余乃通，冼淑麗，尹慧祥，趙羽涵，鄭小寶，劉志昕

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101;2.海南省熱帶微生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101;3.清華大學(xué)附屬中學(xué)文昌學(xué)校，海南 文昌 571300）

【 研究意義】木薯（Manihot esculentaCrantz）是世界熱區(qū)的重要口糧，也是重要的熱帶能源作物之一。木薯具有較強(qiáng)的耐旱、耐貧瘠能力，適應(yīng)性強(qiáng)，目前已在世界熱區(qū)廣泛種植［1-2］。然而，由木薯雙生病毒（Cassava mosaic geminivirus,CMVs）感染引起的木薯花葉?。–assava mosaic disease,CMD）是世界木薯產(chǎn)業(yè)的主要限制因素，在非洲和東南亞廣泛流行。引起CMD 的CMVs 病原及其變種有11 種，包括非洲木薯花葉病毒（African cassava mosaic virus,ACMV）、斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV）、南非木薯花葉病毒（South African cassava mosaic virus,SACMV）等［3］。20 世紀(jì)初，SLCMV首先在斯里蘭卡被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，目前已在亞洲的柬埔寨、泰國(guó)、越南、老撾、印度和中國(guó)等國(guó)家發(fā)現(xiàn)［4］。2018 年，在我國(guó)的福建和海南木薯上首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了木薯花葉病的病原，即SLCMV［5-6］，序列分析顯示，SLCMV 中國(guó)分離株和斯里蘭卡分離株以及印度分離株序列高度相似，同源性在98.5%以上。中國(guó)學(xué)者對(duì)SLCMV 及其他木薯雙生病毒研究尚屬起步階段，且國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源對(duì)SLCMV的抗性背景也不清楚。此外，從亞洲各地區(qū)分離的不同SLCMV 株系，其致病性差異還未有研究。因此，開展SLCMV 病毒侵染性克隆及鑒定是解決上述問題的重要前期基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SLCMV 是雙生病毒科（Geminiviridae）的菜豆金色黃花葉病毒屬（Begomovirus）成員，其基因組由2 條大小約2 800 nt 的單鏈環(huán)狀DNA 組分組成，即DNA-A 組分和DNA-B組分［7-8］。本研究中SLCMV TVM3株系的DNA-A組分（GenBank序列號(hào)：KP455486.1）全長(zhǎng)為2 747 nt，其正義鏈上含有2 個(gè)開放閱讀框（ORF）：AV1 和AV2，分別編碼外殼蛋白（Coat protein,CP）和AV2 蛋白；反義鏈含有4個(gè)ORF：AC1、AC2、AC3 和AC4，分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（Replication-associated protein,Rep）、轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Transcriptional activator protein,TrAP）、復(fù)制增強(qiáng)子（Replication enhancer,REn）和RNA 沉默抑制子AC4 蛋白。DNA-B 組分（GenBank 序列號(hào)：KP455487.1）全長(zhǎng)為2 741 nt，其正義鏈和反義鏈各含有1 個(gè)ORF，即BV1 和BC1，分別編碼核穿梭蛋白（Nuclear shuttle protein,NSP）和運(yùn)動(dòng)蛋白（Movement protein,MP）［9］。根據(jù)DNA-A組分全長(zhǎng)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Legg 等［10］把11種CMVs 及其變種分成3 組，分別為南亞組、西非組和東南非組。在亞洲地區(qū)，木薯花葉病由印度木薯花葉病毒（Indian cassava mosaic virus,ICMV）和SLCMV 的2 個(gè)株系感染引起，均屬南亞組［11］。早在1993 年，就有學(xué)者成功構(gòu)建了木薯花葉病毒侵染性克?。?2］。2002年，Saunders等［13］也成功構(gòu)建了SLCMV 的侵染性克隆，初步闡明SLCMV 最早可能是單組分病毒，進(jìn)化過程中獲取了DNA-B 組分從而成為雙組分病毒。

【本研究切入點(diǎn)】雖然木薯花葉病已在中國(guó)福建和海南等地方出現(xiàn)，但目前尚未在我國(guó)發(fā)生流行和大面積危害；國(guó)內(nèi)木薯品種抗性不明及抗病種質(zhì)資源缺乏的現(xiàn)狀仍然存在，木薯花葉病一旦流行，將對(duì)我國(guó)木薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害和經(jīng)濟(jì)損失。因此，開展病毒侵染性克隆構(gòu)建是探究國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病遺傳背景的有效手段?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的病毒侵染性克隆，可通過農(nóng)桿菌將含有目的病毒片段的質(zhì)粒介導(dǎo)到植物體內(nèi)，從而激活病毒蛋白表達(dá)和產(chǎn)生病毒全長(zhǎng)基因組，最后包裝成有侵染活性的病毒粒子，用于SLCMV 與宿主相互作用研究。本研究以SLCMV TVM3 株系為研究對(duì)象，旨在構(gòu)建不含有編碼區(qū)重復(fù)序列的病毒侵染性克隆，且能成功感染本生煙和擬南芥等模式植物，為下一步國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病遺傳背景的精準(zhǔn)鑒定、病毒基因功能鑒定以及病毒致病機(jī)理研究等提供重要前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301 由本實(shí)驗(yàn)保存；EasyTaq DNA Polymerase、GV3101（pSoupp19）農(nóng)桿菌感受態(tài)、大腸桿菌DH5a 感受態(tài)、質(zhì)粒快速小提試劑盒、2k DNA Marker、12k DNA Marker 均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；快速植物DNA 提取試劑盒（RaPure Plant DNA Mini Kit）購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司；T4 DNA 連接酶、SacI、SalI 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；本生煙（Nicotiana benthamiana）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 pDNA-A 和pDNA-B 侵染性克隆載體構(gòu)建

以全長(zhǎng)為2 747 nt 的SLCMV DNA-A 為模板，構(gòu)建DNA-A 侵染性克隆載體。如圖1A 所示，該侵染性克隆序列除了含有完整的DNA-A 全長(zhǎng)序列外，其5′端還額外含有145 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段（DNA-A+2603～+2747），3′端也額外含有137 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段（DNA-A+1～+137），兩端分別含有SacI 和SalI 酶切位點(diǎn)。將此DNA-A侵染性克隆序列送往通用生物(安徽)股份有限公司合成，通過T4 DNA 連接酶（16 ℃）構(gòu)建到pCAMBIA1301 載體中，即pCAMBIA1301-DNA-A（pDNA-A）。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將pDNA-A 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取1 個(gè)重組子進(jìn)行Sanger 測(cè)序，所用引物依次為1301-F、1301-R、DNA-A-seq1～DNA-A-seq4（表1）；同時(shí)提取質(zhì)粒，用SacI 和SalI 雙酶切驗(yàn)證。

表1 所使用的引物列表Table 1 Primers used in this study

圖1 pDNA-A（A）和pDNA-B（B）侵染性克隆構(gòu)建示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the construction of pDNA-A(A) and pDNA-B (B) infectious clone

以全長(zhǎng)為2 741 nt 的SLCMV DNA-B 為模板，構(gòu)建DNA-B 侵染性克隆載體。如圖1B 所示，該侵染性克隆序列除了含有DNA-B 完整的全長(zhǎng)序列外，其5′端還額外含有106 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段（DNA-B+2636～+2741），同樣，其3′端也額外含有119 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段（DNA-B+1～+119）。其他步驟同DNA-A，所用引物依次為1301-F、1301-R、DNA-B-seq1～DNA-B-seq4（表1）。

1.3 侵染性克隆接種本生煙和擬南芥植株

采用液氮凍融法，將pDNA-A、pDNA-B 分別轉(zhuǎn)入GV3101（pSoup-p19）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單菌落至500 μL 含有抗生素（50 μg/mL Kan,50 μg/mL Rif,50 μg/mL Strep）的LB 液體培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)，28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h；按照1:50的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)加入終濃度為20 mol/L 的AS 和10 mmol/L 的Mes，28 ℃震蕩過夜培養(yǎng)；4 ℃、5 000 r/min 離心10 min，去上清，菌體沉淀用500 μL 溶液（150 μmol/L AS,10 mmol/L Mes,10 μmol/L MgCl2）重懸，測(cè)定菌液OD600值，使兩者的菌液OD600值一致（濃度范圍0.4～0.6）；然后1:1 混合兩者的菌液，室溫靜置3～5 h；用0.2 mL 的無針頭注射器將50 μL 處理好的農(nóng)桿菌注入本生煙（5～6 葉期）葉片下表皮的葉脈之間，每個(gè)葉片注射1 個(gè)點(diǎn)，每株注射3 個(gè)葉片，共接種10 棵本生煙植株，同時(shí)設(shè)置接種空質(zhì)粒的本生煙為對(duì)照，置于25 ℃精細(xì)培養(yǎng)房培養(yǎng)。

另將混勻的農(nóng)桿菌侵染液倒入淺口容器中，將擬南芥植株（5～6 葉期）的花絮和莖浸入侵染液，靜置1 min，共接種10 棵擬南芥植株，同時(shí)設(shè)置接種空質(zhì)粒的擬南芥為對(duì)照，置于25 ℃精細(xì)培養(yǎng)房培養(yǎng)。

1.4 癥狀觀察及PCR 檢測(cè)

SLCMV 侵染性克隆通過GV3101 農(nóng)桿菌接種本生煙和擬南芥植株后，每隔2～3 d 觀察并記錄植株癥狀。接種14 d（擬南芥接種18 d）后，采集本生煙和擬南芥植株的第3 片或第4 片新生葉片，用試劑盒（RaPure Plant DNA Mini Kit）提取其總DNA，利用引物DNA-A 2000F 和DNA-A 2400R（擴(kuò)增目的片段約400 bp）、以及DNA-B 370F 和DNA-B 800R（擴(kuò)增目的片段約430 bp）兩對(duì)引物分別對(duì)病毒兩個(gè)組分進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL 于1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.5 SLCMV 侵染性克隆感染率檢測(cè)

本生煙和擬南芥植株接種SLCMV 侵染性克隆后，每隔2～3 d 觀察并記錄植株癥狀，在第30 d 采集本生煙（10 株）和擬南芥（10 株）植株的新生葉片，利用引物DNA-A 2000F 和DNA-A 2400R 對(duì)病毒進(jìn)行PCR 檢測(cè)，PCR 程序同上。取5 μL PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，分別計(jì)算SLCMV 在本生煙和擬南芥植株中的感染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLCMV 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建

將獲得的pDNA-A 和pDNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示均得到了3.1 kb左右的目的片段和12 kb 左右的載體片段（圖2），Sanger 測(cè)序表明其序列與目標(biāo)序列一致，說明pDNA-A、pDNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功；即成功獲得了SLCMV 侵染性克隆質(zhì)粒pCAMBIA1301-SLCMV，可用于下一步的病毒接種實(shí)驗(yàn)。

圖2 SLCMV DNA-A 和DNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建Fig. 2 Construction of SLCMV DNA-A and DNA-B infectious clone plasmids

2.2 SLCMV 侵染本生煙和擬南芥植株癥狀觀察及分子檢測(cè)

本生煙接種SLCMV 侵染性克隆7 d 后，大部分本生煙植株新生葉片無明顯癥狀；而在接種第10 d，本生煙植株的新生葉片開始出現(xiàn)扭曲、斑點(diǎn)褪綠等癥狀；接種第14 d，本生煙植株新生葉片出現(xiàn)嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀；對(duì)照組新生葉片無癥狀（圖3A）。PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在接種SLCMV 的第14 d，染病本生煙植株新生葉片DNA中可檢測(cè)出DNA-A和DNA-B的特異性條帶，而對(duì)照植株無任何條帶（圖3B），表明SLCMV 病毒已在本生煙植株成功復(fù)制并產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。

圖3 SLCMV 侵染本生煙癥狀（A）及分子檢測(cè)（B）Fig. 3 Symptoms (A) and molecular detection (B) of tobacco plants infected by SLCMV

接種SLCMV 侵染性克隆7 d 后，大部分?jǐn)M南芥植株新生葉片無明顯癥狀；而在接種第11 d，擬南芥植株的新生葉片出現(xiàn)輕微扭曲癥狀；第18 d，新生葉片出現(xiàn)輕微扭曲、老葉黃化等癥狀；對(duì)照組新生葉片無癥狀（圖4A）。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，接種SLCMV 18 d 后，染病擬南芥植株新生葉片可見DNA-A 和DNA-B 的特異性條帶，而對(duì)照組無任何條帶（圖4B），表明SLCMV 病毒已在擬南芥植株成功復(fù)制并產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。

圖4 SLCMV 侵染擬南芥癥狀（A）及分子檢測(cè)（B）Fig. 4 Symptoms (A) and molecular detection (B) of Arabidopsis plants infected by SLCMV

2.3 SLCMV 在本生煙和擬南芥中的病毒感染率

接種SLCMV 侵染性克隆后，本生煙植株前14 d 的病程與2.2 相似，而在15～30 d，表現(xiàn)出嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀，且癥狀進(jìn)一步加重。于第30 d 采集新生葉片對(duì)病毒DNA-A組分進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，染病本生煙植株新生葉片均可檢測(cè)到DNA-A 特異性條帶，pDNA-A 質(zhì)粒和pDNA-A/GV3101 菌液也檢測(cè)出目的條帶，而對(duì)照組無任何條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，SLCMV 侵染性克隆在本生煙中的病毒感染率為96.67%（圖5）。

圖5 本生煙和擬南芥接種SLCMV 侵染性克隆后的病毒感染率Fig. 5 Viral infection rate of tobacco and Arabidopsis plants inoculated with SLCMV infectious clone

接種SLCMV 侵染性克隆后，擬南芥植株前18 d 的病程與2.2 相似；在第19～30 d，其癥狀未有明顯變化，部分新生葉片仍出現(xiàn)輕微扭曲、老葉出現(xiàn)黃化等癥狀。于第30 d 采集新生葉片對(duì)病毒DNA-A 組分進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅從部分?jǐn)M南芥植株新生葉片中檢測(cè)到DNA-A 特異性條帶，而其他擬南芥植株新生葉片未檢測(cè)到特異條帶；pDNA-A 質(zhì)粒和pDNA-A/GV3101 菌液也檢測(cè)出目的條帶，對(duì)照組無任何條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，SLCMV 侵染性克隆在擬南芥中的病毒感染率為40 %（圖5）。因此，SLCMV 侵染性克隆通過農(nóng)桿菌接種本生煙的病毒感染率達(dá)到96.67%，遠(yuǎn)高于在擬南芥植株中的病毒感染率，差異顯著（P＜ 0.05）。

3 討論

病毒侵染性克隆是病毒反向遺傳學(xué)操作的重要研究手段，也是病毒基因功能研究的基礎(chǔ)工具。通過植物雙向表達(dá)載體可將有侵染活性的病毒全長(zhǎng)cDNA 在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，或體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 產(chǎn)物從而成功侵染宿主植物，兩者都能產(chǎn)生病毒粒子。以此獲得的病毒侵染性克隆，可用于病毒基因組的突變、缺失、插入、置換等研究，從而在寄主植物水平開展和鑒定病毒功能基因。植物DNA 病毒的侵染性克隆是1983 年在番茄金色花葉病毒（Tomato golden mosaic virus,TGMV）上首先構(gòu)建成功的［14］，隨后其發(fā)展極為迅速，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和農(nóng)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。大量研究表明，植物環(huán)狀DNA 病毒的侵染性克隆構(gòu)建需要大于一個(gè)病毒基因組的全長(zhǎng)序列，一般為1.3～1.9 倍（mer）于病毒基因組［15-16］。本研究構(gòu)建的SLCMV 病毒侵染性克隆，其pDNA-A和pDNA-B 上的病毒序列分別為病毒原基因組DNA-A 和DNA-B 的1.1 倍（mer）和1.08 倍（mer），其重復(fù)序列主要來自非編碼區(qū)，不含有編碼區(qū)序列。因此，該SLCMV 病毒侵染性克隆在研究病毒功能基因的突變、缺失、插入、置換等DNA 重組技術(shù)帶來更簡(jiǎn)便、更高效的研究方法。

本研究的SLCMV 病毒侵染性克隆（TVM3株系）通過農(nóng)桿菌接種本生煙和擬南芥，其病毒接種率存在一定的差異。如通過葉下表皮注射本生煙葉片，其96.67%的本生煙植株均能感染SLCMV 病毒，而擬南芥植株的感染率僅為40%，兩者差異顯著（P＜0.05）。其可能原因一是接種方法不同，擬南芥由于葉片偏小，主要采用的浸泡植物組織的方法，在效率上比直接注射體內(nèi)會(huì)低一些。另一個(gè)原因是宿主植物差異，已有研究表明，菜豆金色黃花葉病毒屬病毒更容易感染本生煙且表現(xiàn)出明顯的癥狀，而在擬南芥中對(duì)SLCMV 敏感性低，在植物中表現(xiàn)的癥狀也較輕［17-18］，因此在進(jìn)化上，病毒在侵染宿主方面會(huì)更好的選擇本生煙植株。

王國(guó)芬等［19］構(gòu)建了SLCMV 兩個(gè)中國(guó)分離物的侵染性克隆，SLCMV-Col 和SLCMV-DG1922。強(qiáng)致病分離物SLCMV-Col 侵染性克隆接種普通煙，在第27 d 可引起普通煙葉片向下卷曲，葉背出現(xiàn)耳突，扭曲變形和植株矮化。而弱致病分離物SLCMV-DG1922 侵染性克隆接種普通煙，在第27 d 普通煙癥狀不典型，植株新抽葉片無明顯癥狀，植株生長(zhǎng)正常。早在2008 年，SLCMVKer20 侵染性克隆被構(gòu)建成功，其感染的普通煙癥狀也不典型，植株新抽葉片無明顯癥狀，表明SLCMV-Ker20 也可能是弱毒株系［17］。而本研究所使用的SLCMV-TVM3 分離物感染本生煙后，在第14 d 新生葉片出現(xiàn)嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀，表明該分離物為強(qiáng)致病株系。

綜上所述，本文構(gòu)建的SLCMV 病毒侵染性克隆為下一步探究國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病的遺傳背景，病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能，以及寄主與病毒之間的相互作用提供重要前期基礎(chǔ)，還可以利用該病毒侵染性克隆進(jìn)行外源蛋白表達(dá)、基因沉默誘導(dǎo)等研究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了斯里蘭卡木薯花葉病毒TVM3 株系（SLCMV-TVM3）侵染性克隆并能侵染本生煙和擬南芥等模式植物。該侵染性克隆pDNA-A 和pDNA-B 上的病毒序列分別為病毒原基因組DNA-A 和DNA-B 大小的1.10 倍（mer）和1.08 倍（mer）且不含有重復(fù)的編碼區(qū)序列，可為下一步國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病的遺傳背景探究和病毒致病機(jī)理研究提供重要前期基礎(chǔ)。癥狀跟蹤觀察和分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLCMV 可在本生煙新生葉片上大量增殖，且引起典型的扭曲、卷葉和明顯的褪綠等雙生病毒典型癥狀，而在擬南芥新生葉片僅表型出輕微癥狀。此外，SLCMV 在本生煙中的病毒感染率達(dá)96.67%，而在擬南芥植株中僅為40%，兩者差異顯著，因此，本生煙更適用于雙生病毒的致病機(jī)理研究。