韓勝男,王 璐,張映嬋,梁 娟,牛善策,3,郝麗紅,向地英,鄭志興,陳段芬

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,河北保定 071001;2.石家莊市植物園,石家莊 050073;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定 071001;4.張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河北張家口 075000)

帝王大麗花(Dahliaimperialis),又名樹狀大麗花,是菊科大麗花屬多年生大型草本或半灌木植物,原產(chǎn)于墨西哥南部至哥倫比亞之間海拔1500～1700m的山地,是近年來(lái)新引入國(guó)內(nèi)的珍稀大麗花種類。帝王大麗花株高可達(dá)5～6m,是大麗花屬中最高大的種類;其地下部分為大型棒狀塊根;莖具四棱;節(jié)膨大;2～3回大型奇數(shù)羽狀復(fù)葉對(duì)生[1];在晚秋至初冬季節(jié)開花,大量頭狀花序自莖端及葉腋伸出,花序直徑可達(dá)7.5～15cm,舌狀花顏色為淡紫色或粉紫色,管狀花顏色為橙黃色。因此,帝王大麗花因其株型高大、花繁葉茂成為園林綠化不可多得的優(yōu)良材料。

帝王大麗花目前通過扦插和分根繁殖,但其球根萌芽率低、分枝數(shù)量少、扦插生根慢,所以繁殖系數(shù)較低,難以滿足市場(chǎng)需求。并且隨著扦插、分根等繁殖代數(shù)的增加,品種退化問題也會(huì)逐漸顯現(xiàn)[2]。針對(duì)上述問題,利用帝王大麗花各類器官或組織作為外植體,建立高效離體組培快繁體系,不僅能夠加快帝王大麗花的繁殖速度,還能規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗,同時(shí)也為帝王大麗花種質(zhì)資源的離體保存提供技術(shù)支持。但是,在切取帝王大麗花莖段外植體時(shí),切口處存在極其快速的褐變現(xiàn)象,即使在取材后快速地浸入水中,在之后的消毒過程中或外植體接種到培養(yǎng)基后仍然會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的褐變問題,導(dǎo)致后續(xù)組培試驗(yàn)不能正常進(jìn)行。目前大麗花屬植物在組培快繁方面圍繞愈傷組織誘導(dǎo)[3]、不定芽再生[4]、試管苗生根[5]、莖尖脫毒[6]等做了大量研究,但鮮見有外植體褐變問題的報(bào)道。因此,研究帝王大麗花外植體褐變?cè)蚣坝绊懸蛩?可為帝王大麗花組培快繁提供理論和技術(shù)支持,對(duì)推動(dòng)大麗花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年12月—2021年10月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)園藝學(xué)院進(jìn)行。供試材料為栽植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)東校區(qū)試驗(yàn)基地的1 a生帝王大麗花枝條,取樣時(shí)腋芽處于剛萌發(fā)狀態(tài),挑選的枝條直徑不超過1 cm,其長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷,取下后立即將基部切口浸入水中。

1.2 試驗(yàn)方法

外植體切割環(huán)境處理:將消毒處理后的不帶芽莖段放在不同環(huán)境下進(jìn)行切割,分別記為A:空氣中切割;B:無(wú)菌水中切割;C:在1.0%的維生素C溶液中切割。

枝條水插處理:將離體枝條放在18 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行不同時(shí)間的水插處理,期間每天定時(shí)換水,并及時(shí)剪掉枝條基部變色部分,分別記為S1:水插0 d;S2:水插2 d;S3:水插5 d;S4:水插7 d。

水插枝條低溫處理:將水插處理5 d后的枝條放在 4 ℃冰箱進(jìn)行不同時(shí)間的低溫處理,分別記為W1:4 ℃處理0 h;W2:4 ℃處理5 h;W3: 4 ℃處理10 h;W4:4 ℃處理15 h;W5:4 ℃處理20 h;W6:4 ℃處理24 h。

接種后黑暗處理:用黑布將接種后的外植體遮蓋,分別進(jìn)行不同時(shí)間的黑暗處理,分別記為H1:暗培養(yǎng)0 d;H2:暗培養(yǎng)2 d;H3:暗培養(yǎng)7 d;H4:暗培養(yǎng)14 d。

接種后低溫處理:將接種后的外植體放在 4 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行不同時(shí)間的低溫處理,同時(shí)在接種前7 d內(nèi)進(jìn)行黑暗處理,分別記為Wa:暗+4 ℃處理0 d;Wb:暗+4 ℃處理2 d;Wc:暗+4 ℃處理4 d;Wd:暗+4 ℃處理6 d,外植體在黑暗和溫度處理后轉(zhuǎn)組培室正常培養(yǎng)。

1.3 無(wú)菌外植體的獲取與接種

2021年9月1日取樣后,截取第2節(jié)位的帶芽莖段和靠近第2節(jié)位上下部分1～2 cm的不帶芽莖段均剪成3～4 cm的長(zhǎng)度,于洗潔精溶液中攪拌清洗10 min后,放在流水下沖洗1 h,材料沖洗干凈后放在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒和接種。先采用75%酒精處理30 s,無(wú)菌水沖洗2次;再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%升汞處理6 min,無(wú)菌水沖洗5次,最后將沖洗干凈的外植體浸泡在無(wú)菌水中待用。接種時(shí)用無(wú)菌手術(shù)刀切去切面與消毒劑接觸的部分直至露出新鮮組織,按照形態(tài)學(xué)方向豎直接種到培養(yǎng)基中。初代培養(yǎng)時(shí)接種的培養(yǎng)基為啟動(dòng)培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方為:MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂,pH為5.8。培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度(25±2) ℃,光照周期16 h/d,光照度1 500～2 000 lx。每瓶分裝培養(yǎng)基30 mL,接種1個(gè)外植體,每個(gè)處理接種30個(gè)外植體,重復(fù)3次。接種后每隔7 d觀察外植體的褐變情況,培養(yǎng)周期為21 d或28 d。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

用褐變指數(shù)表示外植體褐變的程度,將外植體的褐變程度分以下4級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。褐變等級(jí)(L)=外植體褐變面積/外植體體積。0級(jí):外植體外表鮮綠色,無(wú)褐變(L=0);1級(jí):輕度褐變,外植體基本為綠色(L≤1/4);2級(jí):褐變,外植體褐色(1/43/4)。

褐變指數(shù)=∑(褐變級(jí)數(shù)×該級(jí)株數(shù))/(總株數(shù)×最高級(jí)數(shù))×100%

污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體 數(shù)×100%

多酚氧化酶(PPO)活力的測(cè)定采用兒茶酚法[7],單位為U/(g·min);苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的測(cè)定采用巰基乙醇法[8-9],單位為U/(g·h);總酚的測(cè)定采用福林酚試劑法[10],總酚含量單位為mg/g。

色度測(cè)定:使用CR410型色差計(jì)于室溫下測(cè)定,得出L*值,分析不同取材部位縱切面的褐變程度(L*值為亮度指數(shù),從0～100變化,L*=0表示黑色,L*=100表示白色,其值越大亮度越高,表面褐變?cè)捷p,反之褐變?cè)絿?yán)重)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理,用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枝條切口褐變的影響因素

2.1.1 枝條不同節(jié)位切口的褐變程度差異 將帝王大麗花不同節(jié)位切開后暴露在空氣中,測(cè)定在不同時(shí)間點(diǎn)L*值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同節(jié)位L*值隨時(shí)間變化都呈下降趨勢(shì)(圖1),其中以頂芽、2節(jié)和3節(jié)下降的較多,分別下降2.11、1.74和 1.99,4節(jié)和5節(jié)下降的少,分別為0.92和0.79,說明帝王大麗花上端枝條比下端枝條褐變嚴(yán)重。

圖1 枝條不同節(jié)位切口的褐變程度差異Fig.1 Difference in browning degree of different nodal incisions on branches

2.1.2 外界條件對(duì)枝條切口褐變的影響 空氣暴露時(shí)間對(duì)枝條切口褐變的影響:將帝王大麗花枝條切開后暴露于空氣中觀察切口顏色變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),切開后5 s枝條切口即發(fā)生輕微褐變, 2 min后切面全部變成淺褐色。隨著切面在空氣中暴露時(shí)間延長(zhǎng),褐變程度加重,由初期的淺褐色變?yōu)榧t褐色,30 min時(shí)全部變?yōu)楹诤稚?圖2)。

圖2 帝王大麗花枝條切口在空氣中暴露時(shí)間與褐變程度變化Fig.2 Exposure time and browning degree of branch incisions of D.imperial

浸水與浸水加氧處理對(duì)褐變的影響:分別選取帝王大麗花植株頂芽至第5節(jié)位的帶芽莖段(從左到右),分別在浸水條件(圖3-a)和浸水加氧條件下(圖3-b)培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn),兩個(gè)處理的莖段上部幼嫩部分出現(xiàn)褐變的時(shí)間早于下部成熟部分,且枝條上端褐變程度高于下端褐變程度。其中,浸水處理除頂芽外其他莖段只有葉柄部位出現(xiàn)嚴(yán)重褐變,整體可以保持基本綠色,而浸水加氧處理的頂芽和莖段全部褐變死亡。綜合比較5個(gè)節(jié)位的褐變程度,浸水加氧處理褐變比浸水處理更為嚴(yán)重(圖3)。由此可以初步確定,外界氧氣可以加劇帝王大麗花的褐變程度,其切口褐變的類型為酶促褐變。

圖3 浸水(a)和浸水加氧(b)處理24 h后不同節(jié)位莖段褐變情況Fig.3 Browning of stem segments at different nodes after water insertting (a) and water insertting with oxygen(b) for 24 hours

不同溫度下褐變程度差異:在不同季節(jié)取樣后,5 min時(shí)觀察帝王大麗花相同節(jié)位切面?zhèn)诘暮肿兂潭?以7月份取樣后傷口褐變嚴(yán)重(圖4-a),顏色表現(xiàn)為黑褐色;12月份取樣后切面出現(xiàn)輕微褐變(圖4-b),相比7月份褐變程度顯著降低,說明冬季較低的溫度可能對(duì)褐變起到顯著的抑制作用。

圖4 7月(a)和12月(b)取樣后切口的褐變情況Fig.4 Browning of incisions after sampling in July and December

2.2 枝條不同節(jié)位切口褐變程度與相關(guān)酶活性的相關(guān)性

帝王大麗花枝條不同節(jié)位PPO活性的測(cè)定結(jié)果見圖5。從枝條形態(tài)學(xué)上端到形態(tài)學(xué)下端,不同節(jié)位中PPO活性呈逐漸下降的趨勢(shì)。其中,頂芽與第2、3節(jié)的PPO活性均在812.30 U/(g·min)以上,差異不顯著;第4節(jié)PPO活性為552.90 U/(g·min),與其上端或下端節(jié)位差異顯著;第5節(jié)位PPO活性最低,為190.30 U/(g·min),與上端的所有節(jié)位差異顯著。

不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異性顯著

帝王大麗花枝條不同節(jié)位PAL活性差異從枝條形態(tài)學(xué)上端到下端,PAL活性呈下降趨勢(shì),其中,頂芽PAL活性最高,與其下端部位之間具有顯著性差異;第2節(jié)與第3節(jié)之間酶活性無(wú)顯著差異,但與下端部位差異性顯著;第4節(jié)與第5節(jié)之間的PAL活性無(wú)顯著性差異。

帝王大麗花枝條不同節(jié)位總酚含量從枝條形態(tài)學(xué)上端到下端,總酚的含量呈下降趨勢(shì),其中,頂芽總酚含量最高,為0.10 mg/g,但與第2、3、4節(jié)之間無(wú)顯著性差異;下端第5節(jié)位的總酚含量最低,僅有0.05 mg/g,與頂芽總酚含量差異顯著。

2.3 不同處理措施對(duì)外植體褐變的影響

2.3.1 不同切割環(huán)境對(duì)外植體褐變的影響 由表1可知,不同處理的外植體均在接種后出現(xiàn)不同程度的褐變,其中,在1.0%維生素C溶液中切割(C)褐化程度最輕;雖然接種2 d時(shí)1.0%的維生素C溶液中切割(C)比正常切割(A)和在無(wú)菌水中切割(B)褐變指數(shù)高出15.25%和19.30%,但在接種14 d時(shí),C處理比A、B褐變指數(shù)分別低4.86%和3.52%;到接種21 d時(shí),與A、B相比,C處理褐變指數(shù)最低,且在整個(gè)培養(yǎng)期間,C處理褐變指數(shù)增長(zhǎng)幅度最小,能夠基本保持穩(wěn)定狀態(tài),但A、B處理的褐變指數(shù)隨著時(shí)間延長(zhǎng)一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。雖然B、C處理的外植體污染率比A處理分別高出25.93%和14.81%,但污染率在培養(yǎng)期間內(nèi)并未對(duì)外植體褐變?cè)斐捎绊憽?/p>

表1 接種時(shí)不同切割環(huán)境外植體褐變指數(shù)和污染率Table 1 Browning index and contamination rate of explants under different cut environments during inoculation

對(duì)接種到培養(yǎng)基的外植體進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn):A處理后接種到培養(yǎng)基時(shí),外植體會(huì)立刻發(fā)生嚴(yán)重褐變,褐變部分顏色逐漸加深,直至表面全部變成黑褐色,與培養(yǎng)基接觸部分可見紅褐色物質(zhì)析出,且面積相對(duì)較大;B處理接種到培養(yǎng)基后,外植體褐變程度相比A稍有減輕,僅有少量紅褐色物質(zhì)析出,培養(yǎng)基紅褐色面積較小;C處理后接種到培養(yǎng)基,外植體只出現(xiàn)輕微褐變,與培養(yǎng)基接觸部分顏色正常,沒有紅褐色物質(zhì)析出(圖6)。

圖6 A、B、C接種后正、底面褐變比較Fig.6 Comparison of browning on front and bottom surfaces of A,B and C after inoculation

2.3.2 水插和低溫處理對(duì)外植體接種后褐變的影響 帝王大麗花枝條下部進(jìn)行不同時(shí)間水插處理對(duì)外植體接種后褐變的影響見表2。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,所有處理的外植體在接種后褐變指數(shù)均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。接種28 d時(shí)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,水插處理的外植體褐變指數(shù)均低于對(duì)照S1(未水插),其中以水插5 d(S3)和水插7 d(S4)處理效果好,與對(duì)照處理S1相比,褐變指數(shù)分別降低12.60%和12.45%,而水插2 d(S2)比對(duì)照S1褐變指數(shù)僅降低5.06%。所有接種的外植體污染率雖然保持在70.00%～81.82%,但并未對(duì)褐變程度造成影響(表2)。

表2 不同的水插時(shí)間外植體褐變指數(shù)和污染率Table 2 Browning index and contamination rate of explants under different waterinserttingtime

接種21 d后,對(duì)照S1處理的帶芽莖段褐變嚴(yán)重,顏色呈現(xiàn)黑褐色,其幼芽生長(zhǎng)不正常,葉片蜷曲不能展開并伴有褐變;S2和S4處理后的帶芽莖段,新長(zhǎng)出來(lái)的幼芽狀態(tài)較S1好,整體褐變程度也低;S3處理后效果最好,萌發(fā)的幼芽生長(zhǎng)健壯,葉片濃綠,展開正常(圖7)。

圖7 接種21 d時(shí)不同水插時(shí)間處理外植體褐變及幼芽長(zhǎng)勢(shì)情況Fig.7 Browning of explants and bud growth at 21 days after inoculation with different water insertting time

水插5 d后4 ℃低溫處理時(shí)間對(duì)外植體褐變的影響見表3。結(jié)果表明,將帝王大麗花枝條先放在18 ℃的培養(yǎng)箱中水插處理5 d,然后放在 4 ℃冰箱低溫處理5 h后抑制褐變效果最好,相比處理W1外植體褐變指數(shù)降低5.17%,相比處理S1褐變指數(shù)降低17.12%,但是隨著4 ℃低溫處理時(shí)間的增加,褐變指數(shù)都快速升高,表現(xiàn)出比對(duì)照W1更明顯的褐變。其中,4 ℃處理10 h(W3)和4 ℃處理15 h(W4)褐變指數(shù)分別為 91.00%和90.00%,4 ℃處理20 h(W5)和4 ℃處理24 h(W6)褐變指數(shù)分別為82.29%和 80.95%。污染率能夠保持在80%以下,未對(duì)褐變指數(shù)造成影響(表3)。

表3 外植體進(jìn)行不同時(shí)間的低溫預(yù)處理褐變指數(shù)和污染率Table 3 Browning index and contamination rate of explants after different time of low temperature pretreatment

培養(yǎng)21 d后比較不同處理下外植體的生長(zhǎng)情況,W1和W2處理后的帶芽莖段其萌發(fā)的幼芽能夠正常生長(zhǎng),且不發(fā)生褐變。W3和W4處理后的帶芽莖段在萌發(fā)的幼芽基部即發(fā)生褐變,并逐漸蔓延至全株;W5和W6處理后的帶芽莖段其幼芽生長(zhǎng)停滯,并伴有輕微褐變現(xiàn)象(圖8)。

2.3.3 接種后暗處理和低溫處理對(duì)外植體褐變的影響 接種后不同時(shí)間暗處理對(duì)外植體褐變的影響:由表4可知,隨著暗培養(yǎng)時(shí)間增加,外植體褐變有減輕趨勢(shì)。在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)外植體褐變情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn):暗培養(yǎng)0d(H1)和暗培養(yǎng)2 d(H2)隨接種后培養(yǎng)時(shí)間變化褐變指數(shù)呈上升趨勢(shì)。在接種21 d時(shí),暗培養(yǎng)7 d(H3)和暗培養(yǎng)14 d(H4)褐變指數(shù)比對(duì)照H1分別降低 5.36%,H4在暗培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)正常培養(yǎng),其褐變指數(shù)能基本保持穩(wěn)定。H2、H3的污染率高于H1、H2。

接種培養(yǎng)14 d時(shí),對(duì)照暗培養(yǎng)0 d(H1)的外植體,其接觸培養(yǎng)基部分隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加一直呈現(xiàn)紅褐色,且面積較大;經(jīng)過暗培養(yǎng)2 d(H2)的外植體,接觸的培養(yǎng)基顏色為黑褐色;經(jīng)過暗培養(yǎng)7 d(H3)和暗培養(yǎng)14 d(H4)的外植體,培養(yǎng)基顏色正常(圖9)。

圖9 接種14 d時(shí)不同時(shí)間黑暗處理的外植體情況Fig.9 Dark treatment of explants at different time at 14 days after inoculation

接種后暗處理+低溫處理對(duì)外植體褐變的影響:接種后暗處理+不同時(shí)間4 ℃低溫處理對(duì)外植體褐變的影響見表5。結(jié)果表明,在黑暗條件下,所有經(jīng)過4 ℃低溫處理的外植體在培養(yǎng)周期(28 d)內(nèi)的褐變指數(shù)均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。暗處理+4 ℃ 0 d(Wa)和暗處理+ 4 ℃ 2 d(Wb)在培養(yǎng)14 d后褐變指數(shù)趨于穩(wěn)定;暗處理+4 ℃ 4 d(Wc)在培養(yǎng)21 d后褐變指數(shù)趨于穩(wěn)定;暗處理+4 ℃6 d(Wd)在培養(yǎng)21 d后褐變指數(shù)不再變化。相同時(shí)間節(jié)點(diǎn)獲得的數(shù)據(jù)表明,暗處理+4 ℃6 d(Wd)的褐變指數(shù)均低于其他處理,效果最好。接種28 d時(shí)發(fā)現(xiàn),Wd褐變指數(shù)比Wa低31.25%,比Wc低21.05%,比Wb低 18.42%。污染率數(shù)據(jù)表明,暗處理+4 ℃低溫處理的時(shí)間越長(zhǎng),污染出現(xiàn)的時(shí)間越晚,所有處理在培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)(28 d)雖然全部污染,但污染未對(duì)外植體褐變程度產(chǎn)生影響。

表5 接種后暗處理+4 ℃低溫處理不同時(shí)間外植體褐變指數(shù)和污染率Table 5 Browning index and contamination rate of explants dark treatment under +4 ℃ low temperature treatment time after inoculation

研究發(fā)現(xiàn),接種6 d時(shí),外植體褐變情況以Wa褐變程度最嚴(yán)重,外植體幾乎全部變褐,Wb相比對(duì)照Wa褐變程度較輕,顏色較淺,Wc和Wd的效果最好,褐變程度最淺,此時(shí)所有帶芽莖段均未出芽(圖10);接種28 d時(shí)觀察,Wa處理下的帶芽莖段褐變死亡,幼芽始終處于萌發(fā)狀態(tài)而不生長(zhǎng),Wb和Wc處理下的外植體幼芽萌發(fā)生長(zhǎng),葉片呈現(xiàn)黃綠色,Wd處理下的外植體幼芽萌發(fā)生長(zhǎng),并且葉片濃綠,展開正常,長(zhǎng)勢(shì)健壯 (圖11)。

圖11 接種28 d時(shí)暗處理+4 ℃處理不同時(shí)間外植體褐變及幼芽長(zhǎng)勢(shì)Fig.11 Browning and bud growth of explants at 28 days after dark treatment of +4 ℃ low temperature at different time

3 討 論

褐變按其發(fā)生機(jī)理分為酶促褐變和非酶促褐變兩大類[11]。新鮮的植物組織受到損傷時(shí)多發(fā)生酶促褐變,即由于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,組織中多酚氧化酶被激活,酚類化合物被氧化形成褐色的醌類物質(zhì),在酪氨酸酶作用下,與植物組織中的蛋白發(fā)生聚合,從而抑制很多代謝酶的活性,導(dǎo)致代謝紊亂,生長(zhǎng)受阻,最終致使材料逐漸變褐死亡[12]。引起酶促褐變的因素主要是氧、底物、酶等。本研究中,針對(duì)帝王大麗花枝條取材時(shí)切口嚴(yán)重褐化問題,比較枝條不同節(jié)位褐變程度的差異,探究枝條水插和低溫預(yù)處理對(duì)褐變的影響,并對(duì)接種后的外植體進(jìn)行黑暗和低溫處理來(lái)減輕褐變的發(fā)生。

不同取材部位對(duì)外植體的褐變程度有著重要影響[13]。程世平等[14]研究不同取材類型對(duì)黃連木莖段褐化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),外植體木質(zhì)化程度與褐化程度以及腋芽的誘導(dǎo)發(fā)生密切相關(guān),其中半木質(zhì)化的莖段褐化率相對(duì)較低,幼嫩莖段褐變嚴(yán)重。本試驗(yàn)中也得出與上述一致的結(jié)論。帝王大麗花從枝條上端到下端木質(zhì)化程度變化明顯,取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)上端幼嫩部分比下部成熟部分褐變更嚴(yán)重。通過測(cè)定自上而下5個(gè)節(jié)位的PPO活性、PAL活性和總酚含量,結(jié)合不同節(jié)位莖段切口的褐變程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)上端幼嫩部分PPO活性、PAL活性和總酚含量明顯高于下端老熟部分,這種變化趨勢(shì)與枝條自上而下的褐變減輕相伴隨,說明幼嫩組織中PAL活性較高,導(dǎo)致PAL誘導(dǎo)產(chǎn)生的酚類物質(zhì)較多,而幼嫩組織中誘導(dǎo)酚類物質(zhì)氧化形成醌類物質(zhì)的關(guān)鍵酶PPO活性較高,從而導(dǎo)致醌類物質(zhì)在幼嫩組織中的增加而出現(xiàn)組織褐變。隨著取樣部位從幼嫩到老熟的變化,木質(zhì)化程度越高的老熟部位中PAL活性、PPO活性和總酚物質(zhì)含量的降低,因此褐變現(xiàn)象減輕。

外植體切割環(huán)境對(duì)帝王大麗花外植體的褐變程度有明顯影響。王仁睿等[15]將蝴蝶蘭莖尖放在1%維生素C溶液切割,再接種到添加0.2%PVP的培養(yǎng)基上,防止蝴蝶蘭莖尖褐化效果顯著。本研究在培養(yǎng)周期結(jié)束后,相比于空氣中切割外植體(A),無(wú)菌水中切割(B)和在1%的維生素C溶液中切割(C)對(duì)于減輕褐變都有效果,但以在1%的維生素C溶液中切割效果最好。B處理比A處理效果略好,但僅比A降低2.72%,原因是在水中切割時(shí)減少了材料與空氣之間的暴露時(shí)間,減少了酶促反應(yīng)的發(fā)生[16],但在接種時(shí)外植體不可避免地又會(huì)接觸空氣,所以效果并不理想;C處理在接種到培養(yǎng)基2 d后,褐變指數(shù)能夠基本保持穩(wěn)定,原因考慮植物組織在遭到機(jī)械破壞時(shí),其體內(nèi)的多酚氧化酶會(huì)增多以保護(hù)自身,而維生素C并不能抑制多酚氧化酶活性[17],因此在接種后褐變指數(shù)快速上升,但是維生素C具有還原性,能將褐變產(chǎn)生的有色物質(zhì)鄰二醌還原成無(wú)色物質(zhì)鄰二酚[18],從而起到抑制褐變加劇的效果。

接種后進(jìn)行暗處理能有效防止褐化現(xiàn)象的發(fā)生[19]。余慧琳等[20]研究表明,適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)有利于減輕外植體的褐變,當(dāng)外植體暗培養(yǎng)1周后再轉(zhuǎn)入光下正常培養(yǎng),比接種后直接放在光下培養(yǎng)外植體發(fā)生褐變的程度要輕,并且發(fā)生褐變的時(shí)間會(huì)推遲。王寶寧等[21]對(duì)春蘭花梗外植體進(jìn)行暗培養(yǎng)10 d后完全褐化率相對(duì)較低,但在培養(yǎng)后期完全褐化率比暗培養(yǎng)5 d快速升高,這與本試驗(yàn)暗處理的結(jié)果相似,即相對(duì)較長(zhǎng)的暗培養(yǎng)時(shí)間有利于降低褐化率,其中以黑暗處理7 d(H3)褐變指數(shù)最低;雖然暗處理14 d后(H4)的褐變指數(shù)和H3的相同,但H4莖段愈傷表現(xiàn)顏色比H3顏色深;在正常情況下,帝王大麗花外植體培養(yǎng)到第2天褐變指數(shù)就達(dá)到82.50%,而通過黑暗處理,第7 天后褐變指數(shù)才達(dá)到83.33%,黑暗處理后褐化現(xiàn)象明顯延遲,但隨著時(shí)間增加褐化現(xiàn)象也隨即產(chǎn)生,說明黑暗處理只是在短時(shí)間內(nèi)抑制了褐化物質(zhì)的產(chǎn)生。暗培養(yǎng)對(duì)外植體褐化起到了一定的抑制作用,可能是外植體在黑暗中減少了酚類物質(zhì)的滲出,從而降低了褐變率[22-23],因?yàn)樵诜宇惢衔锖铣珊脱趸^程中,需要許多酶系統(tǒng)參與,其中一部分酶系統(tǒng)的活性是受光誘導(dǎo)的[24],因此在前期暗培養(yǎng)時(shí)褐變會(huì)受到一定程度的抑制。

低溫處理可在不同程度上降低植物材料的褐變率[25]。張衛(wèi)芳等[26]將核桃莖尖接種到培養(yǎng)基后,置于5 ℃冰箱中黑暗培養(yǎng)7 d后取出,置于 25 ℃無(wú)光照下培養(yǎng),褐化率有所降低;李煥秀等[27]將采集的蒼溪梨外植體進(jìn)行低溫預(yù)處理對(duì)降低褐變有一定作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明,無(wú)論是在取樣后對(duì)帝王大麗花枝條進(jìn)行低溫處理,還是對(duì)接種后的外植體進(jìn)行低溫處理,均可明顯降低褐變率,原因可能是低溫抑制了酚類化合物的合成,抑制了多酚氧化酶的活性,減少了酚類氧化,從而使褐變減輕[28]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),取樣時(shí)間、取樣位置、外植體切割環(huán)境以及接種前后材料的低溫和黑暗處理對(duì)帝王大麗花的褐變率均可產(chǎn)生不同影響,所采取的措施也一定程度上控制了褐變的發(fā)展,并獲得了部分不褐變的瓶苗,但是,探索更加有效的防止褐變的措施組合仍然很有必要,而且不同因素對(duì)褐變的影響機(jī)理以及各因素間的交互影響仍有待深入研究。此外,試驗(yàn)獲得的無(wú)菌瓶苗經(jīng)過后期繼代培養(yǎng),并未再次出現(xiàn)褐變情況,其中原因尚待繼續(xù)研究。