田長城，陶志杰，李 晶，滿 云，趙大慶

（1.蚌埠學院食品與生物工程學院，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學院生命科學學院，安徽 蚌埠 233030）

益生元的概念最早由Gibson和Roberfroid提出，即一類不被人體直接吸收，但能有效刺激腸道內(nèi)雙歧桿菌增殖低聚糖，特別是果寡糖[1]。隨著研究的不斷深入，許多新穎的具有益生功效的低聚糖陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如菊粉[2]、人乳低聚糖[3]、低聚半乳糖[4]等。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)一些植物多糖經(jīng)腸道中碳水化合物酶協(xié)同水解，形成的多糖片段可以優(yōu)先被腸道中的有益菌利用，同樣表現(xiàn)出顯著的益生元特征[5]。

陳皮是蕓香科橘（Citrus reticulateBlanco）的成熟果皮經(jīng)傳統(tǒng)貯藏和晾曬工藝后形成的一種中藥材，具有理氣健脾、祛濕化痰的功效，對脾胃氣滯、脘腹脹滿和消化不良具有一定的治療效果[6]。陳皮中富含黃酮、揮發(fā)油、生物堿、多糖等多種活性組分[7]，其中多糖是陳皮水提物中含量最多的一種生物大分子，具有多種生物活性。廖素媚[8]研究發(fā)現(xiàn)陳皮中的多糖可以有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基，是一種有效的抗氧化物質(zhì)。Suh等[9]從蜜柑（Citrus unshiu）中分離得到的果膠多糖片段CUI-3IIb-3-2能夠通過激活腸道派氏結促進造血生長因子的形成，具有顯著的腸道免疫活性。課題組之前對不同年份陳皮水溶性多糖的結構進行比較，發(fā)現(xiàn)隨著陳皮年份的增長，陳皮中水溶性多糖的結構隨之發(fā)生變化，如阿拉伯糖含量增加，半乳糖醛酸含量減少，可溶性共軛酚酸含量增多等；與1 年份橘皮相比，5 a以上的陳皮多糖具有較為顯著的腸道免疫活性[10]。由此可見，陳皮水溶性多糖的結構與其活性存在密切關聯(lián)，但具體的構效關系尚不清楚。

本研究以10年份陳皮為研究對象，依次采用水提醇沉、酸法降解、離子交換吸附和葡聚糖凝膠層析的方法得到3 種多糖片段；運用化學和色譜法對不同片段結構進行初步表征，并通過體外實驗比較其益生活性；旨在進一步解釋陳皮健胃消食的作用機理，同時也為陳皮的深度開發(fā)提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10年份陳皮（茶枝柑的果皮）江門市新會區(qū)新寶堂茶葉有限公司。

不同分子質(zhì)量的葡聚糖標準品（3.05×103、1.26×104、6.33×104、1.26×105、3.02×105、5.56×105Da），DEAE-纖維素陰離子交換樹脂，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖標準品北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖凝膠G-200 上海源葉生物科技有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑盒（增強版）天根生化科技（北京）有限公司；乙酸、丙酸和丁酸標準品（色譜純）上海麥克林生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1525高效液相色譜儀 美國Waters科技有限公司；QP2020氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀 日本島津株式會社；Nicolet 67傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；HDPF-55電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；StepOne Plus實時熒光定量聚合酶鏈式反應系統(tǒng) 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 陳皮多糖的提取和酸解

10年份陳皮在60 ℃烘箱中干燥6 h以上，粉碎后過80 目篩，用濾紙（中速）包裹后置入索氏抽提器，依次用丙酮和甲醇浸提4 h，除去其中的色素和酯類物質(zhì)。干燥后，按料液比1∶30（g/mL）加入超純水，在90 ℃攪拌提取2 h，過濾得濾液，濾渣按料液比1∶15（g/mL）加入超純水，重新攪拌提取2 h，過濾后合并濾液。用真空旋轉蒸發(fā)儀對濾液進行濃縮，濃縮液在10000 r/min離心20 min，傾出上清液。按體積比1∶4向上清液中加入無水乙醇，攪拌后醇沉過夜，傾去上清液，收集沉淀物。沉淀物在60 ℃烘箱中適當加熱，除去乙醇，用適量超純水溶解沉淀物，按體積比1∶5加入Sevag試劑，脫蛋白4～6 次。真空旋轉濃縮后進行冷凍干燥，得到粗多糖，記為Cpp。

稱取2.0 g Cpp置于三角瓶中，加入100 mL 2 mol/L硫酸溶液，充分溶解后在80 ℃水解12 h。用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至5.0左右，60 ℃真空旋轉濃縮至適當體積，裝入透析袋（截留分子質(zhì)量3500 Da）置入超純水中，透析24 h后冷凍干燥，得到多糖酸解片段混合物。

1.3.2 多糖片段的分離純化

取一定量酸解多糖片段溶液（5.0 mg/mL），加入已預處理的DEAE纖維素陰離子交換樹脂柱上，依次用超純水和0.05、0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液以2.5 mL/min流速進行洗脫，每個濃度洗脫200 mL，用部分收集器進行收集。采用苯酚-硫酸法測定每支試管的總糖含量[11]，收集相應試管的洗脫液，濃縮后透析脫鹽，冷凍干燥，備用。

將上述多糖組分配制成5.0 mg/mL的溶液，取2 mL過G-200葡聚糖凝膠色譜柱（65 cm×1.2 cm），以超純水為流動相，0.3 mL/min流速進行洗脫，部分收集器收集，每管收集3 mL。苯酚-硫酸法測定每支試管的總糖含量，收集后冷凍干燥，得到不同的多糖片段。各組分得率為其質(zhì)量在粗多糖質(zhì)量中的占比（%）。

1.3.3 糖片段的組分分析

采用苯酚-硫酸法測定不同片段的總糖含量；采用考馬斯亮藍法和間羥基聯(lián)苯法[12]測定樣品中蛋白質(zhì)和糖醛酸的含量。利用高效液相色譜法（配有UltrahydrogelTM1000色譜柱（7.8 mm×300 mm）和示差檢測器）測定不同樣品的分子質(zhì)量。

1.3.4 單糖組成分析

取5.0 mg樣品放入安瓿管中，加入2 mL 2.0 mol/L三氟乙酸溶液，火焰封口，110 ℃條件下反應6.0 h。真空旋轉蒸干，加入2 mL蒸餾水和30 mg NaBH4，室溫反應3 h，向反應液中逐滴滴加2 mol/L冰醋酸直至無氣泡產(chǎn)生；真空旋轉蒸干后向反應瓶中加入2 mL吡啶-醋酸酐混合溶液（1∶1，V/V），密封后100 ℃反應1 h。真空蒸干后，加入2 mL甲醇蒸干，重復操作5～6 次。加入2 mL二氯甲烷萃取，過濾后備用。分別取6 種單糖標準品，乙?；椒ㄈ缟纤觥?/p>

乙?；蟮臉悠愤M行GC-MS檢測。色譜條件如下：SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度60 ℃，按照10 ℃/min升至180 ℃，保持2.0 min；以5 ℃/min升至230 ℃，保持1.0 min。載氣（He）流速2.0 mL/min，分流比1∶10，進樣口溫度250 ℃，進樣量1.0 μL。

1.3.5 紅外波譜分析取適量多糖樣品與KBr 充分混勻、壓片，在400～4000 cm-1區(qū)間進行掃描，繪制紅外波譜圖。

1.3.6 體外益生活性比較

1.3.61 體外培養(yǎng)

不同多糖樣品的體外益生活性評價參照劉麗婭等的方法[13]，略作修改。取健康成人糞便懸浮于滅菌0 ℃0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中（pH 7.3），制成糞樣質(zhì)量濃度為50 mg/mL的懸浮液，渦旋混勻，靜置10 min后取上清液，備用。

發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：酵母浸膏2 g/L、蛋白胨2 g/L、KH2PO40.04 g/L、K2HPO40.04 g/L、CaCl2·H2O 0.01 g/L、NaCl 0.1 g/L、NaHCO32 g/L、MgSO4·7H2O 0.01 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、膽汁酸鹽0.5 g/L、氯化血紅素0.005 g/L、吐溫-802 mL/L、VK110 μL/L。

分別在基礎培養(yǎng)基中添加1 mg/mL葡萄糖（對照組）、1 mg/mL低聚果糖（陽性組）、1 mg/mL 10年陳皮總多糖和1 mg/mL酸解后的陳皮多糖片段，121 ℃滅菌30 min后，冷卻備用。無菌條件下，向培養(yǎng)基中加入0.5 mL糞懸液，混勻后置入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.62 益生菌數(shù)量的測定

培養(yǎng)結束后，培養(yǎng)基在4 ℃、12000 r/min下離心30 min，分別收集沉淀物和上清液。按照糞便基因組DNA提取試劑盒的操作流程提取沉淀物中的總DNA。參照文獻[14-15]，分別設定乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（F：5’-GGGAATCTTCCACAATGGAC-3’；R：5’-CATGGAGTTCCACTCTCCTCT-3’）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）（F：5’-CTTACTTCGCCTTCTTTGCTCCRTAC-3’；R：5’-GAAGTCCAAGACTTTGGCCCTGA-3’）的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實時聚合酶鏈式反應體系（20 μL）：10.0 μL 2×SuperReal PreMix Plus溶液，0.6 μL 10.0 μmol/L正/反向引物，2.0 μL模板DNA，2.0 μL 50×ROX染液和5.4 μL蒸餾水。反應條件：95 ℃加熱15 min；95 ℃加熱10 s，55 ℃維持30 s，72 ℃保持30 s，循環(huán)40 次；95 ℃維持1.0 min。GAPDH作為內(nèi)參基因，每個實驗重復3 次，實驗結果用2-ΔΔCt表示。

1.3.63 短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的測定

參照Deloule等[16]的方法，分析比較不同發(fā)酵上清液中SCFA含量。色譜柱：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）；流動相A為0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液，流動相B為乙腈（色譜純）；梯度洗脫程序如下：0～15 min，80% A、20% B；15～30 min，60% A、40% B；洗脫流速1.0 mL/min；上樣量20 μL。利用不同濃度的乙酸、丙酸和丁酸標準品溶液，擬合峰面積與標準品濃度間的回歸曲線，根據(jù)曲線方程計算不同樣品中SCFA含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗重復3 次，利用Origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，所有結果表示為±s，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 陳皮多糖片段的制備

10年份陳皮經(jīng)干燥、脫色和脫脂后采用水提醇沉法得到Cpp，得率約占陳皮質(zhì)量的17.6%。陳皮多糖外觀呈褐色，易溶于水，其水溶液（1 mg/mL）pH值為4.2±0.2。采用酸水解法對粗多糖進行降解獲得聚合度較低的多糖片段。本研究結果表明，2.0 mol/L硫酸溶液在80 ℃處理12 h后，可以得到分子質(zhì)量和片段數(shù)量均較為適宜的水解物。DEAE纖維素是一種弱陰離子交換樹脂，可用于分離帶不同陰離子基團的混合物，被廣泛用于多糖片段的分離純化[17]。如圖1A所示，當用超純水、0.05 mol/L和0.1 mol/L NaCl溶液洗脫時，得到了3 種含量較多的多糖組分，分別記作f1、f2和f3。繼續(xù)用高濃度的NaCl溶液洗脫時多糖片段產(chǎn)量顯著減少（f4，0.2 mol/L NaCl）或無洗脫組分（0.5 mol/L NaCl），該現(xiàn)象表明酸解后得到的10年份陳皮多糖片段沒有或帶少量陰離子基團。由于f4得率極低，不能滿足后期研究的需要，所以僅對組分f1、f2和f3作進一步純化和研究。3 種多糖組分分別用葡聚糖凝膠層析柱進一步分離純化，如圖1B所示，f1、f2和f3組分中均含有2～3 種不同分子質(zhì)量的片段，其中f1-1、f2-2和f3-2含量較多，被用于后期的活性研究。

圖1 陳皮多糖片段的分離和純化Fig.1 Isolation and purification of polysaccharides from tangerine peel

2.2 陳皮多糖片段的性質(zhì)

如表1所示，片段f2-2的得率最高，約為Cpp質(zhì)量的25.9%。3 種多糖片段的總糖含量均高于粗多糖，表明兩種分離方法能有效去除多糖外組分，得到純度較高的多糖。10年份陳皮多糖及其片段均含有一定量糖醛酸，表現(xiàn)出果膠類多糖的特征[18]。Cpp中糖醛酸含量最高，而3 種酸解片段的糖醛酸含量均有所下降，其中f2-2中糖醛酸含量最少。高效液相色譜法比較多糖片段的分子質(zhì)量，其中f2-2分子質(zhì)量最小，為1.15×104Da。

表1 陳皮多糖片段的性質(zhì)Table 1 Properties of polysaccharides from tangerine peel

2.3 陳皮多糖片段的單糖組成

以6 種單糖標準品氣相色譜的出峰時間和峰面積為依據(jù)，分析不同樣品的單糖類型和含量。如圖2 所示，C p p 主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為0.26∶1.00∶0.44∶0.11∶0.08∶0.98。f1-1中包含鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為1.72∶1.00∶0.42∶2.12∶2.46。f2-2中僅含鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為0.21∶1.00∶0.25，f3-2中含有較多的阿拉伯糖和半乳糖（物質(zhì)的量比為1.00∶0.08）以及微量的木糖、甘露糖和葡萄糖。

圖2 陳皮多糖片段的單糖組成Fig.2 Monosaccharide compositions of polysaccharides from tangerine peel

2.4 陳皮多糖片段的紅外光譜分析結果

不同多糖的紅外光譜具有特有的吸收峰，在多糖結構表征中具有重要作用。如圖3所示，3440 cm-1處的吸收峰來源于O—H鍵的伸縮振動，2940 cm-1處則是由于C—H的伸縮振動。此外，1750 cm-1和1630 cm-1處的吸收峰分別對應酯化羥基和游離羥基的伸縮振動，可以用于表征果膠多糖的酯化程度[19]。f1-1和f3-2的酸性糖基以游離狀態(tài)形式存在，而f2-2片段中酸性糖基部分酯化。此外，1420 cm-1處吸收峰進一步證明了游離羧基的存在，而1100 cm-1處的吸收峰則表明吡喃型半乳糖的存在[20]。

圖3 陳皮多糖片段的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of polysaccharides from tangerine peel

2.5 陳皮多糖片段的益生元活性評價

腸道微生物群落的組成與宿主的健康有著密切聯(lián)系，而益生元的攝入可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結構削弱宿主的生理代謝紊亂，對一些疾?。ǚ逝?、糖尿病等）有預防和治療作用[21-22]。乳酸桿菌是一類兼性厭氧菌，廣泛地分布在腸道和各種食物中，其具有提高食物營養(yǎng)價值、促進乳酸吸收以及降低人體血脂的作用；雙歧桿菌則是新生兒腸道中的優(yōu)勢菌群，參與嬰兒早期免疫系統(tǒng)的完善以及食物的吸收利用[23]。將對照組（1 mg/mL葡萄糖）中乳酸桿菌和雙歧桿菌表達水平均定義為1，經(jīng)24 h培養(yǎng)，含有Cpp或f2-2培養(yǎng)基中乳酸桿菌數(shù)量分別為對照組的1.58 倍和3.20 倍（圖4A）（P＜0.05），而含有f2-2培養(yǎng)基中雙歧桿菌數(shù)量為對照組的2.9 倍（圖4B），表明f2-2可以優(yōu)先被乳酸桿菌和雙歧桿菌利用，促進這兩種益生菌的生長。

圖4 陳皮多糖片段對乳酸桿菌（A）和雙歧桿菌（B）生長的影響Fig.4 Effects of polysaccharides from tangerine peel on the growth of Lactobacillusi (A) and Bifidobacterium (B)

2.6 陳皮多糖片段對腸道菌群產(chǎn)SCFA的影響

SCFA是由腸道微生物產(chǎn)生的一類重要代謝產(chǎn)物，在腸道環(huán)境構建、能量供應和宿主信號傳導中發(fā)揮著重要作用。乙酸是結腸部位含量最多的一種SCFA，約占糞便總SCFA的一半以上，而丙酸和丁酸的代謝則與炎癥反應有著密切聯(lián)系，因而受到研究者的關注[24]。Lee等[25]發(fā)現(xiàn)SCFA的移植可以減輕高齡小鼠中風后的神經(jīng)缺損和炎癥，有利于中風后的恢復。如表2所示，相較于對照組（1 mg/mL葡萄糖），f2-2的添加顯著降低了發(fā)酵上清液中乙酸含量，但是提高了丙酸含量（P＜0.05）。值得注意的是，f1-1和f2-2的添加均導致丁酸形成，進一步證明了酸解多糖片段可以優(yōu)先被腸道中的某些菌種利用，從而對人體腸道健康產(chǎn)生有益影響。

表2 添加不同多糖發(fā)酵上清液中的SCFA濃度Table 2 Effects of polysaccharides from tangerine peel on SCFA production in fermentation supernatant μmol/mL

3 討論

近年來，越來越多的研究表明果膠多糖不僅是一類結構多糖，同時具有多種生物活性[26-27]。果膠多糖分子質(zhì)量大、結構復雜，含有多個不同的結構域，如聚半乳糖醛酸、鼠李半乳糖醛酸聚糖（rhamnogalacturonan，RG）I和RG II、木半乳糖醛酸聚糖等[28]。其中，RG-I片段的主鏈由半乳糖醛酸和鼠李糖交替連接而成，在鼠李糖的O-4上連接有阿拉伯聚糖或半乳聚糖側鏈[29]。當果膠多糖受外界環(huán)境（紫外線、酶、壓力等）影響時，會釋放出具有特殊結構的多糖片段[30-31]，活性也發(fā)生相應變化。

Van Den Abbeele等[32]利用SHIME模型評價胡蘿卜果膠中RG-I片段對人腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的益生元功效。10年份陳皮水溶性多糖Cpp酸解后形成的片段f2-2富含鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖（醛酸），具有RG-I片段的結構特征，推測陳皮果膠多糖良好的益生元功效主要歸因于其中的RG-I片段，陳皮果膠多糖可能是一種潛在的益生元。