劉慧慧, 李恩杰, 曹亮明, 包青春, 王小林, 辛學(xué)兵, 楊忠岐,*

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心, 北京九龍山暖溫帶森林國(guó)家長(zhǎng)期科研基地, 北京102300;2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所, 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100091;3. 內(nèi)蒙古科爾沁右翼中旗五角楓自然保護(hù)區(qū)管理局, 興安盟 137400)

廣肩小蜂科(Eurytomidae)在全世界廣泛分布,目前分為3個(gè)亞科:海廣肩小蜂亞科(Hemibrinae)、腫腿廣肩小蜂亞科(Rileyinae)和廣肩小蜂亞科(Eurytominae)(Gauld and Bolton, 1988; 楊忠岐, 1992)。該科全世界記載了87屬1 500多種(Gatesetal., 2006; Gates, 2007; Lotfalizadehetal., 2007; Noyes, 2023),其中絕大部分屬于廣肩小蜂亞科。廣肩小蜂科大部分種類為寄生性,少數(shù)為植食性。廣肩小蜂屬Eurytoma是該科中最大的一個(gè)屬,其大多數(shù)種類寄生于其他昆蟲(絕大多數(shù)為害蟲)體上,寄主類群包括鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、膜翅目(Hymenoptera)等昆蟲。癭廣肩小蜂屬Sycophila是該科中的另外一個(gè)屬,主要寄生于膜翅目癭蜂科(Cynipidae)昆蟲。截至目前,全世界已知廣肩小蜂屬702種和癭廣肩小蜂屬119種(Gauld and Bolton, 1988; Gates, 2007; Noyes, 2023)。由于廣肩小蜂屬具有重要的生物防治價(jià)值,應(yīng)對(duì)其進(jìn)行深入研究,以發(fā)掘該天敵類群的生物防治價(jià)值和利用于生物防治。

元寶楓Acertruncatum屬于槭樹科(Aceraceae)槭樹屬Acer多年生落葉亞喬木,作為我國(guó)特有的珍貴木本油料樹種,不僅是我國(guó)園林綠化重要樹種,也被廣泛用于荒山造林和治理荒漠化。元寶楓材質(zhì)優(yōu)良,在我國(guó)分布廣,適應(yīng)性強(qiáng),其種子和葉片等產(chǎn)生的多種產(chǎn)品已經(jīng)廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。更有價(jià)值的是,元寶楓籽油中含有豐富的神經(jīng)酸(順-15-二十四碳單烯酸),在治療和預(yù)防人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病上具有良好的藥用和保健作用,我國(guó)目前正在開展利用元寶楓籽油研制治療帕金森癥、老年癡呆癥等神經(jīng)性疾病的藥物(王性炎, 2013)。然而,我國(guó)最大的元寶楓采種基地——內(nèi)蒙古科爾沁沙漠4 000 hm2的天然元寶楓林,近年來遭受一種象甲的嚴(yán)重危害,經(jīng)我們調(diào)查,明確其為象甲科的元寶楓籽象Bradybatussp.。這種害蟲在元寶楓翅果中蛀食元寶楓種仁。2021年經(jīng)我們調(diào)查顯示,內(nèi)蒙古興安盟代欽塔拉保護(hù)區(qū)85%以上元寶楓種仁被其蛀食一空,導(dǎo)致元寶楓種子幾乎絕收。為了利用天敵對(duì)這種隱秘性生活的重大害蟲進(jìn)行無公害防治,我們同時(shí)也對(duì)元寶楓籽象天敵區(qū)系進(jìn)行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)1種寄生其幼蟲、蛹甚至剛羽化的成蟲的小蜂。經(jīng)過我們分類研究,確定該物種為廣肩小蜂科(Eurytomidae)廣肩小蜂亞屬Eurytoma的一個(gè)新種——元寶楓刺脛廣肩小蜂EurytomaacutibialisYang, LiuetCao。該種對(duì)元寶楓籽象寄生率高達(dá)45%,在自然控制該害蟲上發(fā)揮著重要作用。鑒于元寶楓刺脛廣肩小蜂是元寶楓重大種實(shí)害蟲元寶楓籽象的優(yōu)勢(shì)寄生蜂,為了進(jìn)一步明確該小蜂的分類地位和其與相近種的親緣關(guān)系,我們測(cè)定和分析了該小蜂的線粒體全基因組序列,為膜翅目小蜂總科廣肩小蜂科昆蟲系統(tǒng)分類和發(fā)育關(guān)系等研究提供分子生物學(xué)證據(jù)。

昆蟲線粒體基因組具有母系遺傳、長(zhǎng)度短、排列較為保守和進(jìn)化速率快等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于膜翅目昆蟲的物種界定、進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育等研究中(Dowtonetal., 2009; Cameron, 2014; Maoetal., 2015; Tangetal., 2019)。隨著測(cè)序技術(shù)的成熟和分子生物學(xué)的快速發(fā)展,越來越多的膜翅目昆蟲物種的線粒體全基因組被測(cè)序。然而,Chen等(2004)利用線粒體16S rRNA基因和cox1對(duì)廣肩小蜂科進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析時(shí)發(fā)現(xiàn),無法很好地支持各亞屬的單系性。目前NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)僅收錄了廣肩小蜂科3種昆蟲的線粒體基因組信息,分別是廣肩小蜂(Eurytomasp. ZJUH 2013和Eurytomasp. TJS-2016)和癭廣肩小蜂(Sycophilasp. 2 JXW 2020),廣肩小蜂科昆蟲線粒體基因組的數(shù)據(jù)還非常有限。本研究通過測(cè)定元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組,對(duì)其線粒體基因組結(jié)構(gòu)、基因排列順序、核苷酸組成、氨基酸組成、密碼子使用、tRNA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)、基因組重排現(xiàn)象等進(jìn)行分析;此外,利用40種膜翅目寄生蜂線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(protein-coding genes, PCGs)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,以探究元寶楓刺脛廣肩小蜂所在屬的高級(jí)階元的分類地位。這些研究在建立廣肩小蜂科的自然分類系統(tǒng)方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 昆蟲收集

2021年10月,在內(nèi)蒙古興安盟代欽塔拉五角楓自然保護(hù)區(qū)(45°18′N, 121°02′E)采集元寶楓翅果約1 500粒,將這些翅果置于養(yǎng)蟲籠中,放置于室外越冬(模擬自然界越冬情況)。2022年3月將翅果轉(zhuǎn)移到室內(nèi),在溫度(25±1) ℃、相對(duì)濕度40%～50%、光周期 14L∶10D的人工氣候箱中培養(yǎng),每天檢查、收集羽化出的寄生蜂,在實(shí)體顯微鏡下鑒定這些寄生蜂種類和區(qū)分性別,并統(tǒng)計(jì)數(shù)量等,將收集元寶楓刺脛廣肩小蜂成蟲利用液氮速凍,隨后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 線粒體基因組Illumina HiSeqTM4000高通量測(cè)序和組裝

挑選30頭元寶楓刺脛廣肩小蜂,使用DNeasy組織試劑盒(Qiagen,Hilden,德國(guó))提取全基因組DNA。使用1 μg DNA,利用TruSeq DNA文庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建DNA文庫(kù)。在上海派森諾生物科技股份有限公司利用Illumina HiSeqTM4000(Illumina, 美國(guó))平臺(tái)對(duì)元寶楓刺脛廣肩小蜂樣品進(jìn)行雙末端(paired-end, PE)測(cè)序,共獲得3.35 Gb的原始數(shù)據(jù),Q30為92.89%。利用SPAdes v3.10.1(http:∥bioinf.spbau.ru/spades)(Bankevichetal., 2012)和A5-miseq v2015052229(Coiletal., 2015)對(duì)原始數(shù)據(jù)的讀段進(jìn)行拼裝,得到contig和scaffold序列。根據(jù)拼接序列的測(cè)序深度提取序列,將高測(cè)序深度的序列同NCBI上的nt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastn (https:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)比對(duì),篩選出各拼接結(jié)果的線粒體序列。利用mummer v3.1(Kurtzetal., 2004)軟件進(jìn)行共線性分析,確定contig之間的位置關(guān)系,并填補(bǔ)contigs之間的gap。最后,使用pilon v1.18(Walkeretal., 2014)軟件進(jìn)行校正,得到最終的線粒體序列。

1.3 線粒體基因組序列注釋與特征分析

利用MITOS(http:∥mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py)對(duì)元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組進(jìn)行注釋和tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。注釋結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列進(jìn)行比較得到確認(rèn),然后將結(jié)果提交至NCBI。采用CGview軟件繪制線粒體基因組圈圖。使用MEGA-X(Kumaretal., 2018)計(jì)算基因的核苷酸組成,包括A+T含量、AT偏斜、GC偏斜,AT偏斜=(A-T)/(A+T),GC偏斜=(G-C)/(G+C)。并使用Phylosuite v1.2.2(Zhang Detal., 2020)分析PCGs相對(duì)同義密碼子使用率(relative synonymous codon usage, RSCU)以及PCGs密碼子第1, 2和3位的G+C含量。以祖先昆蟲亞庫(kù)巴果蠅Drosophilayakuba線粒體基因組的排列方式為模式(Clary and Wolstenholme, 1985)對(duì)40種膜翅目昆蟲線粒體基因組基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

以細(xì)蜂總科(Proctotrupoidae)的長(zhǎng)腹細(xì)蜂Pelecinuspolyturator和離顎細(xì)蜂Vanhorniaeucnemidarum及姬蜂總科(Ichneumonoidea)的前裂長(zhǎng)管繭蜂Diachasmimorphalongicaudata線粒體基因組為外群,基于40種膜翅目昆蟲的13個(gè)PCGs核苷酸序列,使用貝葉斯法(Bayesian inference, BI)和最大似然法(maximum likelihood, ML)兩種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所有線粒體基因組序列從NCBI獲得。使用 Phylosuite軟件提取小蜂全序列中的13個(gè)PCGs的核苷酸序列,利用MAFFT 7.149(Katoh and Standley, 2013)和MACSE v. 2.03(Ranwezetal., 2018)對(duì)13個(gè)PCGs進(jìn)行密碼子比對(duì)和優(yōu)化,最后利用Gblocks v0.91b(Castresana, 2000)對(duì)序列進(jìn)行串聯(lián)處理。利用ModelFinder(Kalyaanamoorthyetal., 2017)進(jìn)行模型分析,然后利用XSEDE (https:∥www.phylo.org/)貝葉斯法和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,采用Bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)系統(tǒng)樹各分支節(jié)點(diǎn)的置信值。利用ITOL(https:∥itol.embl.de/personal_page.cgi)和adobe illustrator對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化。

2 結(jié)果

2.1 元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組全序列

元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體全基因組長(zhǎng)15 849 bp (GenBank登錄號(hào): OQ473654),A+T含量82.00%,包括43.60% T,38.40% A,11.00% G和6.90% C,AT偏斜為-0.063,GC偏斜為0.230;線粒體基因組由37個(gè)典型基因組成,包括2個(gè)rRNA基因[rrnS(12S rRNA)和rrnL(16S rRNA)]、13個(gè)PCGs、22個(gè)tRNA基因和1個(gè)非編碼控制區(qū)(control region, CR)(圖1)。其中重鏈(J)的基因27個(gè),分別是2個(gè)rRNA基因、11個(gè)PCGs(nad1,nad2,nad3,nad4,nad4L,nad5,cox1,cox2,cox3,atp6和atp8)、14個(gè)tRNA基因(trnI,trnV,trnA,trnL1,trnP,trnM,trnH,trnF,trnL2,trnD,trnG,trnC,trnR和trnW)和1個(gè)控制區(qū)。由輕鏈(N)編碼的基因共10個(gè),包括2個(gè)PCGs(cytb和nad6)和8個(gè)tRNA基因(表1)。

表1 元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組特征Table 1 Characteristics of the mitochondrial genome of Eurytoma acutibialis

圖1 元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Mitochondrial genomic structure of Eurytoma acutibialis

元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體所有PCGs均以ATN為起始密碼子,其中6個(gè)PCGs (nad2,nad3,nad4L,nad5,cox1和atp8)的起始密碼子為ATT,4個(gè)PCGs(cox3,nad4,atp6和cytb)的起始密碼子為ATG,3個(gè)PCGs (nad1,nad6和cox2)的起始密碼子為ATA。所有PCGs均以傳統(tǒng)的TAA/TAG為終止密碼子(表1)。

線粒體基因組整個(gè)編碼區(qū)相鄰基因之間存在基因間隔或基因重疊現(xiàn)象。其中基因間隔區(qū)有23處,總長(zhǎng)度為 547 bp (基因間隔范圍:1～152 bp),其中nad4和trnH之間間隔最長(zhǎng)為152 bp,其次是trnP和nad6之間,基因間隔為69 bp;基因重疊有9處,總長(zhǎng)度為100 bp (基因重疊范圍:1～34 bp),最長(zhǎng)一處位于trnT和trnM之間,重疊序列為34 bp; 此外,還有5個(gè)區(qū)域既無重疊又無間隔(表1)。

2.2 4種廣肩小蜂PCGs

元寶楓刺脛廣肩小蜂的13個(gè)PCGs全長(zhǎng)為11 133 bp,占整個(gè)線粒體基因組序列全長(zhǎng)的70.20%,13個(gè)PCGs的長(zhǎng)度范圍為162 (atp8)～1 701 bp (nad5)。A+T含量為80.90%,包括44.60% T, 36.30% A, 9.65% G和9.40% C,AT偏斜為-0.103,GC偏斜為0.010。在密碼子第1位,G+C含量為22.90%,AT偏斜為0.044,GC偏斜為0.188;在密碼子第2位,G+C含量為26.15%,AT偏斜為-0.351,GC偏斜為-0.118;在密碼子第3位,G+C含量為8.05%,AT偏斜為-0.029,GC偏斜為-0.001(表2)。其他3種廣肩小蜂也表現(xiàn)出明顯的AT偏好性,例如,廣肩小蜂Eurytomasp. ZJUH 2016013的13個(gè)PCGs全長(zhǎng)為11 169 bp,A+T含量為81.40%,AT偏斜為-0.104,GC偏斜為-0.013(其線粒體基因組全長(zhǎng)17 267 bp,A+T含量為84.40%,AT偏斜為0.074,GC偏斜為-0.239)。癭廣肩小蜂Sycophilasp. 2 JXW 2020的13個(gè)PCGs全長(zhǎng)為11 115 bp,A+T含量為80.00%,AT偏斜為-0.136,GC偏斜為0.014(其線粒體基因組全長(zhǎng)14 665 bp,A+T含量為81.40%,AT偏斜為-0.160,GC偏斜為0.235)。廣肩小蜂Eurytomasp. TJS-2016的13個(gè)PCGs全長(zhǎng)11 232 bp,A+T含量為80.80%,AT偏斜為-0.118,GC偏斜為-0.017(其線粒體基因組全長(zhǎng)14 946 bp,A+T含量為82.60%,AT偏斜為0.083,GC偏斜為-0.154)。

表2 元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組核苷酸組成Table 2 Nucleotide composition of the mitochondrial genome of Eurytoma acutibialis

4種廣肩小蜂13個(gè)PCGs的氨基酸使用率(圖2)的結(jié)果顯示,元寶楓刺脛廣肩小蜂E.acutibialis使用占比由高到低氨基酸排序依次為L(zhǎng)eu(15.57%),Ile(11.17%),Met(9.84%),Phe(9.35%)和Asn(6.92%)(總數(shù)>200),對(duì)應(yīng)的密碼子使用次數(shù)由高到低依次為UUA(492), AUU(402), UUU(336), AUA(325)和AAU(242);而Arg(1.30%), Cys(0.92%)和Gln(1.32%)的使用相對(duì)較少(總數(shù)<50)。除Phe使用率高于Met外,其他3種廣肩小蜂結(jié)果與元寶楓刺脛廣肩小蜂一致(圖2)。結(jié)果顯示,UUA的使用頻率最高,RSCU值為5.12, ACG, AGC, GUC, CUG和CUC的相對(duì)密碼子使用頻率最低,其中RSCU值均為0.02。

其他3種光肩小蜂均缺少蘇氨酸Thr的ACG密碼子,E.sp. ZJUH 2016013缺少亮氨酸Leu的CUC和絲氨酸Ser的AGC密碼子,以及Sycophilasp.2 JXW 2020缺少精氨酸Arg的CGC密碼子,其他氨基酸使用的密碼子均相同,密碼子使用率排序基本一致,只有Sycophilasp. 2 JXW 2020的UUU使用率高于AUU(圖2),這反映了核苷酸組成的AT偏好性。

2.3 tRNA基因、rRNA基因和控制區(qū)

元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組包含22個(gè)tRNA基因,總長(zhǎng)為1 453 bp,占整個(gè)線粒體基因組全長(zhǎng)的 9.17%(長(zhǎng)度范圍: 57～71 bp)。其中有14個(gè)tRNA基因由重鏈編碼,其余8個(gè)tRNA基因由輕鏈編碼;tRNA基因的A+T含量為87.25%,AT偏斜為0.009,GC偏斜為0.190。除了trnI缺受體臂、trnS1缺DHU臂、trnF缺TΨC臂和trnS2的 DHU臂僅形成一個(gè)簡(jiǎn)單的環(huán)外,其余18個(gè)tRNA基因可以形成常規(guī)的三葉草結(jié)構(gòu)(圖3)。在trnA,trnL1和trnS2的氨基酸臂、trnG和trnQ的DHU臂中共出現(xiàn)5處錯(cuò)配,錯(cuò)配堿基均為G-U。

圖3 元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組中22個(gè)tRNA基因的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 3 Predicted secondary structure of the 22 tRNA genes in the mitochondrial genome of Eurytoma acutibialis

元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組包含兩個(gè)rRNA基因rrnS和rrnL,長(zhǎng)度分別為763和1 299 bp,位于重鏈J,被trnQ和trnA分隔開。rRNA的基因全長(zhǎng)2 062 bp,A+T含量為86.20%,T, C, A和G含量分別為43.10%, 4.90%, 43.10%和9.00%,比整個(gè)線粒體基因組A+T堿基含量要高,AT偏斜為0.007,GC偏斜為0.294?？刂茀^(qū)長(zhǎng)度為762 bp,T, C, A和G 的堿基含量分別為29.67%, 7.73%, 40.53%和19.57%,A+T堿基含量為70.20%,AT偏斜為0.155,GC偏斜為0.313。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化

貝葉斯法分析的結(jié)果顯示,支持小蜂總科(Chalcidoidea)各個(gè)類群之間的分類關(guān)系為(((((柄翅小蜂科(Mymaridae)+((((榕小蜂科(Agaonidae)+小蜂科(Chalcididae))+(((金小蜂科(Pteromalidae)+((蚜小蜂科(Aphelinidae)+長(zhǎng)尾小蜂科(Torymidae)+赤眼蜂科(Trichogrammtidae))+(姬小蜂科(Eulophidae)+旋小蜂科(Eupelmidae)+廣肩小蜂科(Eurytomidae)+跳小蜂科(Encyrtidae))))))(圖4: A)。最大似然法支持的小蜂總科各個(gè)類群之間的分類關(guān)系為((((柄翅小蜂科(Mymaridae)+小蜂科(Chalcididae))+榕小蜂科(Agaonidae)))+(姬小蜂科(Eulophidae)+金小蜂科(Pteromalidae))))+(跳小蜂科(Encyrtidae)+廣肩小蜂科(Eurytomidae)+旋小蜂科(Eupelmidae)+蚜小蜂科(Aphelinidae)+長(zhǎng)尾小蜂科(Torymidae)+赤眼蜂科(Trichogrammtidae)))))(圖4: B)。綜合比較兩種方法,雖然貝葉斯法中個(gè)別分支節(jié)點(diǎn)上的支持率較低,并且與最大似然法展示的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)存在差異,但是兩種系統(tǒng)發(fā)育樹均支持小蜂總科各亞科的單系性。根據(jù)兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,跳小蜂科、廣肩小蜂科和旋小蜂科在兩種方法中顯示為關(guān)系最近的姐妹群。無論是貝葉斯法還是最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,元寶楓刺脛廣肩小蜂均被歸類于廣肩小蜂屬Eurytoma,與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致,并顯示與Eurytomasp. ZJUH 2016013之間存在較為密切的親緣關(guān)系。

2.5 基因重排

研究結(jié)果表明,膜翅目小蜂總科普遍存在基因重排現(xiàn)象,主要發(fā)生在tRNA基因和rRNA基因,而13個(gè)PCGs排序在各亞科內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。與祖先昆蟲相比,外群和柄翅小蜂科的13個(gè)PCGs排序與元寶楓刺脛廣肩小蜂的一致,而其他小蜂總科昆蟲的基因排序則發(fā)生了改變,尤其在長(zhǎng)尾小蜂科、赤眼蜂科、跳小蜂科和廣肩小蜂科中存在多種基因重排方式。本研究鑒定到13個(gè)PCGs的排列方式存在8種基因排列類型,其中cox1-cox2-atp8-atp6-cox3-nad3-nad2-nad1-cytb-nad6-nad4L-nad4-nad5,cox1-cox2-atp8-atp6-cox3-nad2-nad3-nad1-cytb-nad6-nad4L-nad4-nad5和cox1-nad5-nad4-nad4L-nad6-cytb-nad1-nad2-nad3-cox3-atp6-atp8-cox2這3種排列方式在多個(gè)物種中共享,而廣肩小蜂利用其中兩種排列方式。

與祖先昆蟲相比,元寶楓刺脛廣肩小蜂的27個(gè)基因發(fā)生了重排,其中cox1-L2-cox2-K-D-atp8-xx-cox3-G-nad3排列順序和方向均一致,而nad2-xx-rrnS-xx-rrnL-L1-nad1-xxx-cytb-nad6-P-T-nad4L-nad4-H-nad5發(fā)生了原位倒置。此外,16個(gè)tRNA基因也發(fā)生了基因重排,其中trnC和trnM發(fā)生基因移位,trnH,trnT,trnP和trnL1發(fā)生倒置,trnS2發(fā)生異位倒置,trnF-trnE,trnW-trnS1-trnY-trnI-trnV和trnQ-trnA發(fā)生基因洗牌。rrnS和rrnL由A和Q隔開,這一現(xiàn)象也存在于柄翅卵小蜂科、榕小蜂科、蚜小蜂科、長(zhǎng)尾小蜂科、旋小蜂科和跳小蜂科中。

3 討論

根據(jù)魏書軍(2009)的研究,大多數(shù)膜翅目昆蟲的線粒體基因組表現(xiàn)出明顯的AT偏斜現(xiàn)象。在膜翅目小蜂總科昆蟲中,A+T含量一般在75%～90%之間,其中跳小蜂科基因組具有最低的A+T含量(78.40%),而柄翅小蜂科具有最高的A+T含量(87.50%)。作為廣肩小蜂的成員,已知的3個(gè)廣肩小蜂線粒體基因組A+T含量均超過了80%。例如,元寶楓刺脛廣肩小蜂的A+T含量為82.00%(表1),由37個(gè)典型基因(13個(gè)PCGs、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因)和一段控制區(qū)組成,與大部分膜翅目昆蟲線粒體基因組的結(jié)果(Boore, 1999; Huangetal., 2016; Tangetal., 2021; Zhaoetal., 2021; Zhouetal., 2021)一致。這些基因,有27個(gè)位于J鏈,10個(gè)位于N鏈,這與許多物種的編碼基因大多數(shù)位于J鏈,只有少數(shù)位于N鏈的情況(Boore, 1999)一致。關(guān)于小蜂總科的文獻(xiàn)報(bào)道中并未詳細(xì)說明基因的分布情況,目前僅在長(zhǎng)尾小蜂科中的螳小蜂Podagrionsp.的研究中觀察到類似的現(xiàn)象(Yangetal., 2019),造成這種現(xiàn)象的原因可能是物種進(jìn)化過程中基因重排所導(dǎo)致的,具體原因有待進(jìn)一步研究研討。

元寶楓刺脛廣肩小蜂有部分tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)上存在缺陷,如trnS1缺失了 DHU臂,這與小蜂科、姬小蜂科、跳小蜂科、金小蜂科等的情況 (Yanetal., 2019; Zhang YCetal., 2020; Tangetal., 2021; Zhouetal., 2021)相似。trnS2的DHU臂僅形成小環(huán),這與廣肩小蜂E.sp. TJS 2016以及其他一些膜翅目昆蟲的情況(Weietal., 2010; Suetal., 2016; Zhangetal., 2017; Xingetal., 2021)相似。兩個(gè)rRNA基因由trnQ和trnA分隔,這一特征在Eurytomasp. TJS-2016和Eurytomasp. ZJUH_2016013中觀察到,但在Sycophilasp. 2 JXW-2020中卻不存在。Su等(2016)指出這一特點(diǎn)在膜翅目廣肩小蜂為獨(dú)特存在,然而,我們發(fā)現(xiàn)柄翅卵小蜂科、榕小蜂科、蚜小蜂科、長(zhǎng)尾小蜂科、旋小蜂科和跳小蜂科也存在這種現(xiàn)象。

線粒體基因重排在纓翅目、蚧蟲、虱目、膜翅目昆蟲中普遍存在(Shaoetal., 2001; Dowtonetal., 2002; 魏書軍, 2009; Weietal., 2010; Xiaoetal., 2011; 陳志騰和杜予州, 2016; Luetal., 2020; Tyagietal., 2020; 王建霞等, 2021; 鄧鋆等, 2022; Yietal., 2022)。本研究通過對(duì)膜翅目小蜂總科、細(xì)蜂總科和姬蜂總科的線粒體基因組進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)小蜂總科昆蟲線粒體基因重排速率高,特別是在tRNA和rRNA基因的排列上存在大量移位、原位和異位倒置。元寶楓刺脛廣肩小蜂的線粒體基因組發(fā)生了重排,其中tRNA基因的兩側(cè)除trnV和trnS1外均有基因間隔,這與魏書軍(2009)的報(bào)道一致,即發(fā)生重排的基因兩側(cè)一般存在基因間隔;PCGs在單系群內(nèi)的排列相對(duì)保守,在所有分析的膜翅目中,atp8-atp6-cox3,nad4-nad4L和nad6-cytb保持不變,這些PCGs之間無tRNA基因,而小蜂總科得cox3和nad3之間發(fā)生了基因重排;但在膜翅目青蜂總科、蜜蜂總科、胡蜂總科、姬蜂總科、細(xì)蜂總科和旗腹蜂總科中atp8-atp6-cox3-trnG-nad3保持不變(魏書軍, 2009),進(jìn)一步說明了小蜂總科的進(jìn)化速率更快。

通過貝葉斯法和最大似然法兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果均支持廣肩小蜂科的單系性,并支持跳小蜂科、廣肩小蜂科和旋小蜂科為姐妹群,與其他小蜂總科各亞科形成不同的姊妹群和并系群,這與先前報(bào)道的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(Zhaoetal., 2021)一致。貝葉斯法支持柄翅小蜂科在小蜂總科的基部位置,但不支持Eurytoma亞屬和Sycophila亞屬的單系性;而最大似然法支持Eurytoma亞屬和Sycophila亞屬的單系性。無論是貝葉斯法還是最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,元寶楓刺脛廣肩小蜂均被歸類于廣肩小蜂屬Eurytoma,與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致,并表明其與Eurytomasp. ZJUH 2016013親緣關(guān)系較近。本研究獲得了元寶楓刺脛廣肩小蜂線粒體基因組序列和結(jié)構(gòu)組成等基礎(chǔ)信息數(shù)據(jù),豐富了廣肩小蜂科基因組的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù),并分析了小蜂總科中基因重排現(xiàn)象,結(jié)果提示線粒體基因組可以作為研究類群分化的參考依據(jù),但不能作為小蜂總科分類學(xué)的主要指標(biāo)。

致謝元寶楓籽象Bradybatussp.由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所張潤(rùn)志研究員幫助鑒定,在此謹(jǐn)表謝意。