唐豪言，潘正龍，劉小方

在世界范圍內(nèi)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤第6 位和第4 位［1］，主要由乙型肝炎病毒慢性感染所致。中國是乙肝大國，肝癌發(fā)病率高居我國惡性腫瘤的第4位［2］。目前，HCC 有許多既定的治療方法，包括化療、射頻消融、肝移植及手術(shù)切除等。然而，即使早期已接受相關(guān)治療的患者生存率也比較低，手術(shù)作為最常見的治療手段，術(shù)后5 年內(nèi)的肝癌復(fù)發(fā)率也高達(dá)60%～70%［3-4］。研究HCC患者術(shù)后預(yù)后的危險因素，對提高肝癌的治療效果具有重要意義。TP53基因作為一個高度突變的抑癌基因，涉及人類多數(shù)腫瘤。該基因位于染色體17p13.1，由12 個外顯子和10 個內(nèi)含子組成，其蛋白產(chǎn)物p53 維持著細(xì)胞正常的基本活動，如細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)［5-6］。TP53基因突變作為HCC里最常見的突變［7］，其改變不僅與腫瘤增殖、遷移、生長、侵襲及化療藥物的耐藥性相關(guān)［8-9］，同時具有TP53基因突變的患者肝癌復(fù)發(fā)時間和總生存期也會受到影響［10］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為基因重要的變異形式，廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［11］。近年來，與腫瘤預(yù)后有關(guān)的多態(tài)性位點被相繼報道，但關(guān)于HCC預(yù)后的研究相對較少。本研究旨在探討HCC 患者預(yù)后的影響因素，并探究TP53基因SNP與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2014 年1 月—2020 年9 月在青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院接受手術(shù)治療且住院資料完整的HCC患者213例。納入標(biāo)準(zhǔn)：已行肝惡性腫瘤切除手術(shù)；病理組織學(xué)診斷為HCC；采集血液樣本前未行放療或化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有其他腫瘤病史；同期合并其他器官惡性腫瘤。研究參與者對試驗知情同意，且通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：煙毓醫(yī)倫理審2019-169號）。

1.2 收集指標(biāo) 通過查閱病歷和標(biāo)準(zhǔn)化問卷收集研究對象年齡、性別，吸煙、飲酒情況，乙型病毒性肝炎感染病史、手術(shù)方式及圍術(shù)期輸血病史。同時收集患者相關(guān)臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)，包括腫瘤T分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝硬化、門靜脈癌栓情況等。

1.3 隨訪 通過電話或門診進行隨訪。術(shù)后前2年每3個月進行1次，從術(shù)后第3年起每6個月進行1次。隨訪終點事件為患者死亡或隨訪截止時間（截至2021年9月1日）。

1.4 SNP位點的選擇和基因分型 基于以往相關(guān)腫瘤報道，尤其是涉及HCC預(yù)后文獻(xiàn)，并利用TRANSFACR預(yù)測軟件及NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）篩選出TP53基因功能性SNP位點。其選擇標(biāo)準(zhǔn)為：SNP位點的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05。最終篩選出3 個SNP 作為研究對象，即TP53 基因rs1625895、rs9895829和rs28934578。

取靜脈血5 mL，采用血液基因組提取試劑盒（北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司）提取DNA，DNA片段需完整性好，無降解，無小片段RNA 污染，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用聚合酶鏈反?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP）對基因型進行鑒別。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。TP53 rs1625895引物序列：上游5'-TGGCCATCTACAAGCAGTCA-3'，下游5'-TTGCACATCTCATGGGGTTA-3'。TP53 rs9895829 引物序列：上游5'-GCACCTCCTGCAACCCACTAGCGAT-3'，下游5'-CTCTCAAAGAGGCCAAGGCAGGCAG-3'。TP53 rs28934578 引物序列：上游5'-GTCTCTGCTAGGGGGCTGGACTTGG-3'，下游5'-CAGGAGTGCTTGGGTTGTGGTGAAA-3'。各SNP 位點均需要1 條延伸引物和2 條PCR 擴增引物。PCR 擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶消化，消化程序：37 ℃40 min，85 ℃5 min。按照延伸反應(yīng)擴增程序進行PCR產(chǎn)物的延伸，所得產(chǎn)物采用樹脂板進行純化。采用MassARRAY?質(zhì)譜分析儀（美國Agena Bioscience 公司）對產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析，檢測數(shù)據(jù)使用Typer 4.0 分析軟件分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用例（%）表示。運用單因素或多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型計算危險比（HR）及其95%CI并校正混雜因素，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用Log-rank 檢驗比較不同基因型之間的生存率差異。檢驗水準(zhǔn)雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料及臨床特征與HCC 預(yù)后的關(guān)系 單因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示腫瘤大小、腫瘤T 分期、手術(shù)方式、圍術(shù)期輸血、腫瘤數(shù)目及肝硬化情況與肝癌預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），但年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染史、肝癌家族史與及門靜脈癌栓方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Relationship between clinical characteristics and the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表1 HCC患者臨床特征與預(yù)后的關(guān)系［例（%）］

2.2TP53SNPs 與HCC 預(yù)后的關(guān)系TP53基因rs1625895、rs9895829、rs28934578 位點符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性。采用Kaplan-Meier、單因素Cox 回歸分析rs1625895、rs9895829、rs28934578 位點后發(fā)現(xiàn)：TP53基因rs1625895 除顯性模型外，其共顯性模型（HR=2.190，95%CI：1.142～4.201，P=0.018）和隱性基因模型（HR=2.275，95%CI：1.225～4.227，P=0.009）與肝癌患者預(yù)后相關(guān)，見圖1、表2。由于大多數(shù)肝癌患者確診時年齡較大，老年患者的中位生存時間均短于年輕患者，故對年齡進行分層分析。結(jié)果顯示在年齡≥60歲的人群中，共顯性模型和隱性模型中AA基因型患者預(yù)后表現(xiàn)更差。TP53基因rs9895829、rs28934578位點基因多態(tài)性與HCC預(yù)后無關(guān)（P＞0.05），見表3。

Fig.1 TP53 gene rs1625895 Kaplan-Meier survival curve in patients with hepatocellular carcinoma patients圖1 HCC患者TP53基因rs1625895位點不同遺傳模型的生存曲線

Tab.2 Relationship between TP53 SNPs and the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表2 TP53 SNPs與HCC患者預(yù)后的關(guān)系［例（%）］

Tab.3 Relationship between TP53 gene rs1625895 and prognosis of HCC patients after age stratification表3 年齡分層后TP53基因rs1625895位點多態(tài)性與HCC患者預(yù)后的關(guān)系［例（%）］

2.3 HCC預(yù)后的影響因素分析 采用多因素Cox回歸分析影響HCC 患者術(shù)后預(yù)后的獨立因素。變量賦值：腫瘤T 分期（T1+T2＝0，T3+T4＝1）；腫瘤大?。ǎ? cm＝0，≥5 cm＝1）；rs1625895（AG/GG＝0，AA＝1）；手術(shù)方式（根治性切除＝0，姑息性切除＝1）；圍術(shù)期輸血（否＝0，是＝1）；腫瘤數(shù)目（單發(fā)＝0，多發(fā)＝1）；肝硬化（否＝0，是＝1）。結(jié)果顯示腫瘤T3+T4 分期、腫瘤直徑≥5 cm、TP53rs1625895 AA 基因型、腫瘤姑息性切除、圍術(shù)期輸血、腫瘤多發(fā)以及患有肝硬化是影響肝癌預(yù)后的獨立危險因素，見表4。

Tab.4 Cox regression analysis of the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表4 HCC患者預(yù)后多因素Cox比例風(fēng)險回歸結(jié)果

3 討論

本研究探討TP53基因多態(tài)性與HCC 預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示rs1625895位點多態(tài)性與肝癌術(shù)后生存期相關(guān)，AA 基因型患者較AG/GG 基因型患者術(shù)后預(yù)后更差，這一情況在年齡≥60歲人群中更為明顯。

3.1TP53基因SNP研究現(xiàn)狀TP53基因SNP在多個與癌癥相關(guān)的途徑中發(fā)揮核心作用［12］。p53通路里存在許多涉及不同腫瘤且功能復(fù)雜的SNP 位點，它們結(jié)構(gòu)變異或異常表達(dá)能不同程度地影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，最終影響患者預(yù)后并體現(xiàn)于患者的生存周期上。目前已證實TP53基因多態(tài)性位點與多種腫瘤預(yù)后相關(guān)。Assad Samani 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在伊朗人群中，rs1625895位點攜帶A等位基因的乳腺癌患者早期死亡風(fēng)險是攜帶G 等位基因患者的3 倍。Voropaeva 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，rs1625895 多態(tài)性會影響彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者化療方案的治愈率，大大降低患者生存周期。在TP53基因多態(tài)性與低位直腸癌的生物學(xué)行為相關(guān)研究中，Zhang等［15-16］發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)受TP53基因rs1042522多態(tài)性影響，這使得腫瘤更快發(fā)展到晚期，間接縮短了患者的生存期。

3.2TP53基因SNP 與HCC 的關(guān)系 本研究發(fā)現(xiàn)TP53基因rs1625895位點多態(tài)性與肝癌術(shù)后人群生存周期相關(guān)。rs1625895 位于TP53基因第6 內(nèi)含子上，由等位基因A和G組成，該區(qū)域的SNP通常會影響TP53mRNA 的加工（如剪接）步驟及DNA 鏈和蛋白分子之間的相互作用，同時引起細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)及凋亡能力下降，加速腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展［13，17-18］。TP53基因該點的多態(tài)性是因限制性內(nèi)切酶MspI上的鳥嘌呤與腺嘌呤之間的替換所引起的，這會影響到限制性內(nèi)切酶的正常功能，進而導(dǎo)致TP53基因表達(dá)減少，并可能破壞細(xì)胞周期停滯和凋亡所需的靶基因轉(zhuǎn)錄激活的過程［19］。特別是當(dāng)這種突變與有缺陷的腫瘤抑制因子或紡錘體檢查位點相結(jié)合時，更容易引起基因組不穩(wěn)定［20-21］。有研究表明TP53基因該位點的多態(tài)性可能會讓其失去抑制腫瘤的功能，相反會獲得一種推進腫瘤發(fā)生發(fā)展的新能力。楊怡等［22］研究發(fā)現(xiàn)TP53基因的變異會促進血管新生，肝臟腫瘤病灶轉(zhuǎn)移發(fā)生率增高，腫瘤更具侵襲性，最終使得患者的生存周期明顯縮短。同時有研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織學(xué)分級不光與TP53基因突變有關(guān)，突變患者的總體生存期、疾病特異性生存期、無進展生存期和無病生存期也明顯差于無突變的患者［6］。

3.3 HCC預(yù)后的影響因素 本研究多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤T3+T4分期、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤姑息性切除、圍術(shù)期輸血、腫瘤多發(fā)及患有肝硬化同樣是影響肝癌患者術(shù)后預(yù)后的獨立危險因素。分析其原因如下：（1）T分期較晚的患者往往肝功能已嚴(yán)重受損，行肝切除術(shù)時會增大術(shù)中大出血及術(shù)后出現(xiàn)肝功能衰竭的風(fēng)險［23］。（2）腫瘤大小和微血管侵襲之間存在顯著的關(guān)聯(lián)，即腫瘤體積較大者發(fā)生術(shù)后腹腔轉(zhuǎn)移風(fēng)險高，從而降低了患者生存期［24］。（3）多發(fā)腫瘤較單發(fā)腫瘤更易轉(zhuǎn)移，同時多發(fā)腫瘤更易導(dǎo)致抑制肝癌細(xì)胞生長和侵襲的基因突變［25］。（4）肝硬化常伴有凝血功能的異常，這不僅增加出血風(fēng)險同時還增大了手術(shù)難度［26］。（5）根治性肝切除的患者殘存肝臟的負(fù)荷會增大，而姑息性手術(shù)的患者則會因殘留的癌細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)［27］。（6）圍術(shù)期輸血會降低機體外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量，降低免疫功能，可能會增加殘余肝臟內(nèi)新生腫瘤的復(fù)發(fā)［28］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TP53基因rs1625895 位點與HCC患者術(shù)后的預(yù)后相關(guān)，尤其對老年群體術(shù)后OS影響更大。但同時也存在一定局限性，SNP位點分布頻率可能會受到地域、人種等因素的影響，進而導(dǎo)致結(jié)果的偏差。本研究樣本量相對較小，今后將增大樣本量并采用前瞻性研究進一步證實。目前關(guān)于TP53基因多態(tài)性與HCC 預(yù)后的報道相對較少，其中的分子機制還尚未完全闡明，對于未來肝癌相關(guān)基因多態(tài)性位點研究的方向，功能驗證將是重要的一環(huán)，這需要進一步深入探究。