蘇一鳴,王英剛,藺 昕,李曉軍

(1.沈陽(yáng)大學(xué)環(huán)境學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110044;2.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所,遼寧 沈陽(yáng) 110016)

恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)是一種人工合成的動(dòng)物專(zhuān)用喹諾酮類(lèi)抗生素,具有抗菌譜廣、活性強(qiáng)等特點(diǎn),常用于畜禽感染性疾病的預(yù)防和治療。進(jìn)入畜禽體內(nèi)的抗生素不會(huì)被全部吸收,約有30%～90%會(huì)隨著尿液或糞便排出至環(huán)境中[1]。ENR是一種兩性分子(pKa1=5.88～6.06,pKa2=7.70～7.74)[2],正常環(huán)境下亨利定律常數(shù)極低,揮發(fā)損失可忽略不計(jì),但其辛醇-水分配系數(shù)(Kow)較低,易在土壤中積累和遷移,檢出率高,威脅生態(tài)系統(tǒng)安全[3]。研究發(fā)現(xiàn),在我國(guó)畜禽糞便中最常檢出的抗生素為喹諾酮類(lèi),其中豬糞中ENR平均檢出含量達(dá)4.68 mg·kg-1[4]。我國(guó)農(nóng)田土壤中ENR的檢出率高,殘留含量范圍為0～1 347.6 μg·kg-1,均值介于0～99.4 μg·kg-1之間[5],最大值接近澳大利亞農(nóng)田土壤標(biāo)準(zhǔn)值(370 μg·kg-1)的4倍[6]。長(zhǎng)三角典型城郊地區(qū)農(nóng)田、林地和園地的ENR檢出率高達(dá)70%以上,農(nóng)田的檢出率達(dá)100%[7]。邰義萍等[8]調(diào)查了東莞市18個(gè)區(qū)鎮(zhèn)24個(gè)代表性蔬菜基地土壤中喹諾酮類(lèi)抗生素的含量,結(jié)果表明4種喹諾酮類(lèi)抗生素的檢出率均在90%以上,以恩諾沙星(平均含量19.85 μg·kg-1)為主,部分含量超過(guò)了抗生素生態(tài)毒害效應(yīng)觸發(fā)值(100 μg·kg-1)。邰義萍等[9]研究珠江三角洲地區(qū)長(zhǎng)期施用糞肥的無(wú)公害蔬菜生產(chǎn)基地發(fā)現(xiàn),土壤中喹諾酮類(lèi)抗生素平均含量為17.99 μg·kg-1,恩諾沙星的檢出率為100%,平均含量為3.52 μg·kg-1。

我國(guó)北方地區(qū)秋冬季氣溫低,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),較大限制了中高溫菌的應(yīng)用,因此增強(qiáng)低溫降解菌的研究對(duì)于低溫地區(qū)的土壤抗生素污染治理具有重要意義。邢慧珍[15]研究發(fā)現(xiàn),菌株SDF-25的最適生長(zhǎng)溫度為10～16 ℃,10 ℃培養(yǎng)15 d后秸稈降解率為39.5%,16 ℃時(shí)達(dá)44.9%。郭平[16]篩選出6株低溫石油降解菌,均能在0 ℃降解石油烴,其中菌株Rhodococcussp.在0 ℃、原油初始質(zhì)量濃度為5 g·L-1、菌液接種量φ=10%條件下降解60 d后生物降解率可達(dá)52.6%±2.0%。畜禽糞便堆放地土壤通常具有較高的含鹽量和抗生素含量,因此篩選耐鹽的恩諾沙星降解菌十分必要,目前關(guān)于適應(yīng)北方低溫耐鹽環(huán)境的恩諾沙星降解菌還鮮見(jiàn)報(bào)道。

筆者以污染土壤中常見(jiàn)的喹諾酮類(lèi)抗生素—恩諾沙星為目標(biāo)污染物,利用低溫地區(qū)畜禽糞便堆放地土壤,篩選出恩諾沙星低溫高效降解菌,在明確降解菌的生長(zhǎng)和降解特征基礎(chǔ)上,研究低溫對(duì)菌株生長(zhǎng)和恩諾沙星降解能力的影響,為適用于北方低溫地區(qū)抗生素污染土壤生物修復(fù)技術(shù)的構(gòu)建提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試劑與培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基:1 L水、1 g (NH4)2SO4、1 g KHPO4、1 g K2HPO4、0.5 g NaCl、0.05 g FeC13·6H20、0.02 g CaC12·H2O、0～10 g葡萄糖,pH值為7.2～7.4。LB培養(yǎng)基:1 L水、10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl,pH值為7.2～7.4(固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂)。

恩諾沙星儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱(chēng)取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g,用V(乙腈)∶V(水)=1∶1超聲溶解并定容于100 mL容量瓶中,配制成ρ為100 mg·L-1的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液,在-20 ℃冰箱中避光保存,1個(gè)月內(nèi)使用[17]。實(shí)驗(yàn)中用到的各濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液(5～500 μg·L-1)均用甲醇(φ=1%甲酸)稀釋。

1.1.2低溫恩諾沙星降解菌的篩選

考慮到高緯度和高海拔地區(qū)的低溫特點(diǎn),采集遼寧省海城市和青海省西寧市某畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便堆放區(qū)土壤,應(yīng)用梯度馴化培養(yǎng)技術(shù),分離篩選出低溫高效恩諾沙星降解菌。

稱(chēng)取1.5 g冷鮮土樣置于裝有30 mL無(wú)機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基的錐形瓶中,按φ=5%接種量進(jìn)行梯度馴化培養(yǎng),將恩諾沙星儲(chǔ)備液稀釋至10 mg·L-1后,加入培養(yǎng)基各0.3、0.6、1.2、2.4 mL,使培養(yǎng)基中恩諾沙星濃度分別為100、200、400、800 μg·L-1,15 ℃、150 r·min-1避光振蕩,依次培養(yǎng)5 d。經(jīng)4次梯度培養(yǎng)后,選擇800 μg·L-1濃度下能夠耐受恩諾沙星的混合菌液轉(zhuǎn)接到含有800 μg·L-1恩諾沙星的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng),15 ℃避光條件下每隔5 d對(duì)生長(zhǎng)出來(lái)的微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)接,共轉(zhuǎn)接6次,使得培養(yǎng)基中菌株得以分離純化,最終獲得若干單一菌株。

將分離純化的單一菌株以5%接種量接種到恩諾沙星含量為500 μg·L-1的MSM培養(yǎng)基中進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn),15 ℃、150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)5 d,測(cè)定培養(yǎng)基中恩諾沙星的含量,最終篩選出4株恩諾沙星高效降解菌Z、H5、H35、Y用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

上述菌株經(jīng)上海生物工程有限公司鑒定,Z為普羅威登斯菌屬(Providenciasp.),H5為腸桿菌屬(Enterobactersp.),H35為普羅威登斯菌屬(Providenciasp.),Y為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)。

1.2 菌株生長(zhǎng)和降解特征

1.2.1菌株的生長(zhǎng)曲線

向50 mL LB液體培養(yǎng)基中加入4種菌懸液2.5 mL(不投加恩諾沙星),15 ℃、150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)6 d,分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、48、72、96、120、144 h[14]取樣測(cè)定菌液濃度OD600。

1.2.2pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

針對(duì)4種菌株,向20 mL LB液體培養(yǎng)基中加入菌懸液各1 mL,每株菌利用HCl或NaOH溶液再設(shè)置不同的pH值處理(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0),每種處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù),15 ℃、150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng),由菌株生長(zhǎng)曲線可知,培養(yǎng)72 h菌液OD600達(dá)到峰值,因此培養(yǎng)3 d后取樣測(cè)定4種菌株在不同pH值處理濃度菌液下的OD600。

1.2.3菌株對(duì)恩諾沙星的降解能力

考慮到北方秋冬季氣溫在10 ℃以下,因此測(cè)定8 ℃環(huán)境下菌株對(duì)恩諾沙星的降解能力。向50 mL液體LB培養(yǎng)基中加入恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25 mL,使恩諾沙星的濃度為500 μg·L-1,再加入4種菌懸液2.5 mL,8 ℃、150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)14 d,為排除細(xì)菌吸附作用對(duì)恩諾沙星濃度的影響,分別設(shè)置不接菌的培養(yǎng)基和滅活菌液的對(duì)照處理,分別在0、2、4、6、8、10、12、14 d取樣測(cè)定培養(yǎng)基中恩諾沙星的含量,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 低溫對(duì)菌株生長(zhǎng)及其對(duì)恩諾沙星降解能力的影響

1.3.1低溫對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

向20 mL液體LB培養(yǎng)基中加入4種菌懸液1 mL,在4、8、15 ℃溫度下,150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)15 d,分別在0、1、3、6、9、12、15 d取樣測(cè)定菌液濃度OD600,直到菌株死亡,每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.2低溫對(duì)菌株恩諾沙星降解能力的影響

鑒于實(shí)際水體中恩諾沙星的檢出量多在500 μg·L-1以下,因此選擇500 μg·L-1為恩諾沙星初始濃度。向20 mL液體LB培養(yǎng)基中加入恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL,使恩諾沙星的質(zhì)量濃度為500 μg·L-1,再加入4種菌懸液1 mL,分別在4、8、15 ℃溫度下150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng),不接菌的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。

由低溫對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響結(jié)果可知,4種菌液在培養(yǎng)14 d時(shí)菌液濃度OD600達(dá)到峰值,對(duì)恩諾沙星的降解效果最好,因此選在第14天取樣測(cè)定培養(yǎng)基中恩諾沙星的濃度,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 樣品檢測(cè)與分析

菌液濃度(OD600)測(cè)定:用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm處的吸光值(OD600)。OD600超過(guò)1,則稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定。

樣品前處理:實(shí)驗(yàn)樣品取樣測(cè)定時(shí),取1 mL搖勻的待測(cè)菌液,用0.22 μm孔徑無(wú)菌濾膜過(guò)濾至1.5 mL液相進(jìn)樣瓶中,避光保存于-20 ℃冰箱。

恩諾沙星濃度測(cè)定:利用超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Triple Quad 5500+ QTRAP Ready,美國(guó)AB SCIEX)進(jìn)行測(cè)定[18]。

色譜條件:采用Ailent Eclipse Plus C18(1.9 μm,150 mm×2.1 mm)色譜柱,柱溫40 ℃,柱平衡時(shí)間 30 min,流速0.4 mL·min-1,進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相為5 mmol·L-1乙酸銨溶液(含1%甲酸)-乙腈,梯度為0～0.5 min (98%A相,2%B相)、0.5～3.0 min(98%A相,2%B相)、3.0～5.0 min(2%A相,98%B相)、5.0～5.1 min(2%A相、98%B相)、5.1～8.0 min(98%A相、2%B相)。

質(zhì)譜條件:采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器、電噴霧離子源(ESI)、多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式。輔助氣體55 mL·min-1,噴霧電壓5 500 V,氣簾30 mL·min-1,蒸汽溫度550 ℃,恩諾沙星母離子m/Z為360.6,子離子m/Z為316.4/245.4,碰撞電壓20/27 V,錐孔電壓45 V。

在5～500 μg·L-1濃度范圍內(nèi)基準(zhǔn)曲線的R2>0.99,回收率測(cè)定采用實(shí)際樣品加標(biāo)的回收率,測(cè)得加標(biāo)回收率為92.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于1%,空白對(duì)照組中均未檢出恩諾沙星。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

恩諾沙星降解率(R)計(jì)算公式為

R=(C0-C)/C0×100%。

(1)

式(1)中,C為接菌處理的恩諾沙星濃度,μg·L-1;C0為不接菌對(duì)照處理的零時(shí)恩諾沙星濃度,μg·L-1。

運(yùn)用單因素方差分析(ANOVA)比較各數(shù)據(jù)間的差異性,所有統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 26.0中完成,運(yùn)用Origin 8.5進(jìn)行圖表繪制,圖表中數(shù)據(jù)為平均值+標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的特征

2.1.1菌株的生長(zhǎng)特征

圖1表明了4種菌株在15oC條件下培養(yǎng)的生長(zhǎng)過(guò)程差異。4種菌株的生長(zhǎng)過(guò)程均經(jīng)歷先上升后達(dá)到穩(wěn)定的過(guò)程,同一菌株不同培養(yǎng)時(shí)間OD600具有顯著性差異(P<0.05)。不同菌株達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間存在差異,H35和H5菌生長(zhǎng)極為迅速,8 h接近穩(wěn)定期,OD600分別達(dá)到峰值1.799和1.909,隨后略有下降,但兩者間無(wú)顯著性差異(P>0.05);Z菌初期生長(zhǎng)速率顯著低于H35和H5(P<0.05),22～48 h接近穩(wěn)定期,OD600達(dá)到峰值1.82;Y菌培養(yǎng)初期生長(zhǎng)速率極為緩慢,OD600顯著低于其他3株菌(P<0.05),48～72 h接近穩(wěn)定期,OD600達(dá)到峰值2.483,顯著高于其他3株菌(P<0.05),隨后略有下降。

圖1 4種菌株的生長(zhǎng)曲線

2.1.2培養(yǎng)基pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

圖2表明了pH值對(duì)4種菌株生長(zhǎng)的影響。在pH =5.0～9.0范圍內(nèi),H35、H5的生長(zhǎng)不受pH值的影響,OD600值在不同pH值間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。H5的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于H35,其OD600值顯著高于H35。Z更適于中性偏堿性環(huán)境,其OD600值在pH>6的處理之間無(wú)顯著差異,在酸性環(huán)境中的OD600值顯著低于堿性環(huán)境,且pH值越低,其OD600值越低。Y更適于中性環(huán)境,其在pH =7.0時(shí)生長(zhǎng)良好,OD600達(dá)到2.013,酸性和堿性環(huán)境中的OD600值顯著小于pH=7時(shí)的OD600值,且堿性越強(qiáng),受抑制程度越強(qiáng)。

直方柱上方英文大寫(xiě)字母不同表示同一菌株不同pH值間OD600差異顯著(P<0.05);英文小寫(xiě)字母不同表示同一pH值不同菌株間OD600差異顯著(P<0.05)。

2.2 菌株對(duì)恩諾沙星的降解

圖3表明了8 ℃條件下滅活菌株的對(duì)照組對(duì)恩諾沙星的吸附能力,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,滅活后的H5和Y對(duì)恩諾沙星的吸附率具有顯著差異(P<0.05),Z和H35對(duì)恩諾沙星的吸附率則無(wú)顯著變化,其中H35在培養(yǎng)2 d達(dá)到峰值2.81%?？梢钥闯?14 d培養(yǎng)過(guò)程中4種菌株對(duì)恩諾沙星的吸附作用并不明顯。

直方柱上方英文大寫(xiě)字母不同表示同一菌株不同降解時(shí)間吸附率差異顯著(P<0.05);英文小寫(xiě)字母不同表示同一降解時(shí)間不同菌株間吸附率差異顯著(P<0.05)。

4種菌株對(duì)恩諾沙星具有較好的降解能力,對(duì)恩諾沙星的降解率隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。圖4表明了8 ℃條件下4種菌株對(duì)恩諾沙星的降解過(guò)程。在14 d培養(yǎng)過(guò)程中,不接菌對(duì)照處理中恩諾沙星含量有所下降,14 d自降率為22.8%。Z、H5、Y對(duì)恩諾沙星的降解率在12 d達(dá)到最高,分別為49.6%、47.9%和48.1%;H35對(duì)恩諾沙星的降解率則在14 d達(dá)到最高,為56.5%,顯著高于其他3株菌(P<0.05)?？梢钥闯?在整個(gè)降解過(guò)程中Z和H35對(duì)恩諾沙星具有更好的降解能力,其中Z在培養(yǎng)的前期降解能力更強(qiáng),而H35在培養(yǎng)的后期降解能力不斷提升。

直方柱上方英文大寫(xiě)字母不同表示同一菌株不同降解時(shí)間降解率差異顯著(P<0.05);英文小寫(xiě)字母不同表示同一降解時(shí)間不同菌株間降解率差異顯著(P<0.05)。

2.3 低溫對(duì)菌株生長(zhǎng)及恩諾沙星降解的影響

2.3.1不同低溫條件下菌株的生長(zhǎng)情況

與圖2的生長(zhǎng)曲線對(duì)比可知,恩諾沙星抑制了菌株的生長(zhǎng)。4株菌在4～15 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),但低溫會(huì)在生長(zhǎng)前期顯著抑制微生物生長(zhǎng)。溫度越低,菌株前期生長(zhǎng)越緩慢。15 ℃條件下4株菌生長(zhǎng)迅速,0～9 d的菌密度顯著高于8和4 ℃。9 d 以后4株菌不同溫度之間的生長(zhǎng)狀況趨于一致(圖5)。

圖5 低溫對(duì)4種菌株生長(zhǎng)的影響

不同菌株對(duì)低溫的響應(yīng)特征不同。Y和Z生長(zhǎng)特征趨于一致,4和8 ℃條件下生長(zhǎng)速度均顯著低于15 ℃。12 d時(shí)3個(gè)溫度條件下的菌密度趨于一致。H35和H5不同溫度下的生長(zhǎng)規(guī)律相似,但3個(gè)溫度下H35的OD600均在9 d達(dá)到最大值,隨后持續(xù)下降,且3個(gè)溫度下的OD600依然存在顯著差異(15 ℃>8 ℃>4 ℃);而H5的OD600值在15、8和4 ℃達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)分別為9、12和14 d,12 d后15和8 ℃的OD600值無(wú)顯著差異。

2.3.2不同低溫條件下恩諾沙星的降解情況

圖6表明不同低溫條件培養(yǎng)14 d后菌株對(duì)恩諾沙星的降解情況(不包含自然降解率)。4、8、15 ℃條件下無(wú)菌對(duì)照組恩諾沙星的自然降解率分別為10.9%、22.8%、40.6%,說(shuō)明低溫抑制了恩諾沙星的非生物降解,同時(shí)低溫顯著抑制了菌株對(duì)恩諾沙星的降解效果,溫度越低降解效果越差。但即使在低溫情況下,菌株對(duì)恩諾沙星依然有降解效果。4 ℃條件下,Z、H5、H35和Y對(duì)恩諾沙星的降解率在14 d達(dá)到峰值,分別為33.4%、42.1%、38.1%和34.3%。

直方柱上方英文大寫(xiě)字母不同表示同一菌株不同溫度條件降解率差異顯著(P<0.05);英文小寫(xiě)字母不同表示同一溫度條件不同菌株間降解率差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 菌株的特征

要實(shí)現(xiàn)污染物的微生物降解,微生物必須具備2個(gè)條件:能夠接觸到污染物和能夠降解污染物。而要實(shí)現(xiàn)持續(xù)高效降解,則需要微生物降解目標(biāo)污染物的效率高并保持足夠的量。研究結(jié)果表明,15 ℃條件下H35、H5生長(zhǎng)極為迅速,8 h接近穩(wěn)定期,OD600達(dá)到峰值,隨后略有下降。向培養(yǎng)基投加500 μg·L-1恩諾沙星后明顯抑制了菌株的生長(zhǎng)。H35菌培養(yǎng)9 d后OD600達(dá)到峰值2.84,顯著高于其他3株菌。

要實(shí)現(xiàn)高效降解微生物的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用,構(gòu)建合適的復(fù)合菌劑是低溫條件下提高降解效率的有效途徑[19]。研究發(fā)現(xiàn),H35、H5菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似,存在拮抗關(guān)系;但兩者與Z和Y菌的生長(zhǎng)速率具有差異性,且均能在低溫下生長(zhǎng),對(duì)恩諾沙星耐性良好。韓婉雪等[20]研究發(fā)現(xiàn),畜禽糞便堆放地土壤屬于中性或偏堿環(huán)境。該研究的目的是篩選出適于該環(huán)境的降解菌,同時(shí)明確篩出菌對(duì)pH值的適應(yīng)區(qū)間。結(jié)果表明,在pH =5.0～9.0時(shí),H35、H5的生長(zhǎng)不受pH值的影響,Z更適于中性偏堿性環(huán)境,Y更適于中性環(huán)境,說(shuō)明4種低溫菌株在畜禽污染場(chǎng)地具有應(yīng)用潛力。因此,可以考慮將H35、Z、Y菌組合成復(fù)合菌系,以達(dá)到對(duì)恩諾沙星更好的降解效果。

過(guò)去關(guān)于微生物降解恩諾沙星的研究多適用于常溫條件。梅瀚杰等[21]研究發(fā)現(xiàn),菌株BSFL-3在33.6 ℃、初始pH =5.8、接種量4%、155 r·min-1條件下可使恩諾沙星的降解率達(dá)到77.83%±0.53%。潘蘭佳等[22]利用嗜熱菌Thermussp.C419在高溫(70 ℃)條件下降解2種典型的喹諾酮類(lèi)抗生素(諾氟沙星和恩諾沙星),降解率為60%～80%。谷雪維[23]研究發(fā)現(xiàn),周叢生物膜對(duì)于恩諾沙星具有良好去除效果,去除率均在90%以上。王振方等[24]以綠藻門(mén)的膠網(wǎng)藻(Dictyosphaeriumsp.)為對(duì)象,通過(guò)12 d室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)膠網(wǎng)藻對(duì)于恩諾沙星的去除具有顯著促進(jìn)作用。可以看出,目前針對(duì)低溫條件下的恩諾沙星降解菌還不多見(jiàn)。在該研究中,篩選出的4株菌在8 ℃時(shí)對(duì)恩諾沙星均有較好的降解能力。對(duì)恩諾沙星的降解率隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),Z、H5、Y對(duì)恩諾沙星的降解率在12 d時(shí)達(dá)到最高,分別為26.8%、15.1%、25.3%;H35對(duì)恩諾沙星的降解率則在14 d時(shí)達(dá)到最高,為33.7%。4 ℃條件下,Z、H5、H35和Y對(duì)恩諾沙星的降解率在14 d時(shí)達(dá)到峰值,分別為22.5%、31.2%、27.2%和23.4%。

3.2 低溫對(duì)菌株生長(zhǎng)及恩諾沙星降解的影響

溫度是影響菌株生長(zhǎng)和菌株發(fā)揮降解作用的重要因素,尤其在高緯度地區(qū)溫度嚴(yán)重影響著微生物的降解速率。目前在微生物修復(fù)中高溫菌占主體,而在我國(guó)北方地區(qū)寒冷而漫長(zhǎng)的冬季,低溫會(huì)強(qiáng)烈抑制中高溫菌對(duì)污染物的降解效率。低溫顯著抑制了菌株對(duì)恩諾沙星的降解效果,溫度越低降解效果越差,但即使在4 ℃條件下,與不接菌對(duì)照相比,菌株對(duì)恩諾沙星依然有降解效果。許多學(xué)者也從其他低溫環(huán)境中分離出低溫降解菌,馬文成等[25]從冬季活性污泥中篩選得到具有高生物活性的耐冷細(xì)菌,張?chǎng)蔚萚26]篩選得到的復(fù)合菌系M44在15 ℃條件下能夠高效降解玉米秸稈。ERIKSSON等[27]從2個(gè)北極土樣和2個(gè)高緯度北方土樣中分離出對(duì)有機(jī)物具有高效降解率的優(yōu)勢(shì)菌株。以上結(jié)果表明,增強(qiáng)低溫降解菌的研究對(duì)于我國(guó)低溫地區(qū)的土壤污染治理具有重要意義。

4 結(jié)論

微生物降解可以有效降低抗生素生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。低溫微生物對(duì)恩諾沙星具有降解作用,即使在4 ℃條件下,4株菌對(duì)恩諾沙星的降解率依然達(dá)到20%以上,但總體隨著溫度降低降解效果削弱。其中Z菌株和H35菌株在低溫條件下(4～15 ℃)對(duì)恩諾沙星具有更好的降解能力,Z在培養(yǎng)前期降解能力更強(qiáng),而H35在培養(yǎng)后期降解能力不斷提升,這為我國(guó)北方和高緯度地區(qū)抗生素污染土壤修復(fù)提供了一定的技術(shù)支撐。