張衛(wèi)敏，賈莉，趙魯亞，李麗平，李偉男

1.菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

龍膽苦苷（gentiopicroside，GPS）是中藥龍膽的活性成分，具有突出的抗腫瘤藥理作用，可通過MAPK/Akt 途徑抑制宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移，是宮頸癌治療的潛力藥物［1］。但是，GPS 分子極性大，易被體內(nèi)生物活性酶水解，在體內(nèi)消除較快，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大鼠體內(nèi)半衰期僅為0.64 h，因此導(dǎo)致藥效發(fā)揮不良［2］。

脂質(zhì)體（liposome，L）是將磷脂雙分子定向排列而成的囊泡，它以微粒形式包載水溶性藥物，是一種改善水溶性藥物體內(nèi)分布的常用技術(shù)［3］。脂質(zhì)體具有高效、低毒、靶向性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且作為一種成熟的藥物遞送載體已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、抗感染、疫苗等多種制劑的制備［4］。目前已有采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化載龍膽苦苷脂質(zhì)體的相關(guān)報(bào)道，雖然正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，但精度低、可考察因素與水平數(shù)較少且不可預(yù)測(cè)最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案［5］。而Plackett-Burman（PBD）具有考察因素多、水平少的特點(diǎn)，可全面篩選顯著影響的因子。同時(shí)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法（CCD-RSM）能進(jìn)行交互實(shí)驗(yàn)，多水平預(yù)測(cè)最優(yōu)方案與結(jié)果［6］。PBD 與CCD-RSM 兩種設(shè)計(jì)方法聯(lián)合指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)可獲得精度更高、可靠性強(qiáng)的優(yōu)化結(jié)果。較小粒徑的脂質(zhì)體能延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，對(duì)藥效發(fā)揮具有積極作用，同時(shí)包封率（EE）也是影響脂質(zhì)體療效的關(guān)鍵因素。本研究以粒徑（size）、包封率為指標(biāo)考察載龍膽苦苷脂質(zhì)體（L/GPS）的制劑學(xué)特征，采用PBD 聯(lián)用CCD-RSM 對(duì)制備條件進(jìn)行篩選，能夠獲得包封率高、粒徑尺寸合適的L/GPS。

1 材料與儀器

龍膽苦苷原料藥（上海默克，CAS：0831-76-9，純度98%）；龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品（上?？婆d商貿(mào)有限公司）；大豆磷脂（天津富宇精細(xì)化工有限公司）；膽固醇（上海默克）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢塞維爾科技公司）；其他試劑均為分析純。

XPR106DUHQ/AC 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UV2450 型紫外分光光度計(jì)（日本島津科技公司）；EXER1050 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（華宸儀器公司）；GHH-Q8000-P25 型高壓均質(zhì)機(jī)（上海順儀儀器公司）；LC-10N-50A 型冷凍干燥機(jī)（力辰科技有限公司）；Mastersizer 3000 型粒徑儀（英國馬爾文儀器公司）。

2 方法

2.1 GPS 體外分析方法建立

精密稱取GPS 標(biāo)準(zhǔn)品，配制出質(zhì)量濃度在5.0μg/mL～50.0 μg/mL 系列濃度5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。根據(jù)文獻(xiàn)［7］報(bào)道，采用紫外分光光度法（UV-Vis），在空白脂質(zhì)體無吸收的270 nm 下測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度（A）。以GPS 的濃度（C）為橫坐標(biāo)（X），A 為縱坐標(biāo)（Y）建立線性標(biāo)準(zhǔn)。分別配制5.0、25.0、50.0 μg/mL 的GPS 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣5 次，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，采用同樣標(biāo)準(zhǔn)品濃度測(cè)定加樣回收率［8］。

2.2 L/GPS 脂質(zhì)體的制備方法

采用制備載水溶性藥物脂質(zhì)體的逆向蒸發(fā)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［9］。稱取相應(yīng)比例的大豆磷脂與膽固醇，加入6 mL 乙醚超聲溶解。量取3 mL 溶解有不同質(zhì)量GPS 的磷酸鹽緩沖液，緩慢滴入含有脂質(zhì)體原料的乙醚溶液中，在一定溫度條件下恒溫超聲10 min，得到W/O 型白色乳狀液體。放入茄形瓶后減壓除去有機(jī)溶劑，濃縮得到濃稠膠狀液體，加入5 mL PBS水化一定時(shí)間后，減壓蒸發(fā)除水，得到淡黃色液體，高壓均質(zhì)后用0.22 μm 濾器過濾后冷凍干燥，即得。

2.3 L/GPS 脂質(zhì)體EE 的測(cè)定

稱取一定質(zhì)量L/GPS 凍干粉末溶解于pH 7.4 的PBS，放置于已活化的透析袋（10 000 Mw）中，并將該裝置放入500 mL 燒杯中，控制漏槽條件，在搖床中保持100 rpm 轉(zhuǎn)速透析2 h，取透析介質(zhì)用上述體外分析方法測(cè)定A，計(jì)算游離GPS 含量（w2）。稱取同質(zhì)量L/GPS 凍干粉末溶解放入甲醇破乳后稀釋，于270 nm 測(cè)定A，計(jì)算總GPS 含量（w1）［10］。按以下公式計(jì)算EE：

2.4 L/GPS 脂質(zhì)體粒徑的測(cè)定

取不同條件下制備得到的L/GPS 脂質(zhì)體各0.5 mL，分別用蒸餾水稀釋10 倍，吸取稀釋液1.5 mL放入粒徑樣品池中，粒徑儀預(yù)熱半小時(shí)后測(cè)定對(duì)應(yīng)方法制備的脂質(zhì)體粒徑。

2.5 PBD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定主要影響因素5 個(gè)，分別為有機(jī)相與水相體積比（A）、水化時(shí)間（B）、載藥溫度（C）、磷脂與膽固醇比（D）、藥物與磷脂比（E）。采用Design-Expert 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理，兩水平（+1，-1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因變量為size 與EE，設(shè)計(jì)安排見表1。

表1 PBD實(shí)驗(yàn)因素與水平

2.6 CCD-RSM 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

采用逆向蒸發(fā)法制備L/GPS，PBD 實(shí)驗(yàn)篩選出三種影響脂質(zhì)體質(zhì)量最顯著的因素，即載藥溫度（A）、藥脂比（B）、膽脂比（C）。載藥溫度為有機(jī)相與含藥溶液混合制備W/O 乳液時(shí)的溫度，以25 ℃至45 ℃為該因素的水平范圍；藥脂比為GPS與磷脂的質(zhì)量比，范圍0.01 至0.05；膽脂比是膽固醇與磷脂的質(zhì)量比，范圍0.3 至0.7。分別以size（Y1）與EE（Y2）為響應(yīng)參數(shù)，各水平下因素值（α=1.682）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用Design-Expert 11 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)安排見表2。

表2 CCD-RSM實(shí)驗(yàn)安排

3 結(jié)果

3.1 GPS 體外分析方法建立結(jié)果

吸光度與GPS 濃度線性關(guān)系的回歸結(jié)果見圖1，表明GPS 在5.0 μg/mL～50.0 μg/mL 濃度范圍內(nèi)符合線性關(guān)系要求。以50.0 μg/mL、25.0 μg/mL、5.0 μg/mL 三種濃度測(cè)定的日內(nèi)精密度RSD 分別為0.71%、0.86%和1.52%（n=5），日間精密度RSD值分別為1.45%、1.62%和1.79%，RSD 均小于2.0%，顯示此種方法的日間和日內(nèi)精密度較好。此種測(cè)定方法的加樣回收率結(jié)果分別為98.21%、98.37%和100.7%（n=3），可認(rèn)為載體材料對(duì)GPS 含量測(cè)定無影響［11］。

圖1 GPS濃度與吸光度線性回歸關(guān)系圖

3.2 PBD 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。方差分析結(jié)果中模型P 值顯著，顯示Y1、Y2擬合度較高，誤差較小。C、D 因素對(duì)粒徑（Y1）影響顯著，因素E 對(duì)包封率（Y2）影響顯著，因此選擇該三種因素進(jìn)行下一步處方與工藝的篩選。載藥溫度（A）與膽脂比（C）影響脂質(zhì)體的形成與穩(wěn)定性，并非越高越好，并對(duì)粒徑大小極為重要，同時(shí)藥脂比（B）過高可由于包封能力的限制而降低包封率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合得到Y(jié)1、Y2方程如下。

表3 PBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析

3.3 CCD-RSM 優(yōu)化處方結(jié)果

3.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果模擬擬合對(duì)A、B 和C 三種響應(yīng)因素對(duì)size、EE 的影響情況進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。并以Y1、Y2為因變量，A、B、C 為自變量，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)構(gòu)建二次多項(xiàng)式回歸方程擬合。方程如下。

表5 CCD-RSM實(shí)驗(yàn)結(jié)果

方差分析結(jié)果見表6。依據(jù)軟件擬合的Y1、Y2方程中方差分析結(jié)果顯示兩種擬合模型均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。評(píng)價(jià)指標(biāo)Y1所屬方程中A2與C2對(duì)Y1有顯著影響，C2影響極顯著；在評(píng)價(jià)指標(biāo)Y2中B 與A2對(duì)Y2有顯著影響，并且A2影響極為顯著。綜合表中數(shù)據(jù)確定，控制size 的因素影響大小為：C>A>B，控制EE 的因素影響順序?yàn)椋篈>B>C。分析原因可能為，膽脂比（C）作為影響脂質(zhì)體成膜的關(guān)鍵因素，過高會(huì)導(dǎo)致size 過大，過低則難以形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，因此成為影響size 的最顯著因素。載藥溫度（A）是藥物在水化過程的溫度，溫度升高藥物溶解度增加，進(jìn)而提高EE，同時(shí)溫度過高易導(dǎo)致脂質(zhì)體泄漏，EE 降低，因此是影響EE 的最顯著因素［12］。

表6 方差分析結(jié)果

3.3.2 三維效應(yīng)面圖與最優(yōu)處方預(yù)測(cè)以size（Y1）、EE（Y2）作為L/GPS 質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)，擬合方程繪制得到的三維效應(yīng)面圖，如圖2。根據(jù)擬合軟件分析其結(jié)構(gòu)，得到最優(yōu)制備條件為：載藥溫度（A）為34 ℃、藥脂比（B）為0.05、膽脂比（C）為0.52。

圖2 A、B、C對(duì)size與EE影響的三維效應(yīng)面圖：（a）A與B對(duì)size的影響；（b）A與C對(duì)size的影響；（c）B與C對(duì)size的影響；（d）A與B對(duì)EE的影響；（e）A與C對(duì)EE的影響；（f）B與C對(duì)EE的影響

3.4 最優(yōu)處方工藝驗(yàn)證結(jié)果

將PBD 聯(lián)用CCD-RSM 篩選而得的最優(yōu)方案進(jìn)行可靠性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證。制備等量的3 批L/GPS 脂質(zhì)體，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果所得脂質(zhì)體size 為（92.44±1.80）nm、EE 為（87.70±2.60）%。該L/GPS 脂質(zhì)體size 較小，EE 值較高，表明經(jīng)過篩選后得到的最優(yōu)工藝條件制備方案可靠、可行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示良好的制劑學(xué)特性。

4 討論

GPS 是一種天然的環(huán)烯醚萜苷，具有突出的抗腫瘤藥理作用。但是，GPS 分子極性大，易被體內(nèi)生物活性酶水解，在體內(nèi)消除較快，使其廣泛應(yīng)用受到限制，而脂質(zhì)體可以加強(qiáng)GPS 在腫瘤部位的富集，解決龍膽苦苷水溶性差和生物利用度低的問題，能延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，提高抗癌效果，降低藥物的毒副作用，對(duì)藥效發(fā)揮具有積極作用［13］。

本研究采用的逆向蒸發(fā)法是制備水溶性藥物脂質(zhì)體的常用手段，所得到的載藥脂質(zhì)體包封率普遍較高［14］。該制備技術(shù)簡單，設(shè)備需求水平較低，因此適合工業(yè)化生產(chǎn)。正交試驗(yàn)適合水平數(shù)不高的實(shí)驗(yàn)，使用普通統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)次數(shù)安排局限，無法模擬出最優(yōu)條件下的未做實(shí)驗(yàn)結(jié)果［15］。運(yùn)用PBD 聯(lián)合CCD-RSM 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案可全面認(rèn)識(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的趨勢(shì)與內(nèi)涵，非線性擬合方式可在各因素下全面進(jìn)行科學(xué)考察，所得最優(yōu)工藝參數(shù)更可靠。該方法優(yōu)勢(shì)在于，在可靠因素范圍內(nèi)對(duì)未做實(shí)驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)，簡化因素的篩選方案［16］。在脂質(zhì)體制備中，載藥溫度需要控制在合適范圍內(nèi)，過低導(dǎo)致脂質(zhì)膜流動(dòng)性低，難以包封藥物，過高則脂質(zhì)體整體穩(wěn)定性下降，藥物泄漏導(dǎo)致EE 降低［17］。膽脂比過高或過低也會(huì)影響脂質(zhì)體的形成與最終質(zhì)量，從而影響EE 與size 的大?。?8］。本研究運(yùn)用PBD 聯(lián)用CCD-RSM 優(yōu)化篩選最優(yōu)因素制備的GPS脂質(zhì)體，EE 值較高，所得size 值較低，為納米級(jí)尺寸，為進(jìn)一步制備龍膽苦苷脂質(zhì)體奠定了基礎(chǔ)。