趙樂 楊挲挲 陳志會 查江杰 李夢真 程銘 韓鵬飛

缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)又被稱之為腦梗死, 主要由顱內(nèi)動脈狹窄和大腦中動脈閉塞引起［1］, 是一種因大腦供血供氧不足而引起的疾病。每年,腦血管破裂、缺血或中風(fēng)導(dǎo)致全球超過4000 萬人殘疾［2］, IS 是當(dāng)前導(dǎo)致成年人癱瘓或者殘疾的一個主要誘因［3］。微小RNA(miRNA)是一類基因序列高度保守的內(nèi)源性核苷酸非編碼RNA, 其與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)發(fā)生特異性結(jié)合之后, 會對蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)生一定的抑制作用, 甚至還會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生降解, 在轉(zhuǎn)錄后對蛋白質(zhì)的表達起到一定的調(diào)節(jié)控制作用, 這對于基因表達的調(diào)節(jié)控制是至關(guān)重要的［4］。microRNA-27a 在調(diào)節(jié)多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起作用, 在肺癌、乳腺癌和膀胱癌等腫瘤細胞中的表達水平顯著上調(diào)［5-8］, 調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而microRNA-27a 在IS 中的相關(guān)研究成果還不是很多。本研究通過測定microRNA-27a 在IS 患者和健康對照者外周血中的差異表達, 分析外周血中microRNA-27a的相對表達量與NIHSS 評分是否具有相關(guān)性以及對IS的診斷效能, 旨在為IS 探索新型生物標(biāo)志物及潛在的治療靶點。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2021 年9 月～2022 年7 月在牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為IS 的90 例患者作為IS 組, 根據(jù)NIHSS 評分不同分為輕度組(0～4 分)、中度組(5～13 分)和重度組(14～42 分), 每組30 例；選擇同期體檢中心45 例健康體檢者為對照組。IS 組中男58 例, 女32 例；平均年齡(60.40±5.76)歲。對照組中男27 例, 女18 例；平均年齡(59.56±4.68)歲。IS 組和對照組一般資料比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。本研究所有受試者均知曉研究目的、主要內(nèi)容和具體方法等, 并簽訂知情同意書；本研究獲得牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。IS 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《各類腦血管疾病診斷要點(1995 年版)》中明確的IS 診斷標(biāo)準(zhǔn), 且根據(jù)臨床資料和磁共振成像(MRI)首次診斷為IS；②年齡45～70 歲；③簽訂知情同意書。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡45～70 歲；②既往無IS 或短暫性腦缺血(TIA)、無急性冠狀動脈綜合征等心血管疾病的同期體檢中心體檢的健康人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腦卒中或腦外傷既往史者；②短暫性腦缺血發(fā)作；③出血性腦卒中和腦腫瘤患者；④肺纖維化、內(nèi)分泌代謝疾病、免疫或炎癥性疾病、慢性心血管、肝腎功能損傷者。

1. 2 方法

1. 2. 1 主要試劑 三氯甲烷、異丙醇和無水乙醇均由國藥集團化學(xué)試劑公司提供, TRIpure Total RNA Extraction Reagent、EntiLink? 1st Strand cDNA Synthesis Kit 和EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix試劑盒購自ELK Biotechnology。

1. 2. 2 RNA 提取 量取體積為500 μl 的全血置于體積規(guī)格為15 ml 的離心管中, 之后加入10 倍體積的紅細胞裂解液, 充分混勻, 常溫避光10 min。之后在常溫條件下對300 g 的混合液進行10 min 的離心處理, 棄掉上清液, 之后再重復(fù)操作1 次。利用磷酸緩沖液(PBS)對細胞液進行重懸, 之后在常溫條件下對300 g 的混合液進行10 min 的離心處理, 棄掉上清液, 使用體積為100 μl的 PBS 對細胞再次進行重懸, 加入體積為1 ml 的TRIpure 溶液, 充分混勻, 常溫避光5 min, 加入體積為250 μl 的三氯甲烷溶液, 緩慢搖晃直至混合均勻, 在冰塊上靜置5 min。在溫度為4℃的條件下對10000 g 的混合溶液進行10 min 的離心處理。之后在超凈工作臺上抽取體積為500 μl 的上清液, 將其轉(zhuǎn)移到1.5 ml 的EP 管中, 然后加入在溫度為4℃的條件下經(jīng)過預(yù)冷處理的500 μl 的異丙醇, 緩慢搖晃直至混合均勻, 置于溫度為-20℃的條件下靜置15 min。在溫度為4℃的條件下對10000 g 的混合溶液進行10 min 的離心處理, 然后去掉上清液, 加入1 ml 在溫度為4℃的條件下經(jīng)過預(yù)冷處理的75%乙醇, 緩慢顛倒搖晃多次之后, 使用緩沖液清洗RNA 沉淀, 在溫度為4℃的條件下對10000 g的混合溶液進行5 min 的離心處理, 棄掉上清液后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上進行干燥處理, 幾分鐘后待乙醇完全揮發(fā), 加入體積為100 μl 的RNase-Free Water, 使RNA得到充分溶解。

1. 2. 3 第一鏈cDNA 合成 第一鏈cDNA 的合成借助于EntiLink? 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒完成,在冰上完成反應(yīng)溶液的配制工作后, 之后轉(zhuǎn)移到溫度為70℃的PCR 儀上反應(yīng)5 min, 再迅速放到冰塊上靜置2 min；在冰上完成反應(yīng)溶液的配制工作后, 之后轉(zhuǎn)移到溫度為42℃的PCR 儀上反應(yīng)60 min, 之后轉(zhuǎn)移到溫度為85℃的PCR 儀上反應(yīng)5 min, 最后置于溫度為4℃的條件下保存。

1. 2. 4 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR 是在Life technologies公司的QuantStudio 6 Flex System PCR儀上完成, 每個樣品都準(zhǔn)備3 個復(fù)孔, 借助于EnTurbo?SYBR Green PCR SuperMix 試劑盒完成, 本研究以H-U6作為內(nèi)參基因, 運用2-ΔΔCT法分析每個樣品中目的基因相對表達量。擴增條件設(shè)定為：預(yù)變性95℃, 30 s,循環(huán)(40 次)95℃, 10 s →58℃, 30 s →72℃, 30 s, 采用儀器默認(rèn)的熔解曲線來分析程序。各基因的引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

1. 3 觀察指標(biāo) 對比IS 組與對照組外周血microRNA-27a 相對表達量, IS 組不同病情嚴(yán)重程度患者外周血microRNA-27a 相對表達量；分析IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達量與NIHSS 評分的相關(guān)性, microRNA-27a 對IS 的診斷效能。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t 檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗；采用Pearson 相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析；運用GraphPad Prism 8 軟件繪制ROC 曲線, 評估m(xù)icroRNA-27a對IS 的診斷效能。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 IS 組與對照組外周血microRNA-27a 相對表達量對比 IS 組外周血microRNA-27a 相對表達量為(0.77±0.54), 顯著低于對照組的(1.76±1.26), 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。見圖1。

圖1 兩組外周血microRNA-27a 相對表達量對比

2. 2 IS 組不同病情嚴(yán)重程度患者外周血microRNA-27a相對表達量對比 輕度組患者外周血microRNA-27a相對表達量為(1.08±0.66), 中度組為(0.75±0.27), 重度組為(0.48±0.45)。輕度組患者外周血microRNA-27a相對表達量高于中度組、重度組, 中度組高于重度組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 輕、中、重度組外周血microRNA-27a 相對表達量對比

2. 3 IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達量與NIHSS 評分的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)性分析顯示：IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達量與NIHSS 評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.54, P＜0.01)。見圖3。

圖3 IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達量與NIHSS 評分的相關(guān)性分析

2. 4 microRNA-27a 對IS 的診斷效能分析 將IS 作為狀態(tài)變量, 將microRNA-27a 作為檢驗變量, 結(jié)果顯示：microRNA-27a 的AUC 為0.818, 截斷值為0.965,特異度為75.60%, 靈敏度為76.70%。見圖4。

圖4 microRNA-27a 對IS 診斷效能的ROC 曲線

3 討論

IS 是發(fā)展中國家和發(fā)達國家致殘和死亡的第二大原因, 自2010 年以來, 每年約有550 萬人死亡, 預(yù)計到2030 年將增加24.9%, 而且50%的幸存者患有慢性殘疾, 同時IS 的發(fā)病率也正在增加, 全球≥65 歲人口的增長速度快于所有其他年齡組, 此外, 腦卒中患病風(fēng)險正在向較年輕人群轉(zhuǎn)移, 特別是在低收入和中等收入國家［9］, 這給衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來了巨大的財政負(fù)擔(dān)。目前, 診斷IS 主要依靠的是腦影像學(xué)檢查和典型臨床癥狀, 但是約50%的IS 在影像學(xué)診斷中缺乏特異性, 而且影像學(xué)檢查會對患者的身體造成一定的損傷, 其安全性低于分子生物學(xué)檢查［10］, 此外, 還尚無單獨診斷IS 的高效且特異的血液學(xué)生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床［11-13］。然而, 藥物和手術(shù)治療對IS 的有益效果有限, IS 的主要治療方法是立即恢復(fù)血液供應(yīng), 但這可能會加劇腦缺血再灌注損傷 (IRI) 引起的腦損傷［14］, 雖然重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)一直是挽救缺血組織的中流砥柱, 但由于治療窗口窄、經(jīng)濟支出高和出血相關(guān)并發(fā)癥的局限性, 只有少數(shù)IS 患者能夠真正從中受益［15］。因此, 探索IS 的新型生物標(biāo)志物至關(guān)重要, 旨在為IS 的治療提供新的方向。

microRNA-27a 位于人類19 號染色體［16］, 具有相對穩(wěn)定性、特異性和可重復(fù)性的特性［17］, 所以是IS 比較有前途的生物標(biāo)志物, 比蛋白更適合用于疾病的診斷。目前, 國內(nèi)外學(xué)者對microRNA-27a 的研究大多數(shù)都是圍繞惡性腫瘤疾病開展的, 在心腦血管疾病及IS 相關(guān)危險因素疾病中意義的研究也比較多, 而對于IS 的相關(guān)研究相對較少, 且大多數(shù)研究者采用的都是動物模型(MCAO 模型)和體外細胞模型氧葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)模型對IS 進行研究, 在IS患者外周血中的研究幾乎還處于空白階段。本研究結(jié)果顯示, 運用實時熒光定量PCR 測定IS 患者和健康者外周血microRNA-27a 的表達水平, IS 組外周血microRNA-27a 相對表達量為(0.77±0.54), 顯著低于對照組的(1.76±1.26), 差異具有有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。表明, IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達量低, 這與Li 等［18］、Dai 等［19］和Liu 等［20］的研究結(jié)果一致。IS 組根據(jù)NIHSS 評分不同分為輕度組、中度組、重度組, 輕度組患者外周血microRNA-27a 相對表達量為(1.08±0.66), 中度組為(0.75±0.27), 重度組為(0.48±0.45)。輕度組患者外周血microRNA-27a 相對表達量高于中度組、重度組, 中度組高于重度組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Pearson 相關(guān)性分析顯示：IS患者外周血microRNA-27a 相對表達量與NIHSS 評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.54, P＜0.01)。表明, IS 患者外周血中microRNA-27a 表達水平有助于判斷疾病的嚴(yán)重程度, IS 患者的病情越嚴(yán)重, 外周血中microRNA-27a 表達水平越低。繪制ROC 曲線來評估IS 患者外周血中microRNA-27a 的診斷效能, 以此來判斷microRNA-27a作為診斷IS 的生物標(biāo)志物的潛力, 結(jié)果顯示,microRNA-27a 的AUC 為0.818, 截斷值為0.965, 靈敏度為76.70%, 特異度為75.60%, 證明microRNA-27a 對IS 的診斷效能尚可, 外周血microRNA-27a 有望成為診斷IS 的新型生物標(biāo)志物。

microRNA 作為腦卒中未來的靶向治療手段, 其療效優(yōu)于傳統(tǒng)的治療方法, 靶向基因治療的潛力不僅在神經(jīng)保護誘導(dǎo)方面更先進, 而且在更安全無毒的靶向治療方面也更先進［4］。然而, 目前對外周血microRNA-27a 在IS 中的研究僅處于初步探索階段, 對其在IS 中的保護或損傷機制還尚未可知。Cai 等［21］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在IS 體外細胞模型中, microRNA-27a 通過靶向FOXO1 來抑制IRI, 所以外周血microRNA-27a在IS 中調(diào)控的靶基因和完整的靶向軸還需要未來大量的臨床樣本和實驗研究來驗證, 以期為IS 的治療提供新的思路。部分蛋白標(biāo)志物與IS 的脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)等存在相關(guān)性, 對IS 進行早期輔助診斷和預(yù)后評估等方面具有重要意義。在以往的研究中, 對于microRNA 和蛋白標(biāo)志物聯(lián)合檢測的文獻還比較少, 因此, 探尋在IS 中與外周血microRNA-27a 表達水平具有相關(guān)性的蛋白標(biāo)志物, 并且與其進行聯(lián)合檢測或可提高對IS 的診斷效能。

綜上所述, microRNA-27a 與IS 的發(fā)生有關(guān), IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達量低于健康者；外周血microRNA-27a 相對表達量有助于判斷IS 患者的病情嚴(yán)重程度, 且對IS 具有一定的診斷價值。所以,microRNA-27a 在作為IS 的血液學(xué)生物標(biāo)志物和有效的治療手段方面具有巨大潛力。