邢鈴苓 劉洪

（1.四川大學華西第二醫(yī)院醫(yī)學遺傳科／產(chǎn)前診斷中心；2.四川大學華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室，四川成都，610041）

1 概述

正常人血液及體液循環(huán)中存在來源于細胞核DNA和線粒體DNA的少量游離DNA（cell free DNA，cfDNA）。1997年，Lo等人［1］在母體血漿中發(fā)現(xiàn)了游離的胎兒DNA片段（cell free fetal DNA，cffDNA）。cffDNA主要來自胎盤和胎兒細胞，片段較小，長度在75bp～205bp左右。胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌cffDNA進入母體血漿，在孕4周左右即可檢出，孕8周建立胎盤循環(huán)后cffDNA則以一定比例穩(wěn)定存在于母體外周血血漿中（圖1）。妊娠使母體循環(huán)中cfDNA的總量增加了約3%～13%。胎兒游離DNA濃度（fetal fraction，F(xiàn)F）是cffDNA占母體cfDNA總量的百分比［FF＝cffDNA／（cffDNA＋母源cfDNA）×100%］。既往研究表明，受孕婦和胎兒特征的影響，F(xiàn)F在孕10至15周之間約為10%～20%［2-3］。無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non-invasive prenatal screening，NIPS）就是采用大規(guī)模平行測序等技術(shù)檢測孕婦外周血血漿游離DNA，對測序結(jié)果進行生物信息學分析，來量化胎兒染色體非整倍體異常的風險。該檢測技術(shù)于2011年進入臨床應(yīng)用，因篩查效能高于傳統(tǒng)血清學篩查，逐步成為美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會（ACOG）推薦的染色體非整倍體一線篩查方法。在我國，NIPS也在臨床廣泛應(yīng)用。其中，F(xiàn)F是影響NIPS檢測準確性的重要因素，F(xiàn)F過低也是NIPS檢測失敗的主要原因。

圖1 孕婦血漿cfDNA的來源［5］

研究表明，因低FF導致NIPS檢測失敗的孕婦群體，其胎兒發(fā)生染色體異常的風險較普通孕婦群體偏高［4］。本文主要對影響FF的胎兒因素、母體因素、實驗室因素進行探討，并結(jié)合孕婦相關(guān)臨床特征、妊娠結(jié)局對進一步產(chǎn)前檢查的選擇進行探討，以期為臨床遺傳咨詢提供參考。

2 NIPS中FF的檢測方法

FF是NIPS測序結(jié)果的主要生物信息學分析質(zhì)控因素，現(xiàn)有的FF檢測方法如表1［6］。

表1 現(xiàn)有不同F(xiàn)F檢測方法的優(yōu)勢及局限

2.1 基于DNA片段大小的方法 cfDNA的大小分布在不同群體中具有共同的特征，呈“階梯”狀分布，在166bp處有一個優(yōu)勢峰。然而，cfDNA由于特定的起源組織而表現(xiàn)出輕微的差異特征。胎兒和母體cfDNA片段的優(yōu)勢峰分別為143 bp和166 bp［7］，即胎兒cfDNA通常比母體cfDNA短。因此，較高的FF在理論上應(yīng)該與短cfDNA分子的百分比增加有關(guān)。該方法的關(guān)鍵是找到分屬于胎兒和母體本身的片段長度區(qū)間，然后計算出胎兒序列片段的占比。2014年，Lo等通過計算孕婦血樣中長度在100～150bp之間的DNA片段與長度在163～169bp之間的DNA片段的相對比例來估算胎兒濃度，并與基于Y染色體的方法對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種估算胎兒濃度的結(jié)果高度一致［8］。

2.2 基于SNP位點親本基因型的方法 這是一種通過檢測雙親單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點來確定FF的方法。由于胎兒的遺傳物質(zhì)一半來自父親，另一半來自母親，對于父親和母親均為純合但基因型不同的SNP位點，胎兒的基因型為雜合。因此，基于此種SNP位點，通過識別母體血漿中胎兒特異性等位基因，計算其與血漿中總等位基因的比率是量化FF的直接而準確的方法。但這種方法的可行性受樣本限制，因為臨床上常規(guī)NIPS只收集孕婦的外周血樣本，父親血樣的獲取比較困難。

2.3 基于Y染色體的方法 孕婦血漿中的Y染色體DNA片段通常來自男性胎兒。在以往基于Y染色體測定FF的研究中，使用最多的方法是定量熒光擴增（quantitative fluorescence amplification，qPCR），該方法主要通過對孕婦血漿中Y染色體上的基因（如SRY、DYS14、ZFY等基因）定量來代表胎兒來源DNA量，對X染色體上的基因如ZFX定量來代表游離DNA總量。另外，臨床上利用二代測序數(shù)據(jù)來分析Y染色體的含量的方法，降低了成本、提高了效率［9］。雖然基于Y染色體的方法簡單準確，但只能針對男胎，不適用于女胎。

2.4 基于母體cfDNA高深度測序 為了消除對親本基因型信息的依賴，科學家們開發(fā)了一種被稱為FetalQuant的方法，通過使用高深度靶向大規(guī)模平行測序來測量FF，該方法的預(yù)測結(jié)果與基于親本基因型的方法推導的結(jié)果非常接近，但局限性為測序深度需要高達120x才能可靠地確定胎兒等位基因［10］。

2.5 SeqFF模型 Sung K.Kim團隊開發(fā)的SeqFF模型，嘗試從NIPS常規(guī)深度的測序數(shù)據(jù)中直接計算胎兒DNA分數(shù)。這是一種更加準確和高效的方法，但是這種高維模型在構(gòu)建過程中需要大規(guī)模的樣本數(shù)據(jù)，且當FF低于5%時，性能大大降低，可能是因為FF＜5%的病例數(shù)相對較少，不足以構(gòu)建Enet模型［11］。

2.6 基于核小體軌跡的方法 血漿DNA核小體測定FF是一個比較熱門的方向。Straver等收集孕婦血樣，基于游離DNA的單端測序數(shù)據(jù)生成全基因組核小體圖譜，以產(chǎn)生假設(shè)的“核小體軌跡”。研究發(fā)現(xiàn)核小體中心上下游73 bp區(qū)域內(nèi)的reads數(shù)與FF呈正相關(guān)。然而，相關(guān)系數(shù)僅為0.636，較其他方法低。因此，基于“核小體軌跡”的方法有待進一步開發(fā)［12］。

2.7 基于甲基化的方法 母胎存在甲基化差異性位點，Nygren團隊開發(fā)了一種FF檢測方法-FQA，通過比較胎盤組織和母體血沉棕黃層的5個差異甲基化區(qū)域，測量甲基化敏感限制性內(nèi)切酶酶切后的總DNA（母體和胎兒）和胎兒甲基化DNA的拷貝數(shù)來估算FF。其檢測結(jié)果與基于Y染色體的定量方法具有較好的一致性。但因?qū)嶒炆婕凹谆舾邢拗泼傅南?，其穩(wěn)定性還需要更多的實驗驗證［13］。

大規(guī)模平行亞硫酸鹽測序作為另一種基于甲基化的方法，是根據(jù)cffDNA在差異甲基化區(qū)域的比例來估算FF［14］。有研究利用全基因組亞硫酸氫鹽測序獲取cfDNA的甲基化譜，分析了多個甲基化標記區(qū)域關(guān)聯(lián)組織的甲基化譜來推斷血漿中不同組織的占比［15］。這種方法與基于親本基因型的方法對比，準確性得到了驗證，但檢測成本較高。

3 低FF發(fā)生率

國際產(chǎn)前診斷學會（ISPD）發(fā)表的聲明提示，在一些大型實驗室報告中NIPS檢測失敗率約為1.9%～6.4%［16］。不同測序平臺，包括Verinata，LifeCodexx，Sequenom，BGI，Ariosa，Natera等，報告的檢測失敗率范圍從1.6%到6.4%不等［17］。多中心研究表明，F(xiàn)F低于4%是NIPS檢測失敗的主要原因（41.88%～100%，71.32%），其他原因包括測序失敗以及母體外周血血漿總DNA濃度高于質(zhì)控標準等。筆者匯總了國內(nèi)外部分NIPS檢測實驗室提供的檢測失敗率及FF＜4%占比情況，檢測失敗率低于前期文獻報道，見表2。

表2 國內(nèi)外醫(yī)院NIPS樣本的檢測失敗率及FF＜4%占比A

4 FF的影響因素

FF存在較大的個體間差異，任何增加母體貢獻和／或減少胎兒、胎盤貢獻的疾病都可能降低FF。除母體、胎兒、胎盤以外，實驗室技術(shù)和FF的計算方法也可能影響FF。近期一篇文章總結(jié)了FF的影響因素，見表3［5］。

表3 影響FF的相關(guān)因素引起FF變化的情況

4.1 cffDNA過低（胎兒因素）4.1.1 胎齡 現(xiàn)有研究表明，F(xiàn)F通常與孕周（胎齡）呈正相關(guān)，不同妊娠階段的胎兒DNA分數(shù)增加速率不同，可能是由于隨著胎齡的增加，胎盤體積逐漸增加，凋亡滋養(yǎng)層細胞也逐漸增加導致更多的cff DNA片段被釋放到母體血漿中，導致FF增加［24-26］。

4.1.2 胎兒染色體異常 既往研究表明，低FF導致NIPS失敗的孕婦中，胎兒三倍體較常見，且胎兒非整倍體的風險增高。NIPS檢測失敗后報告的非整倍體包括：T13、T18、T21、T16嵌合和X單體［5］。同時，懷有非整倍體胎兒的孕婦血漿中FF隨非整倍體類型不同而有差異［3，26-28］。研究發(fā)現(xiàn)，T21、T18和T13胎兒的孕婦Z值與FF之間存在很強的正相關(guān)關(guān)系，而在T18低風險樣本中觀察到負相關(guān)［29］。與T21相比，T13和T18的中位FF值較低，總體檢出率也較低［30-32］。這些發(fā)現(xiàn)或許可以通過T18和T13的胎兒生長受限或胎盤尺寸較小導致FF小于整倍體胎兒來解釋，進而可以部分解釋為何NIPS對T21的檢測效能優(yōu)于T18和T13。4.1.3 其他 胎兒頂臀長、嵌合等也被一些學者認為可影響FF。FF隨CRL增加而增加，胎盤嵌合FF減少［3，33］。

4.2 母源cfDNA過高（母體因素） FF降低的另一種可能是由于稀釋效應(yīng)或由于母體cfDNA的增加而導致cffDNA含量的相對降低。任何可引起cf DNA增高的母體因素均可引起母體外周血cffDNA濃度降低，即FF降低［3，32］。

4.2.1 孕婦BMI值 母體BMI值過高是FF過低致NIPS檢測失敗的相關(guān)因素之一。隨著孕婦BMI升高，循環(huán)血容量增加導致血漿中游離DNA總量增加，稀釋了胎兒來源的cfDNA，導致FF降低。另外，肥胖孕婦血漿中的母體cfDNA不僅來源于凋亡造血細胞，還來自脂肪和基質(zhì)血管組織的凋亡和壞死細胞［28］。

4.2.2 孕婦自身疾病及妊娠相關(guān)并發(fā)癥 本中心NIPS隨訪數(shù)據(jù)提示，總cfDNA濃度過高的孕婦中，約70%合并了自身免疫性疾?。╯ystemic autoimmune diseases，SAD）如抗凝脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、干燥綜合征（sjogren syndrome，SS）以及妊娠高血壓（pregnancy induced hypertension，PIH）等妊娠相關(guān)并發(fā)癥。與總cfDNA濃度正常的相比，有統(tǒng)計學差異。

根據(jù)孕婦BMI與FF的負相關(guān)性推測，臨床上常伴有肥胖的疾病如多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、激素治療的SAD和糖尿病也可能會導致FF降低，使NIPS失敗的發(fā)生率增加，但目前的研究結(jié)果尚未證實這一觀點［34］。

對于有母體疾病或并發(fā)癥的患者，母體血漿cfDNA的濃度普遍增加［35］。母體合并腫瘤，cf DNA含量增加可能與腫瘤細胞壞死和凋亡有關(guān)，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）可通過降低血漿中cffDNA的占比而增加NIPS假陰性的可能性。

SAD是一種多因素疾病，其特征是出現(xiàn)自身反應(yīng)性免疫細胞和特異性自身抗體。多種疾病機制包括細胞凋亡、壞死、炎癥反應(yīng)或活性細胞的釋放，都被認為是這些SAD患者cfDNA的來源。此外，cfDNA產(chǎn)生和清除之間的不平衡已被假定為另一種機制［36］。值得注意的是，一項研究顯示APS患者與健康受試者孕婦的cffDNA定量分析結(jié)果無顯著性差異［37］。這表明，孕婦增加的cfDNA部分可能主要來自母體細胞，而不是胎兒細胞。同樣，現(xiàn)有文獻表明SLE及SS患者的cfDNA濃度較正常人群明顯升高。此外，與處于非活動期的患者相比，處于疾病活動期的SLE患者的cfDNA水平更高［38-39］。

同時，越來越多的證據(jù)表明，胎盤來源的cff DNA升高與PIH相關(guān)，PIH作為產(chǎn)科常見疾病，是妊娠特有的一種綜合征。關(guān)于PIH與cf DNA的關(guān)系，前期研究提示妊娠中轉(zhuǎn)運的母、胎cfDNA濃度與PIH異常增高，且DNA釋放量與疾病嚴重程度相關(guān)。亦有學者指出［40］，在PIH預(yù)測中，總cfDNA似乎比cffDNA增加更明顯，cffDNA水平升高與妊娠并發(fā)癥之間沒有關(guān)系，但總cfDNA作為PIH的生化標志物發(fā)揮作用，則需要具有同質(zhì)人群和標準化方法的大型前瞻性研究來進一步確認其預(yù)測價值［40-44］。究其機制，PIH患者的主要病理學因素可能是由于滋養(yǎng)層不能有效地侵入蛻膜和缺乏動脈導管壁的侵入導致胎盤的缺陷，胎盤滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細胞凋亡率增加，引起更多的cffDNA釋放入血，cffDNA在PIH出現(xiàn)癥狀之前水平的增加可能是由于缺氧和氧化應(yīng)激導致胎盤細胞凋亡和壞死增加，另外cff DNA可以通過激活先天免疫DNA傳感器來損害滋養(yǎng)層遷移，從而對胎盤功能產(chǎn)生局部影響；有研究發(fā)現(xiàn)PIH的孕婦有核細胞通透性增高，在PIH發(fā)生前的幾個星期，母循環(huán)中有核紅細胞的數(shù)量異常增加，cfDNA升高可能還與其清除率下降有關(guān)，因為在PIH患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括肝臟、腎臟在內(nèi)的病理學改變，因此可能器官損害導致cfDNA清除異常，最終導致cfDNA水平升高；與正常妊娠源性cff DNA相比，PIH的cffDNA增加了炎癥細胞因子水平，循環(huán)cfDNA和cffDNA升高可誘發(fā)胎盤炎癥反應(yīng)，導致PIH病理特征加速［45-50］。

4.2.3 孕期用藥 既往研究發(fā)現(xiàn)，低FF導致的NIPS失敗可能發(fā)生在多達18%的接受低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）治療的孕婦中，即使在控制了母親體重和過度緊張之后，與未經(jīng)治療的女性相比也有顯著差異［51-52］?？赡艿臋C制包括，肝素對DNA聚合酶具有很強的親和力，并影響PCR檢測中Mg2＋的濃度；孕婦血漿DNA中含有較高比例的小片段DNA，其GC含量很高。將采集血液樣本的時間調(diào)整到下一次用藥前，可能會提高這些孕婦復(fù)查NIPS的成功率［53］。同時，也有一些學者指出，這些研究缺乏適當?shù)姆椒?，證據(jù)不足。母體因素可能是cfDNA濃度升高的主要原因，低FF和LMWH之間的關(guān)系是由于潛在的疾病而不是治療本身［54］。然而，美國婦產(chǎn)科學雜志近期發(fā)表的一篇文章認為，使用抗凝藥（非阿司匹林）與cfDNA片段大小或GC含量的差異無關(guān)，且染色體水平Z值的差異不會對臨床非整倍體檢測產(chǎn)生影響。這表明抗凝治療對FF可能有稀釋作用，從而導致基于cfDNA的NIPS檢測失敗，而不是實驗室或測序水平的變化［55］。LMWH和低FF導致NIPS失敗之間相互作用的確切機制仍有待闡明。4.3 實驗室因素 FF的測量并不精確，目前的方法無法對FF進行可靠、一致地估算，實驗室之間的FF閾值也存在很大差異，低于閾值就無法獲得檢測結(jié)果［56］。閾值取決于每個實驗室使用的技術(shù)平臺和生物信息學算法，以及單個樣本特征。實驗室應(yīng)對其檢測范圍和低FF結(jié)果閾值進行內(nèi)部驗證［61］。

生物信息學分析方法可能對FF的測定產(chǎn)生較大的影響。以基于DNA片段大小的方法為例，由于胎兒來源的DNA通常較短，而母源DNA中較短的片段可能會被誤解為胎兒來源。未來的研究應(yīng)以建立最佳的生物信息學工具為方向。

5 NIPS檢測失敗的孕婦妊娠結(jié)局追蹤

筆者摘取了四川大學華西第二醫(yī)院378例NIPS檢測失敗病例隨訪資料［18］，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前、產(chǎn)后共檢出15例染色體異常，約10%的孕婦出現(xiàn)異常妊娠結(jié)局；在染色體異常病例中，拷貝數(shù)變異占66.67%（10／15），見表4。另有不同研究中心NIPS測試失敗后行羊水細胞核型分析的染色體異常，見表5。上述結(jié)果提示，由于核型分析分辨率的局限，NIPS檢測失敗的病例中，胎兒染色體異常比例可能高于既往研究報道。

表4 四川大學華西第二醫(yī)院NIPS檢測失敗病例妊娠結(jié)局［18］

表5 不同研究中NIPS測試失敗情況下的染色體異常率

6 進一步產(chǎn)前檢測方法選擇的思考

ISPD在2023年聲明指出，胎兒游離DNA濃度是一項重要的質(zhì)控指標，但實驗室之間和檢測方法之間存在很大差異，實驗室應(yīng)對其檢測限和檢測失敗結(jié)果的閾值進行內(nèi)部驗證。醫(yī)療服務(wù)提供者（實驗室和臨床醫(yī)生）應(yīng)建立臨床路徑，以管理NIPS檢測失敗的患者。這可能包括詳細的超聲檢查、提供重復(fù)NIPS、替代篩查試驗和／或產(chǎn)前診斷［61］。

根據(jù)首次NIPS檢測失敗的原因規(guī)范臨床路徑管理對于為孕婦提供準確的信息和減少焦慮非常重要［62］。以FF＜4%導致NIPS檢測失敗為例，臨床醫(yī)生在提供建議前，要考慮到以下因素［5］：

（1）孕婦的身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）是多少？

（2）是否有可能的相關(guān)母體疾?。ㄈ缈鼓C合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾??；妊娠高血壓等并發(fā)癥）？

（3）是否使用低分子量肝素或其他抗凝藥物？

（4）是否通過輔助生殖技術(shù)懷孕，是否已通過超聲檢查確定妊娠情況？

（5）是否為多胎妊娠？絨毛膜性如何？

（6）超聲是否提示染色體異常相關(guān)表型？

進一步可選的非整倍體風險評估方式包括：

6.1 NIPS重采血復(fù)檢 研究提示，在NIPS首次檢測失敗的孕婦進行重采血復(fù)檢，超過60%的孕婦獲得了有效的NIPS結(jié)果。且FF＜4%或Z值臨界致NIPS失敗的孕婦，其復(fù)檢成功率遠高于因基因組圖譜改變（z值異常）致NIPS失敗的病例［21-23，62］。若孕婦的產(chǎn)前超聲等檢查正常，且未合并影響FF的情況，同時孕婦明確表達希望避免介入性產(chǎn)前診斷，則可以為她提供染色體非整倍體的替代篩查如妊娠中期血清學聯(lián)合篩查，或重復(fù)抽血進行NIPS。需要特別考慮到孕周，通過重采血復(fù)檢獲得有效NIPS結(jié)果的成功率隨著胎齡的增加而增加，但可能會導致胎兒非整倍體產(chǎn)前診斷時機延遲。因此，重采樣時間應(yīng)嚴格把控，保證孕婦在NIPS重采血復(fù)檢失敗時，能有時機進行血清學聯(lián)合篩查或介入性產(chǎn)前診斷；復(fù)檢結(jié)果提示高風險時，能夠進行介入性產(chǎn)前診斷。若孕婦正在使用低分子肝素，則建議其在下一次用藥前采樣。

6.2 介入性產(chǎn)前診斷 美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會（ACOG）和母胎醫(yī)學協(xié)會（SMFM）提出，低FF導致NIPS檢測失敗的人群發(fā)生非整倍體的風險增加，這些患者應(yīng)進一步接受遺傳咨詢，并提供全面的超聲評估和診斷性檢測。他們指出，那些在適當?shù)脑兄懿裳脑袐D，雖然可以再次檢測，但可能導致胎兒非整倍體異常的診斷延遲，可能會限制生育選擇，而且只有50%～60%的重復(fù)篩查可成功得到檢測結(jié)果［60-64］。且有研究表明NIPS失敗的胎兒染色體異常類型主要為拷貝數(shù)變異（66.67%），這使得NIPS檢測失敗病例染色體異常發(fā)生率較以往研究增加［18］。此外，雖然羊膜腔穿刺術(shù)和絨毛取樣（CVS）的妊娠期胎兒丟失率分別約為1／1000和1／500［65-66］，但有創(chuàng)手術(shù)后進行的產(chǎn)前診斷檢查成功率高，使孕婦能夠根據(jù)隨后的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果更好地決定妊娠管理。文獻表明，檢測產(chǎn)前樣本（羊水、臍血或絨毛組織）的總體成功率可高達98%～99%，幾乎不受樣本類型的影響［67-68］。因此，權(quán)衡利弊，對于胎齡相對較大的孕婦在NIPS失敗后進行介入性產(chǎn)前診斷確定胎兒是否有染色體異常比不進行的孕婦綜合風險更小，更有利于臨床醫(yī)生及孕婦決定隨后的妊娠管理。

6.3 其他 對于重采血復(fù)檢仍提示FF＜4%，且孕婦自身合并了影響FF因素的孕婦，可在充分告知不同檢測技術(shù)的優(yōu)勢、局限性及風險前提下，遵循孕婦意愿選擇其他替代篩查或介入性產(chǎn)前診斷。另外，研究提示低FF導致NIPS失敗的孕婦發(fā)生早產(chǎn)的風險增加［69］，但低FF在預(yù)測不良妊娠結(jié)局方面的價值需要進一步確定［70］。遺傳咨詢時臨床醫(yī)生可提醒孕婦警惕早產(chǎn)的可能性。