王月嬋，姚佳琦，黃 夏，李艷杰，祝儒剛，陳 罡*

（1.遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧白石砬子森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，遼寧 丹東 118201；3.遼寧大學(xué)輕工產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；4.新賓滿族自治縣國有林業(yè)總場，遼寧 新賓 113213）

軟棗獼猴桃Actinidia arguta為獼猴桃科、獼猴桃屬大型落葉藤本植物，廣泛分布于中國東北、華北、西北等地區(qū)，其中吉林和遼寧東部山區(qū)軟棗獼猴桃資源最為豐富，同時(shí)在朝鮮半島、日本和俄羅斯亦有分布[1]。軟棗獼猴桃果實(shí)富含多糖、黃酮、三萜類、生物堿、VC、微量元素、膳食纖維等多種活性成分，因其酸甜多汁的口感和一定的保健功效，越來越受到人們的關(guān)注。

黃酮類化合物是一類植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種植物的根、莖、葉、花及果實(shí)中，不僅數(shù)量種類繁多，而且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣[2]。黃酮類化合物因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有許多重要的生理、生化和藥理作用，是許多中草藥的有效成分，具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥、降血糖、改善神經(jīng)性疾病等功效。近年來黃酮類化合物研究進(jìn)程加快，對其構(gòu)效關(guān)系研究不斷深入，為其在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。已有研究表明，植物黃酮類化合物具有抗氧化作用，可通過抑制自由基生成、清除自由基或抑制脂質(zhì)過氧化實(shí)現(xiàn)此效用[3]。此外，目前α-葡萄糖苷酶抑制劑主要來源于微生物、天然產(chǎn)物和化學(xué)合成，阿卡波糖是一種廣泛應(yīng)用的合成型α-葡萄糖苷酶抑制劑，能有效降低餐后高血糖，對胰高血糖素樣肽-1 水平以及胰島素敏感性能產(chǎn)生積極影響[4]。然而，此類抑制劑可能導(dǎo)致胃腸功能問題，對患有腸道基礎(chǔ)疾病和孕婦等特定人群存在局限性。因此，研究具有體外抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性的天然產(chǎn)物具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過測定軟棗獼猴桃黃酮提取物對DPPH 自由基、羥基自由基的清除作用和對α-葡萄糖苷酶抑制作用，明確其體外抗氧化和降血糖的效用，為今后軟棗獼猴桃黃酮類化合物的開發(fā)與利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為種植在遼寧省林業(yè)研究院軟棗獼猴桃示范基地的‘龍成2 號’果實(shí)。待果實(shí)成熟后置于有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室用于軟棗獼猴桃黃酮提取。

無水乙醇、無水碳酸鈉，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸、硫酸亞鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、α-葡萄糖苷酶、磷酸鹽緩沖液，購于北京酷來博科技有限公司；水楊酸，購于天津市北辰方正試劑廠；過氧化氫，購于沈陽市東興試劑廠；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），購于南京都萊生物技術(shù)有限公司；阿卡波糖，購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；智能勻漿機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；KQ-500DE 超聲波清洗機(jī)（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；循環(huán)水式真空泵（予華儀器責(zé)任有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（艾本德儀器有限公司）；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 軟棗獼猴桃黃酮提取及純化

采用超聲輔助乙醇浸提法對軟棗獼猴桃果實(shí)中的總黃酮進(jìn)行提取和純化[5]。

1.3.2 DPPH 自由基清除能力的測定

將軟棗獼猴桃黃酮提取液配制成0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-15 個(gè)梯度，以抗壞血酸（VC）作為陽性對照，參照Chen 等[6]的方法測定DPPH 自由基清除能力，按照公式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：A1為樣品組的吸光度值；A2為對照組的吸光度值；A0為空白組的吸光度值。

1.3.3 羥基自由基清除能力的測定

將軟棗獼猴桃黃酮提取液分別配制5 個(gè)梯度0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1，以抗壞血酸（VC）作為陽性對照，采用Winterbourn 等[7]的方法測定羥基自由基的清除能力。羥基自由基清除計(jì)算公式同式（1）。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

將軟棗獼猴桃黃酮提取液用0.1 mol·L-1、pH6.8磷酸緩沖溶液（PBS），配制2 mg·mL-1、4 mg·mL-1、6 mg·mL-1、8 mg·mL-1、10 mg·mL-1的黃酮樣品液，參考Zhang 等[8]的方法進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。取0.1 mol·L-1、pH6.8 的磷酸鹽緩沖液120 μL、0.2 U·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液20 μL、樣品液20 μL 于96 孔板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)10 min，再加入20 μL 2.5 mmol·L-1pNPG 溶液，繼續(xù)在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)20 min，加入0.2 mol·L-1的Na2CO3溶液80 μL 以終止反應(yīng)。以阿卡波糖為陽性對照，使用酶標(biāo)儀在波長405 nm 處測定吸光度，按照以下公式計(jì)算軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A1為樣品組的吸光度值；A2為樣品空白組吸光度值；A3為對照組的吸光度值；A0為空白組的吸光度值。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)試驗(yàn)

設(shè)定α-葡萄糖苷酶濃度為0.2 U·mL-1，設(shè)置pNPG 溶液濃度分別為1.0 mmol·L-1、1.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1，樣品溶液質(zhì)量濃度分別為0 mg·mL-1、2 mg·mL-1、4 mg·mL-1，按照1.3.4 的方法測定405 nm 吸光度值，計(jì)算反應(yīng)速率。為判斷軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制類型，采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法繪制曲線，將pNPG 濃度的倒數(shù)（1/S）作為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）作為縱坐標(biāo)，分析其抑制特性[9]。

設(shè)定pNPG 溶液濃度為2.5 mmol·L-1，設(shè)置α-葡萄糖苷酶濃度分別為0.1 U·mL-1、0.15 U·mL-1、0.2 U·mL-1、0.25 U·mL-1，樣品溶液質(zhì)量濃度分別為0 mg·mL-1、2 mg·mL-1、4 mg·mL-1，按照1.3.4 的方法測定405 nm 吸光度值，計(jì)算反應(yīng)速率。以α-葡萄糖苷酶濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，確定軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用的可逆性。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃黃酮體外抗氧化活性

2.1.1 軟棗獼猴桃黃酮對DPPH 自由基清除能力

由圖1 可知，軟棗獼猴桃黃酮和VC 均對DPPH 自由基具有一定的清除作用，且清除率與軟棗獼猴桃黃酮和VC 的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，軟棗獼猴桃黃酮對DPPH 自由基清除率為80.5%±2.21%，VC 對DPPH 自由基清除率為91.7% ± 1.45%。在0.2～1.0 mg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC 和軟棗獼猴桃黃酮的IC50分別為0.18 mg·mL-1和0.42mg·mL-1，說明軟棗獼猴桃黃酮對DPPH 自由基的清除作用稍差于VC。當(dāng)VC 質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg·mL-1后清除率不再明顯增加；而隨著軟棗獼猴桃黃酮質(zhì)量濃度的增加，對DPPH 自由基的清除能力逐漸接近VC。

圖1 軟棗獼猴桃黃酮對DPPH自由基的清除作用

2.1.2 軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基清除能力

由圖2 可知，軟棗獼猴桃黃酮與VC 同樣具有清除羥自由基的作用，且清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，也表現(xiàn)出明顯的量-效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基清除率為74.1% ± 2.78% ，VC 對羥基自由基清除率為93.9% ± 1.86%。在0.2～1.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，VC 和軟棗獼猴桃黃酮的IC50分別為0.39 mg·mL-1和0.59 mg·mL-1，與清除DPPH 自由基的能力相似，軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基的清除作用稍差于VC。VC 對羥基自由基的清除率呈現(xiàn)先增加后逐漸平穩(wěn)的趨勢，而軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基清除率隨質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)不斷上升趨勢。

圖2 軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基的清除作用

2.2 軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結(jié)果

由圖3 可知，以阿卡波糖作為陽性對照，軟棗獼猴桃黃酮和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率隨質(zhì)量濃度增加而提高，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1時(shí)抑制率達(dá)到最高，即黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制率為73.2%±1.69%，阿卡波糖為80.4%±1.75%。黃酮的IC50為1.87 mg·mL-1，阿卡波糖IC50為0.43 mg·mL-1，說明阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用優(yōu)于軟棗獼猴桃黃酮。

圖3 軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶活性影響

2.2.2 α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)試驗(yàn)

軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制的雙倒數(shù)曲線見圖4。

圖4 軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制的雙倒數(shù)曲線

3 種質(zhì)量濃度軟棗獼猴桃黃酮抑制線性方程分別為：y=5.3167x+0.5585、y=3.6178x+0.5494、y=2.7387x+0.4718，R2分別為0.997 7、0.989 3、0.994 2。在不同軟棗獼猴桃黃酮質(zhì)量濃度下，各曲線在縱軸上的截距基本保持不變，而斜率隨黃酮質(zhì)量濃度的增加而增加。這一特征表明，Km 值（米氏常數(shù)）隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增加而增加，而Vmax 值（最大反應(yīng)速率）保持不變，說明軟棗獼猴桃黃酮占據(jù)了α-葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)，表現(xiàn)出競爭性抑制特性。

判定軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用可逆性如圖5 所示，3 種質(zhì)量濃度依次增加，各質(zhì)量濃度的軟棗獼猴桃黃酮抑制作用直線均經(jīng)過原點(diǎn)，且斜率逐漸減小。由此推斷，軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有可逆性特征。若為不可逆抑制類型，隨著黃酮質(zhì)量濃度的變化，斜率應(yīng)保持恒定。因此，可以得出結(jié)論，軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。

圖5 軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用可逆性

3 結(jié) 論

本研究通過提取軟棗獼猴桃果實(shí)黃酮，測定其對DPPH 自由基清除能力、羥基自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性，探討軟棗獼猴桃黃酮的體外抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結(jié)果表明，軟棗獼猴桃黃酮對DPPH 自由基和羥基自由基的清除率均在70%以上，具有較好的抗氧化活性。雖然稍差于VC，但進(jìn)一步增加軟棗獼猴桃黃酮質(zhì)量濃度，可以提高對自由基的清除率。軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶IC50為1.87 mg·mL-1，在2～10 mg·mL-1，抑制活性呈現(xiàn)一定的質(zhì)量濃度依賴性。抑制動力學(xué)試驗(yàn)可推斷，軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制為競爭性抑制，且抑制作用是可逆的，這一結(jié)論與趙坤[10]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果將為軟棗獼猴桃黃酮類化合物在抗氧化和降脂降糖功能的深入研究提供理論依據(jù)。