趙元元　吳小華

摘要：目的 探究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）來源的外泌體miR-1260a靶向CASP8對多囊卵巢綜合征（PCOS）患者顆粒細(xì)胞凋亡的影響。方法 取健康足月胎兒的臍帶進(jìn)行組織塊貼壁法分離培養(yǎng)獲得hUC-MSCs，采用流式細(xì)胞儀檢測其標(biāo)志性蛋白CD73和CD90的表達(dá)。收集hUC-MSCs培養(yǎng)上清液，提取hUC-MSCs外泌體，透射電鏡觀察其形態(tài)，Western blot檢測外泌體膜表面標(biāo)志物熱休克蛋白70（HSP70）和腫瘤易感基因101（TSG101）的表達(dá)。PKH67標(biāo)記外泌體，采用激光共聚焦顯微鏡觀察PCOS顆粒細(xì)胞對外泌體的內(nèi)化作用。Western blot檢測hUC-MSCs外泌體對PCOS顆粒細(xì)胞凋亡的影響。利用GSE69909臨床樣本進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到hUC-MSCs外泌體中異常高表達(dá)的miRNAs，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。合成miR-1260a模擬物及其對照轉(zhuǎn)染至KGN細(xì)胞中，流式細(xì)胞術(shù)檢測顆粒細(xì)胞凋亡率。利用Target Scan Human 7.2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miR-1260a靶基因的預(yù)測，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測miR-1260a對靶基因的調(diào)控作用。qPCR檢測PCOS顆粒細(xì)胞攝取hUC-MSCs外泌體前后miR-1260a及CASP8的表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞符合hUC-MSCs的特征，hUC-MSCs外泌體為直徑30～150 nm的圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，表達(dá)標(biāo)志物蛋白HSP70和TSG101，并且可被PCOS顆粒細(xì)胞攝取。與對照組相比，hUC-MSCs上清液處理組及hUC-MSCs外泌體處理組Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。經(jīng)GSE69909數(shù)據(jù)庫篩選及qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-1260a在hUC-MSCs外泌體中富集，miR-1260a過表達(dá)可顯著抑制顆粒細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），經(jīng)驗(yàn)證miR-1260a可直接靶向CASP8且PCOS顆粒細(xì)胞攝取hUC-MSCs外泌體后，顆粒細(xì)胞中miR-1260a的表達(dá)升高，CASP8的表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論 hUC-MSCs來源的外泌體miR-1260a通過靶向CASP8抑制PCOS顆粒細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：多囊卵巢綜合征；臍帶；間質(zhì)干細(xì)胞；外泌體；粒層細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；微RNAs；miR-1260a

中圖分類號：R711.75 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20221070

The effect of exosomal miR-1260a derived from human umbilical mesenchymal stem cells on apoptosis of granulosa cells in PCOS patients

ZHAO Yuanyuan， WU Xiaohua

Center for Reproductive Medicine， the Fourth Hospital of Shijiazhuang （Gynecology and Obstetrics Hospital Affiliated to

Hebei Medical University）; Key Laboratory of Maternal and Fetal Medicine of Hebei Province; the Institute of

Reproductive Health and Infertility， Shijiazhuang 050011， China

Corresponding Author E-mail： wuxiaohua1965@163.com

Abstract： Objective To explore the effect of exosomal miR-1260a derived from human umbilical mesenchymal stem cells （hUC-MSCs） on apoptosis of granulosa cells （GCs） in polycystic ovary syndrome （PCOS） by targeting CASP8. Methods hUC-MSCs were obtained from the umbilical cord of healthy full-term fetus by tissue explants adherent method. The surface markers CD73 and CD90 were detected by flow cytometry. The hUC-MSCs- exosomes （exos） were extracted from the supernatant of hUC-MSCs， and the morphology was observed by transmission electron microscopy （TEM）. The surface heat shock protein （HSP70） and tumor susceptibility gene 101 （TSG101） were detected by Western blot assay. Confocal microscope was used to observe whether PKH67 labeled hUC-MSCs-exos could be absorbed by GCs. Western blot assay was used to assess the protective effect of hUC-MSCs-exos on PCOS GCs. Clinical samples of GSE69909 were used for bioinformatics analysis. The differentially expressed miRNAs in hUC-MSCs-exos were obtained and verified by qPCR. miR-1260a mimics and negative control （NC） were synthesized and then transfected into KGN cells. Subsequently， cell apoptosis was measured by flow cytometry. Target genes of miR-1260a were predicted using Target Scan Human 7.2 database and verified by a dual-luciferase reporter gene assay. Expression levels of miR-1260a and CASP8 before and after uptake of hUC-MSCs-exos by PCOS GCs were detected by qPCR. Results The isolated cells accorded with the characteristics of hUC-MSCs. hUC-MSCs-exos were circular or elliptical membranous vesicle with diameter ranged from 30-150 nm and expressed the typical exosome markers HSP70 and TSG101. Confocal microscopy results showed that hUC-MSCs-exos could be absorbed by GCs. Compared with the control group， the expression of Cleaved-Caspase-8， Cleaved-Caspase-3 and Bax were significantly down-regulated and the expression of Bcl-2 was significantly up-regulated in the hUC-MSCs supernatant treated and the hUC-MSCs-exos treated groups （P＜0.05）. After GSE69909 database screening and qPCR verification， it was found that miR-1260a was enriched in hUC-MSCs-exos， and the overexpression of miR-1260a significantly inhibited the apoptosis of KGN cells （P＜0.05）. A dual-luciferase reporter gene assay showed that CASP8 was a direct target of miR-1260a. Moreover， the uptake of hUC-MSCs-exos by PCOS GCs increased the expression of miR-1260a and decreased the expression of CASP8 （P＜0.05）. Conclusion Our study reveals that exosomal miR-1260a derived from hUC-MSCs inhibits apoptosis of GCs in PCOS by targeting CASP8.

Key words： polycystic ovary syndrome; umbilical cord; mesenchymal stem cells; exosomes; granulosa cells; apoptosis; microRNAs; miR-1260a

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡期女性常見的生殖功能障礙與代謝異常并存的內(nèi)分泌疾?。?-2］?；诼固氐?biāo)準(zhǔn)，PCOS在全球的發(fā)病率高達(dá)8%～15%，約占無排卵性不孕疾病的75%［3-4］。目前，卵泡發(fā)育異常是導(dǎo)致育齡期女性排卵障礙性不孕的主要原因［5］。顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）作為卵泡中的重要組成部分可直接影響卵泡的生長、發(fā)育、成熟及閉鎖。其中，GCs凋亡直接影響卵泡發(fā)育，進(jìn)而影響卵巢功能［6］。研究表明，PCOS患者卵巢GCs凋亡異常增多，干擾卵泡正常發(fā)育［5，7］。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）用于治療卵巢功能障礙受到越來越多的關(guān)注［8-9］。目前研究發(fā)現(xiàn)，移植的MSCs主要通過分泌外泌體的方式調(diào)控卵巢微環(huán)境［10］。外泌體含有RNA、蛋白質(zhì)等成分，可傳遞特定的信號分子，進(jìn)一步影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能［11］。MSCs外泌體中富集了多種微小RNAs（microRNAs，miRNAs）［12］。然而，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）來源的外泌體miRNA對PCOS卵泡發(fā)育的影響尚不清楚。本文詳細(xì)探究了hUC-MSC來源的外泌體miR-1260a對PCOS顆粒細(xì)胞凋亡的影響，并分析其潛在的分子機(jī)制，以期為PCOS的臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本 選取2020年3月—2022年9月就診于石家莊市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕治療的PCOS患者12例，年齡22～33歲，平均（28.33±2.77）歲，排除高血壓及其他內(nèi)分泌疾病，如腎上腺皮質(zhì)增生、庫欣綜合征、雄激素分泌性腫瘤、糖尿病、甲狀腺功能異常等。收集PCOS患者第1管無血清污染的卵泡液，提取原代GCs。剖宮產(chǎn)術(shù)中采集來自石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)科生產(chǎn)的健康足月胎兒的臍帶1～2 cm（家屬知情），采集后的臍帶保存于生理鹽水中，6 h之內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室分離hUC-MSCs。人卵巢顆粒細(xì)胞KGN（貨號：ZQ0916）購自上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司。本研究已通過石家莊市第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（20200006），所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液購自北京索萊寶生物科技有限公司；樣本密度分離液購自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司；exoEasy Maxi Kit、exoRNeasy Maxi Kit購自德國凱杰生物技術(shù)有限公司；PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit購自美國Sigma-Aldrich公司；TRIzol、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；miR-1260a mimics及無義序列Negative Control購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；miR-1260a、U6反轉(zhuǎn)錄引物和miR-1260a、U6、β-actin及CASP8定量引物由上海生工生物工程有限公司合成；Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8兔抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；Bax、Bcl-2兔抗人多克隆抗體購自成都正能生物科技有限公司；腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene101，TSG101）兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司；熱休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；內(nèi)參β-actin兔抗人單克隆抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG山羊抗兔/鼠抗體購自美國KPL公司；PVDF膜購自美國密理博公司；PE AnnexinV Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司；熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)（E1910）購自美國Promega公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀（qTOWER3G，德國）；蛋白電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（FUSIONFX7.EDGE，法國）；流式細(xì)胞儀（BD Melody，美國）；倒置顯微鏡（Nikon，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）；化學(xué)發(fā)光儀（Promega，美國）。

1.3 研究方法

1.3.1 原代GCs的提取、培養(yǎng) 將PCOS患者卵泡液收集于50 mL無菌離心管中，2 000×g室溫離心10 min；去除上清液后，將沉淀重懸于4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），混勻后緩慢加入4 mL的樣本密度分離液，1 500×g室溫離心15 min；取中間白膜層，加入5 mL PBS混勻后1 000×g室溫下離心5 min；重復(fù)操作1次。將所得的沉淀用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，放置在6 cm的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后無菌PBS清洗細(xì)胞，更換為新鮮培養(yǎng)基，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.2 hUC-MSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定 超凈臺內(nèi)取出臍帶，PBS溶液充分沖洗殘留的血液和血凝塊，用無菌眼科剪沿臍帶靜脈縱向剪開，剔除動靜脈及臍帶外膜；將得到的華通氏膠剪為直徑1 mm大小的組織塊，置于T25的培養(yǎng)瓶中，使用無菌鑷將組織塊分散擺放至瓶皿并用鑷子輕輕按壓，使其與瓶底接觸牢固，培養(yǎng)瓶倒置，在另一側(cè)加入少量的含10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，放置在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中4 h（組織塊一側(cè)在上），待組織塊完全貼壁后，將培養(yǎng)瓶正放，添加適量的培養(yǎng)基使其完全浸潤組織塊。第3天開始半量換液，去除漂浮組織塊，此后每3～4 d更換1次新鮮培養(yǎng)液，直至組織塊周圍析出細(xì)胞達(dá)到80%左右，進(jìn)行細(xì)胞消化、傳代。取第3代對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，PBS清洗細(xì)胞，然后取1×106個(gè)細(xì)胞，分別加入藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）標(biāo)記的CD73、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的CD90、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的CD34和串聯(lián)染料PE-Cy7標(biāo)記的CD45抗體各5 μL，混勻室溫避光孵育15 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測CD73、CD90、CD34和CD45的表達(dá)情況。

1.3.3 外泌體提取與鑒定 hUC-MSCs無血清培養(yǎng)48 h后，收集上清液，嚴(yán)格按照exoEasy Maxi Kit試劑盒進(jìn)行操作，提取后0.22 μm濾膜過濾，Nanodrop2000檢測其濃度，分裝保存至-80 ℃。取20 μL hUC-MSCs-exos滴在碳支持膜銅網(wǎng)放置3～5 min，然后用濾紙吸去多余的液體，2%磷鎢酸滴在碳支持膜銅網(wǎng)放置2～3 min，用濾紙吸去多余液體，室溫干燥，透射電鏡下觀察hUC-MSCs-exos的形態(tài)。Western blot檢測hUC-MSCs-exos膜表面標(biāo)志性蛋白HSP70和TSG101的表達(dá)，hUC-MSCs-exos上樣量分別為40、80、100、150 μg。

1.3.4 外泌體攝取實(shí)驗(yàn) 使用PKH67熒光標(biāo)記hUC-MSCs-exos，嚴(yán)格按照PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit說明書操作，標(biāo)記后使用外泌體提取試劑盒重新提取外泌體，即得PKH67熒光標(biāo)記的外泌體。PCOS原代GCs常規(guī)培養(yǎng)鋪至12孔板中，24 h更換為新鮮培養(yǎng)基并加入PKH67熒光標(biāo)記的外泌體，對照組加入PBS，孵育12 h后，PBS洗細(xì)胞2～3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2～3次，用含DAPI的封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察hUC-MSCs-exos是否被PCOS GCs攝取。

1.3.5 Western blot檢測各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)情況 PCOS原代GCs培養(yǎng)至對數(shù)生長期后胰蛋白酶消化處理，將細(xì)胞分為3等份，分別標(biāo)記為A、B、C組。待細(xì)胞貼壁后A組加入PBS，B組加入hUC-MSCs上清液，C組加入hUC-MSCs外泌體，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2～3次，加入適量的SDS裂解液吹打混勻，4 ℃裂解30 min后收集細(xì)胞，Nanodrop 2000檢測蛋白濃度。加入5×loading buffer后95 ℃水浴變性5 min。取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-3一抗（1∶1 000），以及內(nèi)參β-actin一抗（1∶10 000），4 ℃冰箱孵育過夜。次日使用TBST漂洗3次，加入1∶5 000稀釋的山羊抗兔/鼠二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯色，用Image J軟件分析灰度值，比較各組蛋白相對表達(dá)量的變化。

1.3.6 GEO數(shù)據(jù)庫分析miR-1260a在hUC-MSCs-exos中的表達(dá) 從美國國家生物技術(shù)信息中心高通量基因表達(dá)（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載關(guān)于hUC-MSCs-exos的miRNAs數(shù)據(jù)集（GSE69909），進(jìn)一步從數(shù)據(jù)庫中獲取2 589個(gè)miRNAs，分析miR-1260a在hUC-MSCs-exos中的表達(dá)，并分析其與凋亡的關(guān)系。

1.3.7 外泌體miRNA的提取 使用exoRNeasy Maxi Kit試劑盒，嚴(yán)格按照說明書提取外泌體總RNA（包括miRNAs）。

1.3.8 qPCR檢測miR-1260a和CASP8 mRNA的表達(dá)水平 miR-1260a反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGTGG-3′；內(nèi)參U6：5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′。將1 μg RNA加至20 μL混合反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄至cDNA，然后進(jìn)行qPCR檢測及分析。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，包括cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR premix Ex Taq 10 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。分別以β-actin和U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCt值表示miR-1260a、CASP8相對表達(dá)量。定量引物序列見表1。

1.3.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將KGN細(xì)胞置于含10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞2×105個(gè)，待細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)，利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將miR-1260a mimics和mimics NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，具體轉(zhuǎn)染過程參考轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測顆粒細(xì)胞凋亡 2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，然后用預(yù)冷的PBS洗滌，按AnnexinV-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明分別加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD至各組細(xì)胞中，室溫避光孵育15 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測2組細(xì)胞凋亡情況。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 利用Target Scan Human 7.2在線預(yù)測miR-1260a的靶點(diǎn)，確認(rèn)miR-1260a與CASP8 3′非翻譯區(qū)（UTR）的特異結(jié)合區(qū)。將含有miR-1260a結(jié)合位點(diǎn)的野生型（wt）和突變型（mut）CASP8 3′UTR基因序列插入熒光素酶報(bào)告基因的載體pGL3上，構(gòu)建相應(yīng)的質(zhì)粒載體，然后將wt-CASP8、mut-CASP8分別與miR-1260a mimics、NC共轉(zhuǎn)染至KGN細(xì)胞中，24 h后收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測CASP8的熒光活性，以海腎的熒光活性作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)重復(fù)3次，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs的分離與鑒定 提取健康足月胎兒臍帶中的hUC-MSCs，細(xì)胞生長狀態(tài)如圖1A所示。傳至第3代，經(jīng)鑒定95%以上的細(xì)胞CD34和CD45為陰性，CD73和CD90為陽性，證實(shí)為hUC-MSCs，見圖1B。

2.2 hUC-MSCs-exos提取與鑒定 透射電鏡觀察hUC-MSCs-exos為直徑30～150 nm的圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，與外泌體結(jié)構(gòu)一致，見圖2A。Western blot結(jié)果顯示該囊泡高表達(dá)外泌體膜表面標(biāo)志性蛋白HSP70和TSG101，見圖2B。PKH67熒光標(biāo)記提取的外泌體，并將其與顆粒細(xì)胞共孵育12 h，發(fā)現(xiàn)PKH67標(biāo)記的外泌體可被PCOS GCs攝取，見圖2C。

2.3 hUC-MSCs-exos對PCOS GCs凋亡的影響 加入hUC-MSCs上清液或者外泌體后，PCOS GCs中Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-3和Bax的表達(dá)下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖3。

2.4 miR-1260a在hUC-MSCs-exos中的表達(dá)水平分析 GSE69909臨床樣本數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，miR-1260a在hUC-MSCs-exos中高度富集（圖4A）。qPCR結(jié)果顯示miR-1260a在hUC-MSCs及hUC-MSCs-exos中的表達(dá)均高于PCOS GCs（均P＜0.05），見圖4B。

2.5 miR-1260a對KGN顆粒細(xì)胞凋亡的影響 與NC組相比，miR-1260a mimics組KGN顆粒細(xì)胞的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 miR-1260a對CASP8基因的靶向調(diào)節(jié) 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，CASP8 3′-UTR序列上存在miR-1260a的結(jié)合位點(diǎn)（圖6A）。與NC組相比，miR-1260a mimics與CASP8 3′UTR野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性明顯下降（P＜0.01），miR-1260a mimics與CASP8 3′UTR突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6B。

2.7 PCOS顆粒細(xì)胞攝取hUC-MSCs-exos后miR-1260a和CASP8表達(dá)情況 qPCR檢測結(jié)果顯示，與PBS對照組相比，加入hUC-MSCs外泌體后PCOS顆粒細(xì)胞中miR-1260a表達(dá)升高，CASP8表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖7。

3 討論

PCOS是導(dǎo)致育齡期女性生殖障礙的常見疾病之一，其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。PCOS存在卵巢病變，其卵泡發(fā)育異常，即早期卵泡生長過多，發(fā)育停滯［13］。筆者前期研究［7］顯示，PCOS患者卵巢GCs中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)；與正常對照組相比，PCOS患者的獲卵數(shù)多，但MⅡ卵率、受精率及優(yōu)胚數(shù)低，提示PCOS患者GCs功能異常可能影響其卵泡發(fā)育，導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)降低。

外泌體作為MSCs的重要活性成分，具有良好的生物相容性、低毒和低免疫原性特點(diǎn)。本課題組前期在人臍帶中分離培養(yǎng)出hUC-MSCs，并進(jìn)一步成功提取了hUC-MSCs-exos。但目前MSCs方面的研究主要涉及卵巢早衰、卵巢功能不全、宮腔黏連等，在PCOS中的研究相對較少［14-15］。Yin等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢早衰小鼠體內(nèi)移植人胎盤MSCs后，血清中促性腺激素和雌激素表達(dá)水平顯著增加，顆粒細(xì)胞凋亡率降低，小鼠卵巢功能得到明顯改善。Ding等［17］利用人羊膜MSCs與自然衰老的GCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)GCs增殖率顯著升高，將其移植到自然衰老的小鼠模型中，小鼠的卵巢功能得到明顯改善，提示人羊膜MSCs可能通過調(diào)控GCs的功能阻止自然衰老卵巢功能的減退。Ling等［18］研究發(fā)現(xiàn)，將人羊膜MSCs注射入卵巢功能不全的大鼠體內(nèi)，大鼠的卵巢功能得到明顯改善。Kalhori等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS小鼠模型中，小鼠骨髓MSCs能夠通過調(diào)控免疫細(xì)胞抑制其炎癥反應(yīng)，有效改善PCOS小鼠癥狀，改善其卵巢功能。Xie等［20］也發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs可抑制PCOS小鼠卵巢局部和全身炎癥反應(yīng)，改善卵巢功能。以上研究提示MSCs可能通過調(diào)控PCOS微環(huán)境中不同細(xì)胞的功能，有效改善PCOS患者癥狀。GCs作為卵巢中重要細(xì)胞組分，在PCOS的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。筆者前期已經(jīng)證實(shí)hUC-MSCs-exos可以改善PCOS患者GCs的炎癥狀態(tài)［21］，提示hUC-MSCs-exos除影響PCOS患者GCs炎癥狀態(tài)外，還可能影響PCOS患者GCs的功能。本研究結(jié)果顯示，hUC-MSCs-exos可抑制PCOS患者GCs凋亡，表現(xiàn)為Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-3和Bax表達(dá)下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高。通過分析GSE69909臨床樣本，發(fā)現(xiàn)miR-1260a在hUC-MSCs-exos中高度富集。據(jù)報(bào)道，miR-1260a在多種腫瘤組織及細(xì)胞中呈高表達(dá)，并可通過多種途徑調(diào)控腫瘤進(jìn)展［22］。miR-1260b可通過靶向CASP8促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展［23］。Matsuda等［5］的研究表明PCOS卵泡發(fā)育與GCs功能密切相關(guān)，PCOS患者顆粒細(xì)胞功能失調(diào)將導(dǎo)致其卵泡發(fā)育異常。因此，hUC-MSCs-exos中miR-1260a可能通過影響GCs功能，進(jìn)而改善PCOS患者的卵泡發(fā)育。筆者進(jìn)一步通過生物信息分析網(wǎng)站找到miR-1260a調(diào)控的關(guān)鍵靶基因CASP8，并初步證實(shí)了miR-1260a與CASP8的靶向關(guān)系。Caspase-8是細(xì)胞凋亡外源激活途徑的關(guān)鍵啟動蛋白，激活的Caspase-8可導(dǎo)致Caspase蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，并進(jìn)一步激活Caspase-3和Caspase-6等蛋白，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［24］。有研究表明，F(xiàn)as/FasL/Caspase-8信號通路在脫氫表雄酮誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵泡閉鎖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［25］。本研究后續(xù)將會進(jìn)一步探究CASP8在PCOS進(jìn)展中的作用，詳細(xì)闡明hUC-MSCs-exos中miR-1260a影響PCOS進(jìn)展的作用機(jī)制。

綜上，hUC-MSCs-exos中miR-1260a通過靶向CASP8抑制PCOS卵巢GCs凋亡，進(jìn)而改善PCOS患者的卵泡發(fā)育，有望成為替代MSCs的一種無細(xì)胞治療策略，對改善PCOS發(fā)揮積極作用。

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（2022-07-06收稿 2022-10-21修回）

（本文編輯 李國琪）