武海博 梁 燕 沈 雷 范 展 傅國(guó)惠

膠質(zhì)瘤是一種病因不詳、損傷性極大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。手術(shù)治療是目前臨床醫(yī)治惡性膠質(zhì)瘤的主要方式，但腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞嚴(yán)重浸潤(rùn)周圍正常腦組織，手術(shù)切除因需要確保神經(jīng)功能和必要的生理功能而無法徹底清除腫瘤；患者術(shù)后改善效果不佳，存活率較低且極易復(fù)發(fā)［2-3］。由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有失控性增殖、侵襲性生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡速度減慢等惡性細(xì)胞行為，也給膠質(zhì)瘤的治療帶來巨大困難［4-5］。因此，尋找新的治療藥物防治膠質(zhì)瘤，具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值。單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物，包括單胺氧化酶A （monoamine oxidase A，MAO-A）和單胺氧化酶B（monoamine oxidase B，MAO-B）兩種同工酶，能夠催化多種胺類（5-羥色胺、組胺、多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素）氧化脫氨，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)失活［6］。研究顯示，MAO-B 抑制劑對(duì)神經(jīng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕桶柎暮ＤY）具有潛在的治療潛力［7］。在人膠質(zhì)瘤中也檢測(cè)到MAO-B 活性顯著性增加，與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，腫瘤來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞中MAO-B 的含量明顯增高，其過表達(dá)可能與惡性膠質(zhì)瘤有關(guān)［8-9］。因此，抑制MAO-B 將成為治療膠質(zhì)瘤的新靶點(diǎn)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，新型查爾酮衍生物TM-5 可選擇性抑制MAO-B 活性，其IC50為（0.022±0.01）μM（SI = 2618）［10］。但TM-5 是否可在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抗腫瘤活性尚不清楚，本研究以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87 為研究對(duì)象，觀察TM-5 對(duì)U87 細(xì)胞存活的影響及可能作用機(jī)制，為惡性膠質(zhì)瘤的新型藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87，源于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，上皮樣細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海生化所。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 DMEM/F12 培養(yǎng)基（貨號(hào)：11320033，規(guī)格：500 mL，美國(guó)Gibco 公司）；胎牛血清（貨號(hào)：BCSE-FBS01-500 mL，規(guī)格：500 mL，南京生航生物技術(shù)公司）；二甲基亞砜（貨號(hào)：D5879，規(guī)格：100 mL，美國(guó)Sigma 公司）；噻唑藍(lán)［3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT］試劑、SYBR熒光定量試劑盒（貨號(hào)：C0009S、D7260-5mL，規(guī)格：500次、5 mL，上海碧云天生物技術(shù)公司）；異硫氰酸熒光素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡試劑盒（貨號(hào)：70-AP101-100，規(guī)格：100T，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：K1622，規(guī)格：100 rxns，美國(guó)Thermo Scientific 公司）；兔源Bcl-2相關(guān)蛋白X（Bcl-2 associated protein X，Bax，貨號(hào)：ab53154，免疫親和純化，濃度：1 mg/mL，規(guī)格：100 μg）、Beclin-1（貨號(hào)：ab53154，蛋白A 純化，濃度：0.634 mg/mL，規(guī)格：40 μg）、P62（貨號(hào)：ab264313，免疫親和純化，濃度：1 mg/mL，規(guī)格：100 μg）、切割后半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3，貨號(hào)：ab2302，免疫親和純化，濃度：0.5 mg/mL，規(guī)格：50 μg）、β-tubin（貨號(hào)：ab179513，蛋白A 純化，濃度：2.151 mg/mL，規(guī)格：40 μg）、鼠源自噬相關(guān)蛋白1 輕鏈-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ，貨號(hào)：ab53154，蛋白A 純化，濃度：0.43 mg/mL，規(guī)格：100 μg）蛋白一抗（美國(guó)Abcam 公司）；山羊源抗兔/鼠蛋白二抗（貨號(hào)：CYZC04041、CYZ-C04042，規(guī)格：1 mg，武漢艾美捷科技公司）。流式細(xì)胞儀（型號(hào)：NovoCyte 2060R，杭州艾森生物有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)：Iq5，美國(guó)BIO-RAD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 TM-5 的合成及配制 將3 mmol 5，6-二甲氧基茚酮和9 mmoL 50%氫氧化鉀加入10 mL 乙醇中，室溫?cái)嚢?0 min，再加入3.3 mmol 對(duì)二甲胺基苯甲醛，繼續(xù)室溫?cái)嚢?2 h，經(jīng)薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)，將反應(yīng)液倒入碎冰中，攪拌下調(diào)pH = 6，4℃下靜置過夜，次日，抽濾，濾餅用乙醇重結(jié)晶，4℃下靜置過夜，抽濾后將濾餅烘干，即得黃色目標(biāo)化合物TM-5，其合成路線見圖1。TM-5 分子式為 （Z）-2-［4-（二甲胺基）苯亞甲基］-5，6-二甲氧基-2，3-二氫-1H-茚1 酮［（Z）-2-（4-（Dimethylamino）benzylidene）-5，6-dimethoxy-2，3-dihydro-1H-inden-1-one （TM-5）］，淺黃色固體，熔點(diǎn)為117.8~119.1°C，收率為83.1%，純度為98.6%。以二甲基亞砜為溶劑，再用pH 7.4 緩沖液梯度稀釋，濾膜過濾除菌后備用。

圖1 化合物TM-5的合成圖示

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 預(yù)先配制含10% 胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素和1×105U/L 青霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)基），用適量培養(yǎng)基懸浮U87 細(xì)胞，設(shè)置培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)繁殖至80%~90% 匯合度時(shí)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將U87 細(xì)胞以1×104個(gè)/mL 密度接種于96 孔板，100 μL/孔，每組3 個(gè)復(fù)孔，隨機(jī)分為7 組：對(duì)照組不做處理，溶劑組待細(xì)胞貼壁后加入二甲基亞砜，5、10、25、50、100 μmoL/L TM-5 組待細(xì)胞貼壁后分別加入5、10、25、50、100 μmoL/L TM-5處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，再加入0.5 mg/mL MTT 試劑每孔50 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)后加入二甲基亞砜 ，每孔100 μL，避光下放置搖床15 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔的吸光度值（OD 492 nm），細(xì)胞存活率=測(cè)試組OD 值/對(duì)照組OD 值×100%，篩選細(xì)胞存活率＞50%的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將U87 細(xì)胞以1.0×105個(gè)/毫升接種于6 孔板，每孔1.5 mL，每組3 個(gè)復(fù)孔，按各組處理后培養(yǎng)24 h 收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/毫升，緩沖液洗滌兩次，加入預(yù)冷1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC 和PI 染液，避光下孵育10 min，再混入1×結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，右上象限（晚期凋亡細(xì)胞）與右下象限（早期凋亡細(xì)胞）細(xì)胞率之和為細(xì)胞凋亡率，再計(jì)算相對(duì)細(xì)胞凋亡率=測(cè)試組細(xì)胞凋亡率/對(duì)照組細(xì)胞凋亡率×100%。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 水平 將U87 細(xì)胞以1.0×105個(gè)/毫升接種于6 孔板，每孔1.5 mL，每組3 個(gè)復(fù)孔，按各組處理后培養(yǎng)24 h 收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 模板。構(gòu)建qRT-PCR 反應(yīng)體系：EvaGreen 2X qPCR MasterMix 5 μL、Forward Primer（10μM） 0.3 μL、Reverse Primer（10 μM） 0.3 μL、Nuclease-free H2O 3.4 μL、模板cDNA 1 μL，其中引物系列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72℃延伸30 s，72 ℃總延伸10 min，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平，相對(duì)表達(dá)水平=測(cè)試組Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平/對(duì)照組Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平×100%。

表1 基因引物序列

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 將U87 細(xì)胞以1.0×105個(gè)/毫升接種于6 孔板，每孔1.5 mL，每組3 個(gè)復(fù)孔，按各組處理后培養(yǎng)24 h 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，各組取40 μg 變性蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳分離，再電轉(zhuǎn)至 PVDF膜，室溫封閉1 h，添加蛋白一抗（稀釋比1：1 000） 4℃過夜，加山羊源抗兔/鼠蛋白二抗室溫孵育1 h，ECL 顯色發(fā)光檢測(cè)后顯影，應(yīng)用Image J 軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，計(jì)算Bax、LC3、Beclin 1、P62 和cleaved-caspase-3 蛋白條帶灰度值與β-tubin 比值，表示目的蛋白表達(dá)量，蛋白相對(duì)表達(dá)量=測(cè)試組目的蛋白表達(dá)量/對(duì)照組目的蛋白表達(dá)量×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 和GraphPad Prism5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TM-5 對(duì)U87 細(xì)胞活力的影響 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，用10、25、50、100 μmoL/L TM-5 處理后U87 細(xì)胞存活率降低（P<0.05）。見表2。選取細(xì)胞存活率＞50% 的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，即5、10、25 μmoL/L TM-5 組。

表2 各組U87細(xì)胞存活率比較（）

表2 各組U87細(xì)胞存活率比較（）

注：與對(duì)照組比較，①P < 0.05；與溶劑組比較，②P < 0.05；與5 μmoL/L TM-5組比較，③P < 0.05；與10 μmoL/L TM-5組比較，④P < 0.05；與25 μmoL/L TM-5組比較，⑤P < 0.05；與50 μmoL/L TM-5組比較，⑥P < 0.05。

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2.2 TM-5 對(duì)U87 細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，10、25 μmoL/L TM-5 組U87 細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。見表3、圖2。

表3 各組U87細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞凋亡率比較（）

表3 各組U87細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞凋亡率比較（）

注：與對(duì)照組比較，①P < 0.05；與溶劑組比較，②P < 0.05；與5 μmoL/L TM-5組比較，③P < 0.05；與10 μmoL/L TM-5組比較，④P < 0.05。

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圖2 TM-5對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響（流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)）

2.3 TM-5 對(duì)U87 細(xì)胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，5、10、25 μmoL/L TM-5 組U87 細(xì)胞中促凋亡基因Bax mRNA 相對(duì)表達(dá)水平升高，抑凋亡基因Bcl-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表4。

表4 各組U87細(xì)胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較（，%）

表4 各組U87細(xì)胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較（，%）

注：Bax為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因相關(guān)X蛋白；Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因；與對(duì)照組比較，①P < 0.05；與溶劑組比較，②P < 0.05；與5 μmoL/L TM-5組比較，③P < 0.05；與10 μmoL/L TM-5組比較，④P < 0.05。

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2.4 TM-5 對(duì)U87 細(xì)胞中自噬及凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 與對(duì)照組相比，5、10、25 μmoL/L TM-5組U87 細(xì)胞中Beclin-1 和cleaved caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，P62 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）；10、25 μmoL/L TM-5 組LC3-Ⅱ和Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05）。見表5、圖3。

表5 各組U87細(xì)胞中自噬及凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，%）

表5 各組U87細(xì)胞中自噬及凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，%）

注：Beclin-1為BH3域自噬蛋白；LC3-Ⅱ?yàn)槲⒐芟嚓P(guān)蛋白輕鏈3 Ⅱ；P62為自噬選擇性底物；Bax為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因相關(guān)X蛋白；cleaved caspase-3為切割后天冬氨酸蛋白水解酶3；與對(duì)照組比較，①P < 0.05；與溶劑組比較，②P < 0.05；與5 μmoL/L TM-5組比較，③P < 0.05；與10 μmoL/L TM-5組比較，④P < 0.05。

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圖3 TM-5對(duì)U87細(xì)胞中自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（Western blot檢測(cè)）

3 討論

膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度快、破壞性強(qiáng)，急需開發(fā)新型藥物幫助改善患者預(yù)后［11］。MAO 抑制劑是臨床常用的抗抑郁藥物，通過抑制MAO 的降解，提高突觸有效介質(zhì)濃度，發(fā)揮抗抑郁作用［12］。邵根寶等［13］研究發(fā)現(xiàn)，MAO 抑制劑可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞分化，這將有助于提高膠質(zhì)瘤的治療效果；Marconi 等［14］發(fā)現(xiàn)，新型MAO-B 抑制劑—Cmp5 和Cmp3，可促進(jìn)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，并降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力，從而在高級(jí)別膠質(zhì)瘤發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí)，Irwin 等［15］通過近紅外熒光光學(xué)成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)靜脈注射5 mg/kg MAO抑制劑是靶向腦腫瘤的最佳劑量，可安全用于膠質(zhì)瘤的治療。上述研究表明，MAO 抑制劑在膠質(zhì)瘤的治療中具有一定潛力。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，合成新型MAO-B 抑制劑TM-5，在阿爾茨海默病中有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，但是否也可抑制膠質(zhì)瘤尚不清楚［10］。本研究檢測(cè)了人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87 在TM-5 處理后細(xì)胞增殖和凋亡的變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，10、25、50、100 μmoL/L TM-5 組細(xì)胞存活率降低，10、25 μmoL/L TM-5 組相對(duì)細(xì)胞凋亡率升高，提示MAO-B 抑制劑TM-5 對(duì)U87 細(xì)胞具有抑制作用。Inaba-Hasegawa 等［16］研究結(jié)果顯示，MAO-B 可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中神經(jīng)保護(hù)基因表達(dá)，敲低其表達(dá)可調(diào)控Bcl-2、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平。由此提出猜測(cè)，TM-5可能通過調(diào)控Bcl-2 表達(dá)，在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用。本研究中，與對(duì)照組比較，5、10、25 μmoL/L TM-5 組U87細(xì)胞中促凋亡基因Bax mRNA 相對(duì)表達(dá)水平升高，抑凋亡基因Bcl-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平降低，表明TM-5可能通過調(diào)控Bax、Bcl-2 基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

自噬是細(xì)胞完成細(xì)胞器更新和物質(zhì)代謝的重要過程，對(duì)細(xì)胞凋亡有雙向調(diào)節(jié)作用，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下，適度的自噬可促進(jìn)細(xì)胞存活，但過量自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡［17-18］。促凋亡信號(hào)因子刺激下細(xì)胞啟動(dòng)自噬，LC3-I 轉(zhuǎn)化為 LC3-II 并轉(zhuǎn)移至自噬體膜上，偶聯(lián)P62蛋白參與自噬體的形成［19-20］。抑凋亡蛋白Bcl-2 也是重要的自噬調(diào)節(jié)因子，可結(jié)合自噬標(biāo)識(shí)蛋白Beclin 1 并抑制其誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬［21］。本研究中Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TM-5 可上調(diào)Beclin 1、LC3-Ⅱ表達(dá)，下調(diào)P62，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬；同時(shí)，TM-5 處理后U87 細(xì)胞中Bax 和凋亡執(zhí)行蛋白cleaved caspase-3 表達(dá)也升高，說明TM-5 可能通過調(diào)控上述蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)U87 細(xì)胞自噬和凋亡，從而降低U87 細(xì)胞存活率。

綜上所述，TM-5 可抑制膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞存活，其作用機(jī)制可能是上調(diào)Beclin-1、LC3-Ⅱ、Bax 和cleaved caspase-3，下調(diào)Bcl-2 和P62 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡。本研究提出新型化合物TM-5 有望成為治療人膠質(zhì)瘤的候選藥物，但其是否存在其他作用途徑還有待深入分析。