劉永龍,李 泰,崔汝菲,耿 貴,於麗華,王宇光

(黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院,哈爾濱 150080)

0 引言

甜菜是兩年生草本植物,在世界范圍內(nèi)被廣泛地種植,是世界兩大糖料作物之一,具有很高的經(jīng)濟價值,其加工產(chǎn)品市場潛力很大[1]。隨著市場的不斷擴大,生產(chǎn)不斷集約化導(dǎo)致土傳病害不斷加劇,造成了一定的經(jīng)濟損失,甜菜土傳病害主要有立枯病、褐斑病、根腐病等,其中甜菜根腐病是由多種真菌或細菌侵染引起的塊根腐爛病的總稱[2-4]。全國甜菜栽植區(qū)每年遭受此病害不同程度的危害,特別是種植甜菜多年的區(qū)域發(fā)病更嚴重。此病害通常可導(dǎo)致甜菜減產(chǎn)10%～40%,使含糖率大幅降低,甚至會造成絕產(chǎn)[4]。王文君等[5]研究提及甜菜根腐病首次被發(fā)現(xiàn)是在美國,之后諸多國家先后發(fā)現(xiàn)了此病的存在,包括中國、印度等。曲文章等[6]研究發(fā)現(xiàn),由于此疾病,美國每年損失約5%的甜菜產(chǎn)量。可以看出,甜菜根腐病是一種影響所有品種甜菜的疾病,其危害性較大,可導(dǎo)致種植甜菜經(jīng)濟利益降低。

甜菜根腐病通常出現(xiàn)于甜菜塊根膨大期之后,致病菌是由諸多真菌或細菌組成,已發(fā)現(xiàn)的此類真菌與細菌包括:Fusariumspp.(鐮刀菌)[7]、Rhizoctoniaspp.(絲核菌)[8]、Sclerotiumspp.(小核菌)[9]、莖點屬真菌(Phomaspp.)[10]、Aphanomycesspp.(絲囊菌)[11]、Bacillusspp.(黃濕腐桿菌)[12]、Pythiumaphanidermatum(瓜果腐霉)、Pythiummonospermum(簡囊腐霉)和Pythiumspp.(腐霉屬)[13]。病原菌種類多而復(fù)雜,且受環(huán)境因素影響較大,一般癥狀可分為以下3種:(1)干腐,又稱作根莖腐爛病,發(fā)病期會從葉柄基部形成暗褐色病斑,葉片出現(xiàn)萎蔫下垂;(2)尾腐,即根尾腐爛,通常出現(xiàn)于直根上,黑色腐爛產(chǎn)生于根尾,再慢慢朝上蔓延,病部維管束呈黃褐色,當遇到潮濕或多雨環(huán)境,病部見水漬狀軟腐現(xiàn)象,散發(fā)酸臭味,容易拔起,但大多會將爛根部留于土壤內(nèi),屬于一類細菌病害;(3)黑腐則是發(fā)病從根頭向下侵染,病組織變黑,一般腐爛發(fā)生在后期,先從塊根一側(cè)表皮侵染,出現(xiàn)褐色小斑點,逐漸擴大成為凹陷斑,然后向四周和根部擴散,有的從根冠部侵染,導(dǎo)致腐爛,感染由根部表面開始,慢慢發(fā)展至根體內(nèi)部,導(dǎo)致塊根內(nèi)部組織發(fā)生腐爛,當處于干燥環(huán)境下,病部常會失水產(chǎn)生空洞,塊根外皮呈皺縮狀態(tài),出現(xiàn)裂縫。諸多病原菌皆可引發(fā)甜菜根腐病,國內(nèi)外長期以來,關(guān)于甜菜病害的發(fā)生、分析和預(yù)防的報告很多,但由于對甜菜根腐病的病原體缺乏了解,這會導(dǎo)致對病害原因的錯誤評估,延誤病害的及時防治,從而造成經(jīng)濟損失。本試驗通過對甜菜塊根膨大期根腐病病害進行調(diào)查,并對致病病原菌進行分析,旨在初步研究甜菜致病病原菌類型[14],為甜菜根腐病防治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試樣品

2022年9月于黑龍江省哈爾濱市黑龍江大學呼蘭校區(qū)試驗基地田間采集具有明顯發(fā)病癥狀的甜菜塊根,進行分離和培養(yǎng)。此外,還收集了健康的甜菜塊根。

1.1.2 培養(yǎng)基

使用PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)碳水化合物培養(yǎng)基(含有20 g葡萄糖,20 g瓊脂,250 g馬鈴薯)。過濾后的馬鈴薯汁與葡萄糖和瓊脂混合,然后將濾液與蒸餾水混合,稀釋為1 L的總量,121 ℃滅菌,培養(yǎng)基溫度降低到50～60 ℃,轉(zhuǎn)移到經(jīng)過消毒的培養(yǎng)皿中完成培養(yǎng)基的制備分離和培養(yǎng)病原真菌。

1.1.3 儀器設(shè)備

PCR擴增儀、離心機、光學顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱和超凈工作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離與培養(yǎng)

用自來水清洗受感染的甜菜塊根,于塊根段病健組織相交部位采樣,切成5 mm×5 mm的小塊,將病組織小塊浸入75%酒精溶液30 s后,用無菌鑷子取出,滅菌水洗滌3遍,滅菌濾紙將留存水分吸除干凈,移至PDA培養(yǎng)基平板上,各平板放置的病組織數(shù)量皆為3塊,用密封膜來封閉培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿倒置在設(shè)定為恒溫(25 ℃)的培養(yǎng)箱中,定期觀察,并觀察菌落的生長情況,有菌絲長出時,于無菌超凈工作臺上,用無菌接種針對菌落邊緣進行挑取,轉(zhuǎn)移到1個新鮮的培養(yǎng)基平板上進行純化培養(yǎng),建立與之前相同的培養(yǎng)條件,再使用平板稀釋法進行單孢分離,將分離的真菌培養(yǎng),觀察是否有單個菌落的生長[15]。4 ℃存放,待用。

1.2.2 病原菌致病性的測定

根據(jù)科赫法則進行致病性測試。選擇健康的甜菜塊根,在流水下清洗,并向接種部位添加75%的酒精(按體積分數(shù))。當酒精揮發(fā)時,用穿孔法沖打甜菜塊根,并將菌絲體側(cè)覆蓋在待接種的甜菜塊根上。作為對照,接種無菌PDA培養(yǎng)基塊。每種真菌設(shè)3次重復(fù),在25 ℃黑暗中培養(yǎng),監(jiān)測接種菌餅甜菜塊根觀察發(fā)病情況。再次從病斑區(qū)提取致病菌培養(yǎng)。如果在形態(tài)學比較方面與原始接種菌株相匹配,則可以得出結(jié)論與致病菌屬于同一物種。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學鑒定

對致病菌的菌落的顏色,形狀等進行觀察,選擇菌絲用于創(chuàng)建致病顯微鏡載玻片,并使用光學顯微鏡檢查菌絲分生孢子和分生孢子的大小、顏色和形狀,分生孢子梗的形態(tài)特征及厚垣孢子的有無,完成病原微生物的分類鑒定[16-17]。

1.2.4 病原菌的分子生物學鑒定

當培養(yǎng)基被純化后的病原菌幾乎完全覆蓋時,將菌絲體刮入研缽中,將其放入液氮中,然后快速研磨。使用快速提取DNA的試劑盒(上海生物技術(shù)的產(chǎn)品),提取菌株的基因組并將其用作PCR擴增步驟的模板。使用熱裂解法提取DNA,在-20 ℃保存。使用真菌通用引物ITSl(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTYATYGATATGC-3′)對致病菌基因進行PCR擴增。擴增步驟如下:在94 ℃下預(yù)變性4 min、94 ℃下變性45 s、55 ℃退火、72 ℃下延伸1 min,共 35 個循環(huán);72 ℃環(huán)境下10 min修復(fù)延伸。25 μL 的PCR 反應(yīng)體系:Template基因組 DNA (20～25 ng/μL) 0.5 μL、10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL、dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL、酶0.2 μL、引物 ITS1(10 μmol/L)、ITS4 (10 μmol/L),加 ddH2O至25 μL。PCR擴增產(chǎn)物的測序由上海生工公司使用放置在瓊脂糖凝膠(8 g/L)中的4～5μL PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分析。

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹:通過將分離的ITS序列上傳到NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)來創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹,根據(jù)同源性對待檢病菌的生物類型進行初步診斷,進行了在線BLAST核酸序列比對。連接了NCBI數(shù)據(jù)庫中的屬和外群的序列。利用MEGA-X構(gòu)建進化樹,比較確認致病菌的生物學種。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離、純化與回接再分離

田間甜菜塊根部腐爛的皮層從根的外部擴散到內(nèi)部,使塊根變成棕色或黑褐色并出現(xiàn)腐爛。最終,整個根部腐爛(圖1)。

圖1 田間根腐病危害的甜菜塊根Fig.1 Sugar beet taproots damaged by root rot in the field

從發(fā)病甜菜塊根中分離得到3種真菌分離株,為了確定這3種分離株的致病性,將這些分離株的純化菌株接種到健康的甜菜塊根部。然后將接種的塊根在遮光的培養(yǎng)箱(25 ℃)中以恒溫培養(yǎng)15 d。致病性測定結(jié)果顯示,從患病甜菜塊根中分離純化的1種菌株具有致病性,可導(dǎo)致甜菜塊根的根腐病(圖2-A、B、C)。另外2種真菌被確定不是甜菜根腐爛的原因,與對照組沒有差異(圖2-D)。根據(jù)科赫法則,對病變組織實施再次組織分離培養(yǎng),分離純化所得菌株在形態(tài)上相符于原菌株。通過這種方式初步可以確定在測試樣品中引起根腐病的病原體為鐮刀菌,下一步進行分子生物學鑒定。

圖2 分離病原菌回接健康甜菜塊根發(fā)病情況Fig.2 Inoculation of isolated pathogens on healthy sugar beet taproots

2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上,菌株BY-1發(fā)育得較快,菌落是灰白色的。從顯微鏡下看,分生孢子呈鐮刀狀。小孢子的大小為(16.28～24.28)μm×(5.52～9.4)μm,形狀為卵形或橢圓形。大孢子的大小為(33.21～49.72)μm×(7.75～9.21) μm;大多數(shù)有0～3個隔膜;它們分散在氣生菌絲上,分生孢子梗隔膜頂端有孢子脫落痕跡,有厚垣孢子,呈現(xiàn)圓形(圖3-A、B)。

圖3 病原菌菌株BY-1在PDA培養(yǎng)上的菌落形態(tài)特征(A)、菌絲和分生孢子形態(tài)(B)Fig.3 Morphological characteristics of colonies(A),mycelium and conidia morphology(B) of pathogenic strain BY-1 on PDA culture

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

對于純化菌株rDNA-ITS,經(jīng)由真菌通用引物ITSl/ITS4實施PCR 擴增處理,并測序,BY-1菌株的ITS區(qū)序列長為542 bp(圖4)。序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫GenBanK,獲得基因序列登錄號為 BALST,序列比對結(jié)果表明,菌株BY-1為鐮孢屬腐皮鐮孢菌(圖5)。

圖4 菌株P(guān)CR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Electrophoresis of 1% agarose gel of strain PCR products

圖5 菌株BY-1序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain BY-1 sequence

3 討論

甜菜根腐病是由土源性病原菌引起的根腐病,致病菌可以通過菌絲體或菌核在土壤或植物病害殘留物中存活長達2～3年。該病害可通過患病甜菜(塊根或幼苗)、降雨、土壤作為載體進行傳播。大多資料表明,當?shù)氐臍庀髼l件和土壤環(huán)境因素與甜菜根腐病的流行有著密不可分的關(guān)系。在老的生產(chǎn)區(qū),土壤為粘土,排水不良,連作以及地勢低洼的區(qū)域,再加上高溫、高濕環(huán)境,會加劇甜菜根腐病的發(fā)生。

鐮孢真菌屬于一類主要的植物病原真菌[18],其在較大程度上影響到多種植物的生長,是全球糧食生產(chǎn)體系中一類關(guān)鍵性的致病因素。病發(fā)嚴重時導(dǎo)致作物產(chǎn)量驟減[19],不同的地理位置、氣候、土壤等條件又導(dǎo)致鐮孢菌的組成各不相同[20-21]。本研究的試驗地位于黑龍江省的半干旱地區(qū),推測區(qū)域氣候的影響是導(dǎo)致該病害在甜菜塊根膨大期后侵染的原因。塊根膨大期處于高溫、高濕的生長環(huán)境中導(dǎo)致根腐病容易發(fā)生,國外品種在我國,尤其在黑龍江省,受到當?shù)貧夂虻挠绊懗l(fā)生根腐病。在早期調(diào)查中,像ITS、tef1等方法最常被利用[22]。如高園園等[23]根據(jù)ITS和tef1基因序列的分子鑒定,建立了系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)是引起山東大蒜根腐病的主要病原真菌。劉文杰等[24]以rDNA-ITS序列為基礎(chǔ),進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,確定腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和匍枝根霉菌(Rhizopusstolonifer)是引起山東青島膠州南瓜果實腐爛的病原菌。在本試驗中,通過形態(tài)學觀察、ITS和tef1基因序列的分子鑒定以及建立基因系統(tǒng)發(fā)育樹,可以將分離出的BY-1菌株鑒定為腐皮鐮孢菌,為該病原菌甜菜的防治提供了理論依據(jù)。除此之外,腐皮鐮孢菌的可侵染植物種類較多[25],不但能造成甜菜的根腐病,還可以侵染其他農(nóng)產(chǎn)品,例如桃子[26]、咖啡[27]、香蕉[28]等,造成其果實腐爛,還可以造成茶葉、刺桐等的葉斑病和枯萎病[29]。本試驗鑒定所得BY-1菌株的具體侵染面積需要通過更為深入的研究來明確,此研究能為更深入地研究此病害的防控管理給予指導(dǎo)。

4 結(jié)論

綜上所述,黑龍江大學呼蘭校區(qū)根腐病甜菜中分離出菌株BY-1。致病性測試和形態(tài)學觀察得出的初步結(jié)論為鐮孢菌是導(dǎo)致甜菜根腐爛的病原體。經(jīng)進一步鑒定病原體,并在驗證科赫氏法則后,運用分子生物學技術(shù)PCR擴增致病菌基因,建立系統(tǒng)發(fā)育樹后確定該致病菌為腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)。