劉三波，鄭思雨，龔達林，池蓮鋒，魏 民，歐陽圳，王李林，郭盛合

（1.華潤三九（黃石）藥業(yè)有限公司，湖北黃石 435000；2.華中農業(yè)大學，武漢 430070；3.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳 518000；4.黃石市森林植物檢疫站，湖北黃石 435000）

青牛膽［Tinospora sagittata（Oliv.）Gagnep.］為多年生常綠纏繞藤本植物，是中藥材金果欖的基原植物，又名九牛膽、地苦膽等。中藥材金果欖味苦、性寒，歸肺、大腸經(jīng)，有清熱解毒、利咽、止痛等功效，在民間有廣泛的應用基礎，用于咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹熱痛等［1-3］。現(xiàn)代醫(yī)學臨床表明，金果欖具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗?jié)?、治療糖尿病、抗腫瘤等作用［4-12］。

中藥材金果欖供應主要依靠野生資源，而隨著其應用擴大，需求量日漸增加，野生資源不斷減少，且藥材質量參差不齊，進行人工栽培青牛膽已迫在眉睫。為更好地了解青牛膽的生長環(huán)境，為人工栽培提供理論支持，需要對其光合特性等開展研究。本研究旨在探究青牛膽葉位生長進程及其與葉片光合能力的關系，為青牛膽人工栽培的關鍵環(huán)節(jié)如間作套作、遮光等措施制定、種植區(qū)域的布局與規(guī)劃等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于湖北省恩施州利川市華潤三九（黃石）藥業(yè)有限公司青牛膽種植基地（30°20′N，108°59′E），海拔高度1 200 m，屬亞熱帶大陸性季風氣候，年平均氣溫16.7 ℃，年降水量1 400 mm，年平均日照時數(shù)1 409 h，無霜期232 d。試驗地土壤pH 6.45，全氮含量4.35 g/kg，速效磷含量34.03 mg/kg，速效鉀含量168.97 mg/kg，有機質含量34.28 g/kg。

1.2 材料、儀器與試劑

試驗所用植株為防己科青牛膽屬植物青牛膽，由華中農業(yè)大學王學奎副教授鑒定。SPAD-502 儀（日本柯尼卡美能達公司）；UV-4802 型紫外可見分光光度計（美國尤尼柯公司）；Li-6800 便攜式光合測定儀（美國Li-Cor 公司）；95%乙醇（分析純，國藥集團）。

1.3 方法

1.3.1 葉片長度測量 2021 年5 月至6 月，隨機選取10 株長勢一致的青牛膽植株，分別測量其不同葉位的葉片長度（葉片頂端到基部的長度），每2 d 測量1次。試驗中青牛膽的葉位參照廣泛使用的“倒葉”標記，即自主莖頂芽之下產(chǎn)生的肉眼可見的幼嫩葉片記為“倒1 葉”，向下的葉片順序記為“倒2 葉”“倒3葉”…“倒13 葉”，分別以“-1 葉”“-2 葉”“-3 葉”…“-13 葉”表示。

1.3.2 葉片SPAD 值 隨機選取10 株長勢一致的青牛膽植株，采用SPAD-502 儀分別測定各植株不同葉位葉片的SPAD 值。

1.3.3 葉綠素含量測定 隨機選取3 株（3 次重復）長勢一致的青牛膽植株，分別在植株不同葉位的葉片中部取樣。參照王學奎等［13］、袁方等［14］的方法，以95%乙醇將葉片色素提取后，使用UV-4802 型紫外可見分光光度計分別測定、計算葉綠素a、葉綠素b 含量及其相對比值。

1.3.4 光響應曲線 采用Li-6800 便攜式光合測定儀測定葉片的光響應曲線。選擇10 株長勢一致的青牛膽葉片進行測量，控制葉室溫度為25 ℃，相對濕度為70%，設定氣體流速為500 μmol/s，使用CO2鋼瓶將參比室的CO2濃度穩(wěn)定在500 μmol/mol，利用Li-6800 LED 紅藍光源，提供不同強度的光合有效輻射，即1 800、1 500、1 200、800、600、500、400、300、200、150、100、75、50、25、0 μmol/（m2·s），測定時采用標準葉室（6 cm2），測定葉片在不同光強下的凈光合速率。

1.3.5 CO2響應曲線 采用Li-6800 便攜式光合測定儀測定葉片的CO2響應曲線。選擇10 株長勢一致的青牛膽葉片進行測量，控制葉室溫度為25 ℃，相對濕度為70%，設定氣體流速為500 μmol/s，將光合有效輻射設置為800 μmol/（m2·s），利用CO2鋼瓶提供不同濃度的CO2，即50、100、200、300、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000、2 200 μmol/mol，測定時采用標準葉室（6 cm2），測定葉片在不同CO2濃度下凈光合速率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 23 等軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析與處理。

2 結果與分析

2.1 青牛膽不同葉位葉片長度隨生長時間的變化

青牛膽不同葉位葉片長度隨時間變化情況見圖1。如圖1 所示，青牛膽“-1 葉”至“-13 葉“葉片生長過程中長度變化呈3 個特點，“-1 葉”至“-7 葉”葉片長度隨觀測時間延長而持續(xù)增加；“-8 葉”至“-11葉”葉片長度隨觀測時間延長的變化曲線呈“S”形；“-12 葉”“-13 葉”葉片長度隨觀測時間延長呈近似直線變化狀態(tài)。青牛膽靠近頂芽的“-1 葉”至“-7葉”是青牛膽的幼嫩葉，這些葉片具有持續(xù)生長能力；而“-8 葉”到“-11 葉”是青牛膽植株的中部葉，葉片的伸長速度呈“S”形生長曲線，呈明顯降低趨勢；“-12 葉”“-13 葉”葉片長度增加不再明顯，是已完成伸長生長的下部葉。結合觀測結果，可初步判斷“-9 葉”或“-10 葉”是青牛膽植株生長過程中葉片剛達到全展狀態(tài)的葉位（即新生全展葉）；青牛膽葉片在25 ℃環(huán)境條件下從新葉開始生長到達到完全展開需約17 d。

圖1 不同葉位葉片長隨時間變化曲線

2.2 不同葉位葉片的SPAD 值和葉綠素含量變化

2.2.1 不同葉位葉片的SPAD 值變化 由于青牛膽生長過程中靠近頂芽開始展開的2 個葉片（“-1 葉”和“-2 葉”）過小，從“-3 葉”開始測定青牛膽葉片的SPAD 值。青牛膽不同葉位葉片SPAD 值的測定結果見圖2。由圖2 可知，“-3 葉”至“-12 葉”的SPAD值呈2 個特征，隨著葉位降低，葉片SPAD 值呈先升高后降低的趨勢；青牛膽植株中部葉“-9 葉”至“-12葉”葉片的SPAD 值顯著高于“-8 葉”及以上葉位葉片（P＜0.05），“-12 葉”葉位葉片的SPAD 值呈下降趨勢，但與“-9 葉”至“-11 葉”差異不顯著。“-8 葉”以上葉位的葉為片正處于生長的葉片，“-9 葉”至“-11葉”為趨于成熟的葉片，而“-12 葉”及之后葉位的葉片為青牛膽已經(jīng)成熟的下部葉。

圖2 青牛膽不同葉位葉片SPAD 值

2.2.2 不同葉位葉片葉綠素含量變化 由于“-1葉”至“-4 葉”葉片過小，從“-5 葉”開始研究青牛膽葉綠素含量，不同葉位葉片的葉綠素含量（葉綠素a、葉綠素b）變化見圖3。由圖3 可知，“-5 葉”至“-12 葉”葉綠素a 和葉綠素b 的含量變化趨勢相似，均表現(xiàn)為中部葉位葉片的葉綠素含量高，上部葉位的葉綠素含量低，下部葉位的葉綠素呈下降趨勢，“-5 葉”至“-10 葉”葉綠素a、葉綠素b 含量隨著葉位自上而下的降低而增加，“-11 葉”“-12 葉”的葉綠素a、葉綠素b 含量呈下降趨勢，“-10 葉”的葉綠素a、葉綠素b含量最大。這與SPAD值的測定結果基本一致。

圖3 青牛膽不同葉位葉片葉綠素a、葉綠素b 含量及其比值

青牛膽“-5 葉”至“-12 葉”的葉綠素a/b 見圖3。由圖3 可知，青牛膽不同葉位葉片的葉綠素a/b 在2.78～3.21。“-5 葉”至“-9 葉”的葉綠素a/b 值整體上呈上升趨勢，比值在2.86～3.21；“-10 葉”至“-12 葉”葉綠素a/b 呈下降趨勢，但差異不明顯。

2.3 不同葉位葉片光響應曲線差異

青牛膽不同葉位葉片的光響應曲線見圖4。由圖4 可知，青牛膽不同葉位葉片在凈光合速率為0 時的光照強度即光補償點差別不大：“-8 葉”光補償點在30.0 μmol/（m2·s）左右，“-9 葉”至“-12 葉”的光補償點均在25.0 μmol/（m2·s）左右。青牛膽中、下部葉片的光補償點略低于“-8 葉”葉位之前的葉片?！?8 葉”的光飽和點在700.0 μmol/（m2·s）左右，“-10葉”的光飽和點在800.0 μmol/（m2·s）左右，“-9 葉”“-11 葉”“-12 葉”光 飽 和 點 在500.0～600.0 μmol/（m2·s）。青牛膽的完全展開葉（“-10 葉”）的光飽和點高于上部和下部葉位的葉片。青牛膽不同葉位葉片在相應的光飽和點情況下，其葉片的凈光合速率存在差異，具體表現(xiàn)為“-10 葉”［12.30 μmol CO2/（m2·s）］＞“-9 葉”［10.70 μmol CO2/（m2·s）］＞“-11葉”［8.95 μmol CO2/（m2·s）］＞“-8 葉”［6.88 μmol CO2/（m2·s）］＞“-12 葉”［4.40 μmol CO2/（m2·s）］，表明中部“-10 葉”葉片的光合作用能力要強于上部幼葉和下部葉片，結合上述不同葉位葉片的SPAD 值和葉綠素含量的測定結果，可以進一步確定“-10葉”是青牛膽葉片光合能力最旺盛的全展葉位。

圖4 青牛膽不同葉位葉片的光響應曲線

2.4 不同葉位CO2響應曲線差異

青牛膽不同葉位葉片的CO2響應曲線見圖5。由圖5 可知，青牛膽不同葉位葉片在凈光合速率為0時對應的CO2濃度即CO2補償點存在差異，其中“-9葉”“-10葉”的CO2補償點在100.0～150.0 μmol/mol，“-11 葉”“-12 葉”的CO2補 償 點 在150.0～200.0 μmol/mol。CO2飽和點隨葉位的不同而存在變化，“-8 葉”“-9 葉”“-11 葉”“-12 葉”的CO2飽 和 點 在1 000.0 μmol/mol 左 右，“-10 葉”的CO2飽 和 點 在1 250.0 μmol/mol 左右。青牛膽不同葉位CO2補償點和CO2飽和點的差異在整體上呈現(xiàn)中部葉對CO2的利用能力相對強于上部嫩葉和下部老葉；當CO2濃度達到1 250.0 μmol/mol 后，不同葉位葉片的光合作用速率隨CO2濃度的變化曲線都趨于平緩。青牛膽不同葉位葉片的凈光合速率在CO2濃度達到各自的飽和點時存在一定差異，具體表現(xiàn)為在CO2濃度為1 250 μmol/mol 左右時，凈光合速率為“-10 葉”（17.5 μmol/mol）＞“-11 葉”（14.4 μmol/mol）＞“-12葉”（13.6 μmol/mol）＞“-9 葉”（13.6 μmol/mol）＞“-8葉”（9.4 μmol/mol），說明即使在高濃度CO2條件下，青牛膽不同葉位葉片利用CO2的能力存在較大差異，“-10 葉”在高濃度條件下利用CO2的能力明顯高于其他葉位的葉片。

圖5 青牛膽不同葉位葉片的CO2響應曲線

3 討論

3.1 青牛膽生長過程中葉片的伸長生長特性

根據(jù)對青牛膽不同葉位葉長隨時間變化的觀測發(fā)現(xiàn)，青牛膽單個葉片的伸長過程的變化曲線呈“S”形，即在葉片剛伸出的一段時間內，其生長速度較為緩慢，一段時間后葉片生長速率加快，當葉片長度接近最大時生長速度又明顯減慢，直至葉片達到全展狀態(tài)，葉片從伸長生長開始到完全展開至成熟需要約17 d。

3.2 青牛膽的光合特性

本研究發(fā)現(xiàn)，“-10 葉”為青牛膽新生全展葉的葉位，即功能最旺盛的葉位。青牛膽功能葉葉片的葉綠素a/b 約為3，具有較高的CO2補償點（約100 μmol/mol），與常見的C3植物華北地區(qū)冬小麥的CO2的 補 償 點（107.1～123.4 μmol/mol）相 比 差 別 不大［15］，說明青牛膽為C3植物。青牛膽新生全展葉的光補償點約為25.0 μmol/（m2·s），高于陰生植物的光補償點10.0 μmol/（m2·s）［16］，而藥用植物中比較典型的陰生植物如人參、三七的光補償點分別為5.0～20.0 μmol/（m2·s）、5.45～10.34 μmol/（m2·s）［17，18］，青牛膽的光補償點相對較高；陰生植物如吉祥草的葉綠素a/b 約2.12［14］，青牛膽并非陰生植物；但其光飽和對應的光強為800 μmol/（m2·s）左右，與常見的喜陽作物的光飽和點相比較低，說明青牛膽喜陽但不耐強光，這可能與野生青牛膽長期生長在林下、受光不足的環(huán)境有關。

對青牛膽的光合特性初步研究發(fā)現(xiàn)，結合青牛膽葉片的CO2響應曲線和光響應曲線的變化趨勢，在人工栽培時，可在一定程度增加環(huán)境CO2的濃度或適當增大光強，可提高青牛膽的光合生產(chǎn)效率從而增加其生長量。青牛膽下部老葉的光合效能較低，在人工栽培過程中可通過適當摘除下部衰老葉片，提高種植密度，以達到增產(chǎn)的目的。青牛膽喜陽但不耐強光，在進行生產(chǎn)栽培時，可以將其栽種在背陽的坡地、適當遮蔭或與高稈作物如玉米等進行間作、套作，更加有利于青牛膽植株的生長。