程天帥 卯明娟 杜雨桐 李卓宸 趙玉俊 劉迪

摘 要：硫磺菌是一種珍貴的藥食兼用的大型真菌，ITS分類(lèi)鑒定為奶油硫磺菌（Laetiporus? cremeiporus），對(duì)該菇進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化研究結(jié)果為，最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖25g·L-1，酵母膏2.0g·L-1，氯化鈉0.5g·L-1；馴化栽培試驗(yàn)出現(xiàn)原基，表明該菌馴化成功，本試驗(yàn)為開(kāi)發(fā)利用及生產(chǎn)栽培這一野生資源奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：硫磺菌；鑒定；培養(yǎng)基優(yōu)化；馴化栽培

硫磺菌（Laetiporus）又名硫磺多孔菌[1-2]，具有基內(nèi)菌絲和氣生菌絲[3]，子實(shí)體在藥用方面有較大作用[4]，內(nèi)含齒孔酸，可合成甾體藥物腎上腺皮質(zhì)激素，在很多疾病上有很好治療作用[5]，多糖[6]以其它成分含量也較豐富[7]，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤作用[8]。本研究對(duì)野生硫磺菌鑒定，活性成分測(cè)定，培養(yǎng)基優(yōu)化，馴化栽培進(jìn)行研究，旨在為藥用真菌資源的馴化和利用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株：菌株于2021年6月21日采自吉林省延邊朝鮮族自治州延吉市園藝農(nóng)場(chǎng)四隊(duì)蘋(píng)果梨園（東經(jīng)129°27′33″，北緯42°54′56″，海拔218m），其余試驗(yàn)材料（LH、Li、Dai）均來(lái)自延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食藥用真菌研究所。

1.2 方法

1.2.1 ITS鑒定：菌絲體DNA提取利用試劑盒，鑒定利用ITS通用引物ITS1和ITS4對(duì)DNA樣本序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將獲得的ITS序列利用NCBI進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA? 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定：分別對(duì)4個(gè)菌株進(jìn)行多糖、黃酮、三萜、多酚的測(cè)定，進(jìn)行超聲提取后紫外分光光度計(jì)在相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.2.3 硫磺菌菌絲體培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20g·L-1、蛋白胨2.0g·L-1、

硫酸鎂0.5g·L-1、瓊脂20g·L-1，水1L。碳源：添加等量葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖；氮源：添加蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸銨、黃豆粉；無(wú)機(jī)鹽：添加硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鋅、硫酸錳、磷酸二氫鉀，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基不加相應(yīng)物質(zhì)為對(duì)照；設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于25℃避光培養(yǎng)7～10d，用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)：對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽三個(gè)單因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)選出最優(yōu)組合，以確定硫磺菌的最佳培養(yǎng)基配方。正交設(shè)計(jì)采用L9（33）試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1）。

1.2.4 硫磺菌培養(yǎng)料篩選

1.2.4.1 二級(jí)種培養(yǎng)基篩選：二級(jí)級(jí)種分別選用以麥麩20%、石膏1%、白糖1%為基礎(chǔ)，分別添加雜木屑78%、棉籽殼78%、蘋(píng)果梨木屑78%，以雜木屑41.5%、麥麩10%、玉米粉5%、石膏1%、白糖1%為基礎(chǔ)分別添加棉籽殼41.5%、蘋(píng)果梨木屑41.5%。以麥麩10%、玉米粉5%、石膏1%、白糖1%為基礎(chǔ)配方，分別在兩個(gè)配方中添加蘋(píng)果梨木屑41.5%、棉籽殼41.5%，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)，記錄吃料速度、長(zhǎng)勢(shì)、滿瓶時(shí)間。

1.2.4.2 三級(jí)種培養(yǎng)基篩選：三級(jí)種培養(yǎng)料以雜木屑、蘋(píng)果梨木屑、棉籽殼為主料，在麥麩10%、石膏1%、白糖1%的栽培袋中分別加入雜木屑83%和玉米粉5%，雜木屑86%和玉米粉2%，蘋(píng)果梨樹(shù)木屑83%和玉米粉5%，蘋(píng)果梨樹(shù)木屑86%和玉米粉2%，雜木屑43%、棉籽殼43%和玉米粉2%，雜木屑54%、棉籽殼29%和玉米粉5%，蘋(píng)果梨木屑54%、棉籽殼29%和玉米粉5%，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，25℃培養(yǎng)，記錄生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)、菌滿袋天數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定：硫磺菌（LHJ）子實(shí)體沒(méi)有著生菌柄，菌蓋直生于菌絲基部，呈扇形，菌蓋直徑12～14cm，菌蓋邊緣厚度0.2～0.4cm，橘黃色，表面有白色絨毛，邊緣呈波浪狀，菌肉呈乳黃色，有明顯溝壑（見(jiàn)圖1）。

2.2 ITS鑒定：菌株LHJ、LH、Li為硫磺菌屬（Laetiporus? Murrill）的奶油硫磺菌（Laetiporus? cremeiporus），菌株Dai為硫磺菌屬（Laetiporus? Murrill）的硫色硫磺菌（Laetiporus? sulphureus），與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符（見(jiàn)圖2）。

2.3 活性成分分析：對(duì)4個(gè)菌株活性成分進(jìn)行測(cè)定，如表2，菌株LHJ其多糖、多酚、黃酮、三萜含量均最高，且顯著高于其他菌株，綜合得出菌株LHJ最優(yōu)，后續(xù)選取該菌株進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 碳源：如表3，以葡萄糖為碳源的硫磺菌菌絲體長(zhǎng)勢(shì)最好。綜合碳源的適用順序?yàn)椋浩咸烟?麥芽糖>果糖>蔗糖>乳糖。

2.4.2 氮源：菌絲體在不同氮源下均可生長(zhǎng)，如表4，蛋白胨最佳，硝酸銨最弱，無(wú)氮源中基本停止生長(zhǎng)。綜合對(duì)5種氮源的適用順序?yàn)椋旱鞍纂?黃豆粉>牛肉膏>酵母膏>硫酸銨。

2.4.3 無(wú)機(jī)鹽：菌絲體在不同無(wú)機(jī)鹽下均可生長(zhǎng)，如表5，氯化鈉時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好，硫酸錳時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最弱，綜合適用順序?yàn)椋郝然c>硫酸鋅>硫酸鎂>磷酸二氫鉀>硫酸錳。

2.4.6 正交試驗(yàn)：如表6，對(duì)硫磺菌菌絲體生長(zhǎng)影響為碳源>氮源>無(wú)機(jī)鹽，配方8菌絲生長(zhǎng)速度最大，故最佳配方組合為A3B2C2。

2.5 原種配方對(duì)菌絲體的影響：如表7，配方5菌絲生長(zhǎng)最慢，配方2菌絲生長(zhǎng)速度最快為0.517cm·d-1，滿瓶時(shí)間最短，為菌絲生長(zhǎng)最適原種配方。

2.6 栽培種配方對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響：如表8，配方5菌絲生長(zhǎng)速度最快且與其他配方差異顯著，為最佳栽培種培養(yǎng)料配方，配方4生長(zhǎng)最慢，在配方5、6、7、8中都出現(xiàn)原基，說(shuō)明馴化成功。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)該菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明該菇為硫磺菌，各菌株中LHJ多糖、黃酮、多酚、三萜含量均高于其他，為優(yōu)勢(shì)菌株。對(duì)該菌進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，最佳因素為葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉，最佳組合為葡萄糖25g·L-1，酵母膏2.0g·L-1，氯化鈉0.5g·L-1。最佳二級(jí)種為配方2生長(zhǎng)速度最快。最佳三級(jí)種為配方5，且有原基出現(xiàn)，證明馴化成功?？傊蚧蔷植紡V泛，不同來(lái)源菌株在遺傳特性上可能會(huì)存在區(qū)別[7]，本研究結(jié)果可為硫磺菌培養(yǎng)和栽培提供一定理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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