氧戊二酸和鐵（II）依賴性加氧酶超家族蛋白、氧化還原酶家族蛋白、鋅指（C3HC4型環(huán)指）家族蛋白和CDPK相關激酶等。還有一些與激素相關基因，例如：赤霉素生物合成所需基因、類生長素抗性基因和乙烯反應/乙烯調節(jié)核蛋白（ERT2）。同時，預測到一些參與植物生長發(fā)育及脅迫響應的轉錄因子，例如：TCP 家族轉錄因子、轉錄因子bHLH61和轉錄調節(jié)因子。另外，還有與植物晝夜節(jié)律相關蛋白TIMLESS 和一些保守的未被表征的假定蛋白。從注釋結果來看，一個miRNA 可靶標多個基因，不同miRNA也可能調控同一基因。

新的miRNA 預測出的靶基因參與馬鈴薯干旱脅迫的大多為各種蛋白和酶類。例如：ARM 重復序列超家族蛋白、含有P-環(huán)的核苷三磷酸水解酶超家族蛋白、2-氧戊二酸和鐵（II）依賴性加氧酶超家族蛋白、受體凝集素激酶（RLK）、真核天冬氨酰蛋白酶家族蛋白、轉錄因子B3 家族蛋白、蛋白磷酸酶2C 家族蛋白、bHLH DNA 結合超家族蛋白以及EIN3結合F-box蛋白等（表8）。沒有預測到參與脅迫響應的直接靶標轉錄因子。但從預測結果來看，屬于同一家族的新miRNA 的靶基因同源性較高。

在生物體內，不同的基因相互協(xié)調來行使生物學功能。將差異表達miRNA靶基因的通路注釋進行富集分析，選取富集顯著性最可靠（即Qvalue最小）的前20個通路進行結果展示（圖4）。差異表達miRNA的靶基因主要富集的前五個KEGG通路有谷胱甘肽代謝、倍半萜和三萜生物合成、其他類型的O-聚糖生物合成、脂肪酸伸長率和類固醇生物合成。其中，谷胱甘肽具有抗氧化和整合解毒作用，可防止自由基、過氧化物、脂質過氧化物和重金屬等活性氧對重要細胞成分的損傷，在植物應對干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。差異表達miRNA靶基因在苯丙烷代謝通路富集，苯丙烷代謝是重要的植物次生代謝途徑之一，其代謝產物，如木質素、類黃酮、花青素和有機酸等，在調控植物生長發(fā)育及對非生物脅迫響應中發(fā)揮重要功能。在干旱脅迫下，植物通過釋放α-亞麻酸重塑細胞膜的流動性，進而應答干旱脅迫。本研究中，差異表達miRNA靶基因通路也在α-亞麻酸代謝途徑富集。另外，還在細胞信號轉導重要組分鞘脂代謝通路、內質網中的蛋白加工通路、氨基酸生物合成以及基礎轉錄因子等通路中富集。

圖4 差異表達miRNA靶基因KEGG通路富集Figure 4 Enrichment of KEGG pathway of target genes with differential expressed miRNA

2.7 miRNA及其靶標的qRT-PCR表達驗證

為了檢測測序結果的可靠性，選取0，3，12和48 h 4 個處理時間點，使用qRT-PCR 對6 個miRNA（包括3個已知和3個新的miRNA）進行表達模式分析。定量表達結果與測序數(shù)據(jù)的miRNA 表達趨勢一致（圖5），表明測序結果真實可靠。

圖5 miRNA測序及qRT-PCR結果Figure 5 miRNA sequencing and qRT-PCR results

miRNA對其靶標轉錄后調控是通過對靶標剪切來實現(xiàn)的，因此為了驗證miRNA對靶標表達的調控作用，本研究對上述miRNA靶標基因的表達變化進行了qRT-PCR的驗證及分析。大多數(shù)靶標的表達表現(xiàn)出與miRNA 相反的趨勢，例如：stu-miR482a-5p、novel_miR_159和novel_miR_110在干旱脅迫后表現(xiàn)為先下調后上調，其靶基因StCLC-B和StAST、StALPL和StCYP以及StPP2C的相對表達量則表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，novel_miR_110 的靶基因StACL5在干旱處理48 h 內的表達量呈一直上升趨勢；stu-miR393-3p在干旱脅迫后表現(xiàn)為下調，而其靶基因StCHP1和StCHP2表現(xiàn)為上調；stu-miR391-3p 在干旱脅迫前12 h 表現(xiàn)為下調，在48 h 略有上升，其靶基因StELGP和StGBF的相對表達量則在前12 h 上升，之后逐漸下降；novel_miR_283 的相對表達量在前12 h下降，之后升高，其靶基因StPrp4的相對表達量在干旱48 h 內呈上升趨勢，而另一靶基因StpsbY的相對表達量則呈下降趨勢（圖6）。

圖6 miRNA及其靶基因的相對表達量Figure 6 Relative expression of miRNA and their target genes

3 討 論

馬鈴薯為淺根系作物，其整個生育時期都有可能受到干旱脅迫的影響。目前，植物對干旱脅迫的響應多集中在離子響應、脫落酸（Abscisic acid，ABA）依賴和非依賴途徑以及轉錄因子等研究[3,18,19]，關于miRNA 調控馬鈴薯干旱脅迫響應的報道較少[14-16,20]。因此，挖掘馬鈴薯中響應干旱脅迫的miRNA，進一步解析miRNA 及其靶基因之間的調控作用，為后期miRNA 的功能驗證奠定基礎，同時為闡明馬鈴薯參與干旱響應的分子機制提供理論依據(jù)。基于此，本研究通過20%PEG6000模擬干旱處理0，1，3，6，12，24 和48 h 共7 個時間點的14個馬鈴薯組培幼苗樣品進行small RNA測序。測序結果中，Known-miRNA與Novel-miRNA的長度分別在21 和24 nt 的序列最多（圖1），這與Zhang 等[15]、李瑩等[21]、Xu 等[22]和Wu 等[23]在馬鈴薯、棗樹、擬南芥和紫色馬鈴薯塊莖中的報道一致。推測miRNA 的長度分布與物種、取材部位以及處理條件有關。此外，還發(fā)現(xiàn)長度為21 nt 的Known-miRNA 在干旱脅迫3 h 后明顯減少（圖1），說明馬鈴薯在干旱脅迫3 h時即對miRNA進行大量調控。

miR319 被報道其參與植物葉片發(fā)育、花器官形成、花粉發(fā)育、衰老、晝夜節(jié)律和激素信號轉導等多種生長發(fā)育過程的調控[24]。本研究中，stumiR319-3p 在干旱脅迫24 h 時顯著上調（圖3），與擬南芥[7]以及紫花苜蓿[25]中在根和葉中都上調表達結果一致。靶基因預測有TCP家族轉錄因子、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶和碳酸氫鹽轉運蛋白家族等，這與前人報道的miR159/319 家族的miRNA 通過調控MYB/TCP 轉錄因子來響應干旱脅迫一致[24,26]。但是，關于馬鈴薯中miR319是否及如何與其他激酶和轉運蛋白等調控還有待進一步研究。

miR398和miR408家族在植物中較為保守，參與植物生長、發(fā)育和脅迫響應的調節(jié)，在植物遭到脅迫時對植物的生長發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。在本研究中，stu-miR398a-3p 和stu-miR408a-3p 的表達量在PEG 處理1 h 后即出現(xiàn)顯著上升（圖3），這與蒺藜苜蓿、擬南芥中miR398和miR408上調表達一致[27,28]。stu-miR408a-5p 的表達量在PEG 處理24 h后出現(xiàn)顯著下調（圖3），這與水稻干旱脅迫后miR408 下調表達一致[8]。因此，干旱脅迫下miR398和miR408的表達模式變化與物種、品種之間抗性以及成員有關。對stu-miR398a-3p、stumiR408a-3p 和stu-miR408a-5p 的靶基因預測結果顯示（表7），包括細胞色素P450（CYP450）、漆酶（LAC）、GDSL 脂酶以及四三肽重復序列樣超家族蛋白等，這與前人已報道的擬南芥miR408 的靶基因有Laccase和蒺藜苜蓿中miR398 的靶基因有COX5b有相似之處。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，其在防御反應以及木質素和植物次生壁合成過程起重要作用。已有報道表明，AtLAC4過量表達植株在干旱處理后耐旱能力比野生型明顯增強[29]。因此，在后續(xù)的研究中，可以進一步關注miRNA及其靶基因LAC在馬鈴薯干旱脅迫響應中的調控機理。也表明在干旱脅迫過程中，同一靶基因可能受到多個miRNA同時調控以應答脅迫環(huán)境。

miR482是植物中一個古老且相對保守的miRNA超家族，在植物的生長發(fā)育和抗病抗逆過程中發(fā)揮重要的作用[30]。在本研究中，stu-miR482a-5p在干旱處理6 h后被顯著下調（圖3），與miR482在大豆中下調一致[31]；但stu-miR482e-3p在脅迫處理48 h后被顯著上調（圖3），與鹽脅迫下miR482.2 在楊樹[32]和干旱脅迫下miR482 在大豆[33]中被上調一致。在靶基因預測中，stu-miR482a-5p 靶向基因有轉錄調節(jié)因子（Transcription regulators，TRs）、類萌發(fā)素蛋白（Germin-like proteins，GLPs）以及氧化還原酶家族蛋白（Oxidoreductase family protein）等；而stu-miR482e-3p則主要靶向含NB-ARC結構域的抗病蛋白（NB-ARC domain-containing disease resistance protein）（表7）。關于該家族成員是如何協(xié)同植物各類生長發(fā)育以及代謝相關蛋白和轉錄因子，去抵御干旱及其他非生物脅迫，還有待進一步研究。

盡管，本研究鑒定出一些響應馬鈴薯干旱脅迫的miRNA，他們主要通過調節(jié)生物合成、生長代謝、氧化還原反應等過程來響應脅迫環(huán)境。但是，挖掘出的這些miRNA 是通過何種調控途徑來響應干旱脅迫的分子機制研究，還需進一步通過轉基因等手段驗證。本研究結果為后續(xù)深入研究miRNA調控馬鈴薯干旱脅迫響應的分子機制提供線索，為抗旱種質資源的篩選和抗旱品種的選育提供理論依據(jù)。