高秀娟, 張雅麗, 莊新榮, 張桂香

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 婦科, 河北 承德, 067000)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)是指子宮外任何部位出現(xiàn)包括子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細胞的子宮內(nèi)膜組織,屬于雌激素依賴性慢性炎癥性疾病,患者主要以痛經(jīng)、慢性盆腔痛和不孕為主要表現(xiàn)[1]。EMS是一種良性疾病,但具有向惡性腫瘤轉變的可能,并在生物學上表現(xiàn)出局部侵襲、轉移和抵抗細胞凋亡,其中子宮內(nèi)膜異位癥相關卵巢癌(EAOC)是EMS最常見的惡性病變[2-3]。EMS惡變?yōu)镋AOC的概率不足3.0%, 且占比不足卵巢癌的6.7%, 通常沒有明顯的臨床癥狀,患者確診時多已進入晚期,錯過了手術治療的最佳時機,5年生存率不足37%[4-5]。糖類抗原125(CA125)是臨床輔助診斷卵巢癌的標志物,但CA125對于卵巢癌早期病變的診斷效能較低[5]。

研究[6]顯示,盡管EAOC的發(fā)病機制仍不清楚,但許多因素可影響EAOC的發(fā)生,如基因突變、氧化應激、激素及炎癥免疫等。磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)是首個被發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因,又稱晚期腫瘤突變基因,在腫瘤細胞增殖、凋亡和遷移中發(fā)揮關鍵作用。作為染色質(zhì)重塑復合物SWI/WNF家族的成員, AT豐富結合域1A基因(ARID1A)屬于抑癌基因之一。作為生物鐘基因,晝夜運動輸出周期(CLOCK)是生物鐘的核心基因,可節(jié)律性地共同結合到E-box上調(diào)節(jié)多種基因的轉錄,其中包括腫瘤基因c-MYC[7-9]。近年來,有學者[10]研究PTEN與ARID1A在胰腺癌中的表達,或ARID1A與CLOCK在胃癌中的表達[11], 胰腺癌、胃癌及EAOC同屬于腺癌范疇,作者推測PTEN、ARID1A及CLOCK在EAOC的發(fā)生與進展中也扮演重要角色。本研究觀察EAOC患者PTEN、ARID1A、CLOCK蛋白及基因在卵巢癌組織的表達,并與未發(fā)生EAOC的單純EMS囊腫組織的相關指標進行比較,現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2016年3月—2020年3月本院收治的30例EAOC患者的臨床資料,并設為EAOC組,患者年齡27～42歲,平均(34.52±3.15)歲。另收集同期收治的30例未發(fā)生EAOC的單純EMS患者的臨床資料,并設為非EAOC組,患者年齡30～45歲,平均(37.25±3.23)歲。EAOC及EMS患者均行病變組織病理檢查,且均經(jīng)資深病理專家確診。2組患者的一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 具有可比性,見表1。所有患者簽署知情同意書。納入標準: (1) 首次診斷的EAOC患者,符合《卵巢惡性腫瘤診斷與治療指南(第4版)》[12]中EAOC的診斷標準,且經(jīng)超聲檢查、實驗室檢查、病理組織學檢查確診。① 單個卵巢中同時存在癌組織和異位內(nèi)膜; ② 二者組織學關系類似; ③ 排除轉移性的惡性腫瘤; ④ 顯微鏡下具有異位子宮內(nèi)膜向惡性組織轉化的形態(tài)學(圖1)。(2) 入院前半年內(nèi)未服用激素類藥物者。(3) 患者臨床資料完整,從采樣到PTEN、ARID1A及CLOCK檢測時間≤3個月。排除標準: ① 合并宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等其他惡性腫瘤患者; ② 合并肝炎、心肌炎或腎衰竭等疾病患者; ③ 合并凝血功能障礙患者; ④ 入組前已接受放化療等干預手段的EAOC患者。

表1 2組患者基線資料比較

A: 非EAOC患者子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)充盈,周圍伴纖維結締組織增生,可見炎癥細胞浸潤,紅細胞或含鐵血黃素的巨噬細胞散在分布; B: EAOC患者子宮內(nèi)膜腺體細胞異型,呈腺體上皮特征,周圍可見大量炎癥細胞及巨噬細胞浸潤。圖1 非EAOC和EAOC組織的病理表現(xiàn)(放大100倍)

1.2 PTEN、ARID1A和CLOCK蛋白表達檢測

取患者活檢或手術切除的病變組織樣本(EAOC組的癌組織、非EAOC組的囊腫組織),置入4%多聚甲醛中進行固定,制成石蠟切片,采用免疫組化法(試劑購自上海生工生物科技有限公司)檢測PTEN、ARID1A和CLOCK蛋白的表達,將PTEN、ARID1A和CLOCK單克隆抗體作為一抗進行孵育,利用DBA顯色試劑盒顯色。結果判定: 按著色細胞占視野的百分比進行評分,陽性細胞率<5%為0分, 5%～<25%為1分, 25%～<50%為2分, 50%～75%為3分, >75%為4分; 按著色強度分級進行評分,不著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。PTEN蛋白相對表達=著色細胞占視野的百分比(著色強度,結果分為蛋白陰性表達(-)為≤2分,蛋白弱陽性(+)為3～4分,蛋白中度陽性()為5～8分,蛋白強陽性()為9～12分。

1.3 PTEN、ARID1A、CLOCK基因檢測

將患者活檢或手術切除的病變組織(EAOC組的癌組織、非EAOC組的囊腫組織)經(jīng)液氮研磨,采用TRIzol試劑提取總RNA, 采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度與濃度,采用反轉錄試劑盒對總RNA進行逆轉錄,生成cDNA。檢測PTEN、ARID1A、CLOCK基因的表達水平,以GAPDH為內(nèi)參。所有反應均在基因擴增儀進行, PCR反應總體積20 μL: 10 μL 2×SYBR Gree Master Mix緩沖液,上游、下游引物各200 nmol/L, 1 μL cDNA模板; 擴增程序: 95 ℃預變性5 min, 95 ℃變性10 s, 60 ℃退火10 s, 72 ℃延伸10 s, 共45個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算PTEN、ARID1A、CLOCK基因的相對表達。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.4 質(zhì)量控制

嚴格按照中華人民共和國國務院令第717號《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》、《全國臨床檢驗操作規(guī)程》相關規(guī)定執(zhí)行; 嚴格按本院病理科制定的《人類正常及病變器官的制備、凍存、復蘇和鑒定操作指南》及《婦科組織免疫組化操作規(guī)程及操作流程》進行操作檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 非EAOC組與EAOC組病變組織PTEN、ARID1A和CLOCK蛋白陽性表達比較

與非EAOC組相比, EAOC組患者PTEN陽性比率、ARID1A陽性比率較低, CLOCK陽性比率較高,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.864、15.864、13.125,P<0.01)。見表3、圖2。

表3 非EAOC組與EAOC組病變組織PTEN、ARID1A和CLOCK蛋白陽性表達[n(%)]

A: 非EAOC囊腫組織PTEN蛋白; B: EAOC卵巢癌組織PTEN蛋白; C: 非EAOC囊腫組織ARID1A蛋白; D: EAOC卵巢癌組織ARID1A蛋白; E: 非EAOC囊腫組織CLOCK蛋白; F: EAOC卵巢癌組織CLOCK蛋白。圖2 非EAOC組與EAOC組病變組織PTEN、ARID1A、CLOCK蛋白染色圖(放大100倍)

2.2 非EAOC組與EAOC組病變組織PTEN、ARID1A和CLOCK的基因表達

與非EAOC組相比, EAOC組患者PTEN、ARID1A相對表達量較低, CLOCK相對表達量較高,差異有統(tǒng)計學意義(t=18.868、7.391、9.578,P<0.01)。見表4、見圖3。

表4 非EAOC組與EAOC組病變組織PTEN、ARID1A和CLOCK的基因表達

與非EAOC組比較, ?P<0.05。圖3 非EAOC和EAOC病變組織ARID1A和CLOCK基因表達

2.3 病變組織的PTEN、ARID1A及CLOCK基因與EAOC發(fā)生的回歸分析

將病變組織的PTEN、ARID1A及CLOCK納入作為自變量(均為連續(xù)變量),將EAOC發(fā)生情況作為因變量(1=發(fā)生, 0=未發(fā)生),經(jīng)Logistic回歸分析顯示,病變組織PTEN、ARID1A及CLOCK異常表達可能與EAOC發(fā)生有關, PTEN和ARID1A是EAOC發(fā)生的保護因子, CLOCK是促進EAOC發(fā)生的風險因子(OR>1,P<0.05)。見表5。

表5 PTEN、ARID1A及CLOCK與EAOC發(fā)生的回歸分析

2.4 病變組織PTEN、ARID1A及CLOCK基因單獨及聯(lián)合預測EAOC發(fā)生的價值

將EAOC發(fā)生作為因變量(1=發(fā)生, 0=未發(fā)生),將病變組織的PTEN、ARID1A及CLOCK表達作為自變量,繪制ROC曲線圖,當病變組織的PTEN、ARID1A及CLOCK的cut-off值分別取1.352、1.512、4.953時,提示EAOC發(fā)生風險較高, PTEN、ARID1A及CLOCK單獨及聯(lián)合預測EAOC發(fā)生的AUC分別為0.856、0.860、0.870、0.931。見表6、圖4。

表6 病變組織PTEN、ARID1A及CLOCK基因單獨及聯(lián)合預測EAOC的診斷價值

圖4 病變組織PTEN、ARID1A及CLOCK基因單獨及聯(lián)合預測EAOC的ROC曲線

3 討 論

研究[13]指出約2.5%的EMS患者可發(fā)展為EAOC。EAOC是指發(fā)生機制和組織學與EMS密切相關的一組特殊的病理類型,與病變存在一定的相似性。本研究結果顯示, EAOC和未發(fā)生EAOC的單純EMS病變組織均存在纖維結締組織增生、炎癥細胞浸潤及巨噬細胞,該結果進一步佐證EAOC是由EMS惡化的結果。研究[14-15]顯示EAOC可能與EMS存在遺傳相似性,具體表現(xiàn)為基因改變譜系相似。全基因組關聯(lián)研究[16]表明,基因標記增加EMS的相關風險,EAOC被認為是卵巢癌發(fā)病的直接前體。EAOC的增殖分化等病理進展過程受到多種基因的調(diào)節(jié),這些基因的突變、蛋白功能或表達改變均有可能參與腫瘤的進展[17-18]。

PTEN是首個被發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因,通過影響腫瘤細胞的生物學特征而發(fā)揮作用,如增殖、凋亡和遷移等。PTEN作為子宮內(nèi)膜的管家基因,在維持內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細胞代謝方面具有重要作用; 此外, PTEN具有蛋白磷酸酶活性,可負性調(diào)控細胞的轉移與浸潤,通過抑制依賴P13K激活的蛋白激酶B活性等機制加速誘導細胞死亡[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn),非EAOC子宮囊腫組織中PTEN蛋白和基因表達均顯著降低,誘導血管內(nèi)皮表達,促進異位的內(nèi)膜組織的微小血管生成,進而為異位子宮內(nèi)膜的成功種植和生長創(chuàng)造了有利條件。ARID1A具有改變?nèi)旧|(zhì)結構來達到調(diào)控靶基因表達的作用,在諸多惡病質(zhì)中呈低表達,這也提示ARID1A可能是一種重要的抑癌基因[21]。ARID1A的基因突變存在于乳腺癌、胃癌及膀胱癌等多種腫瘤中,其缺失突變對于預測早期卵巢透明細胞癌發(fā)生具有一定的價值[22]。

本研究采用檢測EAOC與未發(fā)生EAOC的單純EMS病變組織的ARID1A 蛋白和基因,結果顯示,與非EAOC相比, EAOC癌組織的ARID1A蛋白和基因表達均顯著降低。研究[23-24]顯示EAOC發(fā)生后, ARID1A發(fā)生移碼、突變,而ARID1A的移碼、突變又導致機體蛋白表達缺失,造成惡性循環(huán),導致EAOC發(fā)生并加速病情進展,但本研究EAOC癌組織的ARID1A蛋白和基因表達顯著降低是否與ARID1A基因突變有關,仍需要進一步研究證實。生物鐘是一種調(diào)節(jié)生物過程和日常行為(即生物規(guī)律)的進化保守的分子計時機制,以24 h為周期的晝夜節(jié)律是生物鐘在機體內(nèi)最為常見的表現(xiàn)形式。晝夜節(jié)律受到多種節(jié)律基因的調(diào)節(jié),這些基因的正常表達可保證機體每日在同一時間發(fā)生的行為具有規(guī)律性和重復性,以保證機體在正確的時間引發(fā)適當?shù)纳砘蛐袨榉磻９?jié)律紊亂會導致多種婦產(chǎn)科疾病的發(fā)生,如月經(jīng)周期紊亂、EMS等[25]。近年來,有關生物節(jié)律與腫瘤發(fā)生的研究也越來越多,多種節(jié)律基因參與調(diào)節(jié)胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等惡病質(zhì)的發(fā)生[26-27]。CLOCK是生物鐘的核心基因,可節(jié)律性地共同結合到E-box上調(diào)節(jié)多種基因的轉錄,其中包括腫瘤基因c-MYC[28]。早期研究[29]發(fā)現(xiàn)CLOCK在卵巢癌細胞中表達減少,并且其表達水平可能與生存率、腫瘤分期分型有關,提示節(jié)律基因參與了卵巢癌的發(fā)病,并對卵巢癌的治療提供一定依據(jù),但是節(jié)律基因是否參與EAOC的發(fā)病及其調(diào)節(jié)機制仍未可知。本研究結果顯示,與非EAOC組相比,EAOC組癌組織的CLOCK蛋白和基因相對表達均較高,究其原因可能是CLOCK可調(diào)控組織細胞增殖、生長代謝、凋亡的節(jié)律性,當CLOCK發(fā)生突變后,生物節(jié)律體系被打破,導致EAOC發(fā)生。本研究Logistic回歸分析顯示,病變組織的PTEN、ARID1A及CLOCK異常表達可能與EAOC發(fā)生有關, PTEN和ARID1A是EAOC發(fā)生的保護因子, CLOCK是促進EAOC發(fā)生的風險因子(OR>1,P<0.05)。ROC曲線證實,病變組織的PTEN、ARID1A及CLOCK的表達對預測EAOC發(fā)生具有一定的價值,但聯(lián)合檢測預測EAOC發(fā)生的效能最高。

本研究存在的不足: ① 作為EAOC潛在腫瘤標記物, PTEN與ARID1A受到廣泛關注,是否存在其他抑癌基因與ARID1A協(xié)同突變來促進EAOC的發(fā)生、調(diào)節(jié)腫瘤細胞轉移,PTEN是否與ARID1A協(xié)同調(diào)節(jié)EAOC的發(fā)生發(fā)展及其具體調(diào)節(jié)的分子機制仍需進行深入研究。② 本研究檢測術后的切除的病變標本PTEN、ARID1A及CLOCK表達,其變化與臨床病理參數(shù)相關,但三者的改變是癌變的原因、癌變的結果還是貫穿癌變的全過程,仍需結合EAOC細胞模型進一步確認。

綜上所述,未發(fā)生EAOC的單純EMS及EAOC病變組織的PTEN、ARID1A及CLOCK表達存在顯著差異, PTEN、ARID1A及CLOCK可能參與了EAOC發(fā)生。PTEN和ARID1A是EAOC發(fā)生的保護因子, CLOCK是促進EAOC發(fā)生的風險因子。檢測PTEN、ARID1A及CLOCK有助于臨床診斷EAOC, 且三者聯(lián)合檢測的診斷價值最高。