李麗莉，呂軼峰，寧崇良，覃麗酈，白桂昌，何頌華

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質量監(jiān)測與評價重點實驗室，南寧 530021）

天王補心丸來源于明代洪基《攝生秘剖》天王補心丹，最早被《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)1977年版收載，現(xiàn)收載于中國藥典2020年版一部[1]，有大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸等劑型。天王補心丸由丹參、當歸、石菖蒲、黨參、茯苓、五味子、麥冬、天冬、地黃、玄參、制遠志、炒酸棗仁、柏子仁、桔梗、甘草、朱砂16 味藥材組成，具有滋陰養(yǎng)血，補心安神的功效。其中麥冬滋陰清熱，為方中臣藥?！吨袊幍洹分幸?guī)定麥冬的來源為百合科植物麥冬的干燥塊根[1]，山麥冬為百合科植物湖北麥冬或短葶山麥冬的干燥塊根。目前市場上由于麥冬需求量大，而山麥冬市場需求較少、產量大且與麥冬形態(tài)相近，有部分廠家以山麥冬代替麥冬或在麥冬中混入山麥冬為原料生產中成藥。雖然麥冬和山麥冬性狀相近，療效類似[2]，但現(xiàn)代研究表明兩者的化學成分和藥理作用具有一定區(qū)別[3-7]。鑒于古今麥冬藥用習慣、現(xiàn)代化學與藥理研究基礎和中醫(yī)臨床實際，《中國藥典》將麥冬和山麥冬歸屬為兩個不同的藥味，不允許二者混用。

根據文獻[8-11]記載，山麥冬皂苷B為湖北麥冬的特征性成分，短葶山麥冬皂苷C 為短葶山麥冬的特征性成分，而麥冬幾乎不含以上兩種成分。筆者以山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C 為指標性成分，建立天王補心丸中山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C的HPLC-MS/MS檢查方法，若樣品中檢出一定量的山麥冬皂苷B 或短葶山麥冬皂苷C，則認為存在以山麥冬替代麥冬投料的摻偽情況。該方法對于天王補心丸的規(guī)范生產以及質量安全具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串連三重四級桿質譜儀：Agilent 1290-6490型，美國安捷倫科技有限公司。

分析天平：(1) ML204 型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；(2) XS205型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-250DU 型，昆山超聲儀器有限公司。

超純水儀：Milli-Q型，美國密理博公司。

天王補心丸樣品：大蜜丸，市售。

山麥冬皂苷B 對照品：批號為111907-201103，中國食品藥品檢定研究院。

短葶山麥冬皂苷C 對照品：批號為111908-201102，中國食品藥品檢定研究院。

乙腈：色譜純，美國費希爾公司。

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜儀

色譜柱：Waters CORTECS?C18柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm，美國沃特世公司)；柱溫：35 ℃；進樣體積：1 μL；流動相：A相為0.1% (體積分數(shù)，下同)的甲酸溶液，B相為乙腈，流量為0.2 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.1 質譜儀

離子源：電噴霧電離源；掃描模式：正負離子同時掃描(ESI+/ESI-)；檢測方式：多重反應監(jiān)測(MRM)模式；干燥氣：氮氣，流量為12 L/min，溫度為350 ℃；霧化氣壓力：1.379×105Pa；鞘氣：氮氣，流量為11 L/min，溫度為350 ℃；毛細管電壓：4 kV；噴嘴電壓：500 V。山麥冬皂苷B和短亭山麥冬皂苷C質譜參數(shù)見表2。

表2 山麥冬皂苷B和短亭山麥冬皂苷C的質譜參數(shù)

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品溶液制備

取大蜜丸樣品，剪碎，混勻，取適量，精密稱定，加入兩倍量的硅藻土，研勻，取約4.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率為180 W，頻率為50 kHz) 30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻。精密吸取續(xù)濾液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至標線，搖勻，濾過，濾液作為樣品溶液。

1.3.2 陰性樣品溶液制備

按《中國藥典》2020年版一部天王補心丸處方，取除麥冬以外的15味藥材，按大蜜丸的配比和制備方法制成45 g不含麥冬成分的陰性對照制劑。取陰性對照制劑1 g，按1.3.1 樣品溶液制備方法制成不含麥冬成分的陰性樣品溶液。

1.3.3 對照制劑溶液制備

按《中國藥典》2020年版一部天王補心丸處方，以正品麥冬為原料，按大蜜丸的配比和制備方法制成45 g 對照制劑。取對照制劑1 g，按1.3.1 方法制成對照制劑溶液。

1.3.4 混合標準溶液制備

(1) 定量用混合標準溶液。取山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成含山麥冬皂苷B 9 ng/mL、短葶山麥冬皂苷C 120 ng/mL的混合溶液，作為定量用混合標準溶液。

(2) 系列混合標準工作溶液。分別稱取山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 對照品適量，精密稱定，以甲醇為溶劑，配制成山麥冬皂苷B 質量濃度分別為5.18、10.37、20.74、51.85、103.70、207.40 ng/mL，短葶山麥冬皂苷C 質量濃度分別為5.20、20.80、52.00、208.00、1040.00、2 080.00 ng/mL 的系列混合標準工作溶液。

1.3.5 定量方法

按1.2儀器工作條件測定，以定量用混合標準溶液為對照，以外標單點法定量。

2 結果與討論

2.1 樣品提取方法優(yōu)化

根據處方，樣品中含有質量分數(shù)為33.3%～47.2%的煉蜜，采用硅藻土與樣品混勻，可以達到去除蜂蜜干擾的目的。采用甲醇提取，與采用不同濃度的甲醇水溶液提取相比，可大幅度減少強極性雜質的提取量，且有利于樣品溶液在質譜中的霧化與離子化，使得靈敏度得到進一步的提高。

2.2 色譜條件與質譜條件優(yōu)化

比較了乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液3 種流動相體系，分別采用正、負離子模式進行掃描，發(fā)現(xiàn)當采用乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相時，電離模式為正離子模式時，山麥冬皂苷B 有較強的響應，母離子為m/z723.4，為[M+H]+；電離模式為負離子模式時，短葶山麥冬皂苷C 有較強的響應，母離子為m/z915.5，為[M+COOH]-。故采用0.1%甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，采用正、負離子模式同時測定，在保證靈敏度的同時，減少了流動相的用量。山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 和天王補心丸樣品檢測離子色譜圖如圖1所示。

圖1 山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對照品及天王補心丸樣品檢測離子色譜圖

2.3 專屬性試驗

在1.2 儀器工作條件下，分別取陰性樣品溶液、對照制劑溶液進行測定，色譜圖如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可以看出，陰性樣品和對照制劑色譜圖中均未出現(xiàn)與山麥冬皂苷B、短葶山麥冬C 對照品色譜保留時間相同的色譜峰，表明陰性樣品和對照制劑中共存成分對方法無干擾。

圖2 陰性樣品溶液監(jiān)測離子色譜圖

圖3 對照制劑溶液監(jiān)測離子色譜圖

2.4 線性關系考察

2.4.1 對照品線性

取1.3.4.中的系列混合標準工作溶液，在1.2 儀器工作條件下，分別進樣1 μL 進行測定，以目標物質量濃度(x)為橫坐標，色譜峰面積(y)為縱坐標繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數(shù)，結果見表3。由表3可知，山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C的質量濃度分別在5.18～207.4、5.2～2 080 ng/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)均為0.999 3。

表3 質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)

2.4.2 摻偽線性

在1.2儀器工作條件下，按天王補心丸(大蜜丸)的處方和制備方法，分別制備處方含量的5%、10%、20%、50%、80%、100%(質量分數(shù))摻湖北麥冬、短葶山麥冬樣品，按1.3.1方法配制成不同摻偽比例的樣品溶液，測定并計算色譜峰面積，以目標物摻偽質量分數(shù)(x)為橫坐標，以色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性方程和相關系數(shù)，結果見表4。由表4 數(shù)據可知，麥冬摻偽(湖北麥冬、短葶山麥冬)質量分數(shù)在5%～100%范圍內與色譜峰峰面積線性關系良好，可以準確定量。

表4 天王補心丸中湖北麥冬和短葶山麥冬摻入質量分數(shù)線性范圍、線性方程、相關系數(shù)

2.5 方法檢出限

取摻偽樣品溶液，不斷稀釋并測定，以信噪比為3 對應的樣品中目標物的質量分數(shù)作為方法檢出限，得山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C的檢出限分別為56、134 ng/g。

2.6 精密度試驗

取6份不含山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C的樣品，各4.5 g，分別精密加入山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 的質量濃度分別為4.14、4.16 μg/mL 的混合標準溶液0.1 mL，按1.3.1方法制備成同時含有山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C的樣品溶液，分別測定，結果列于表5。由表5可知，山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 6次測定值的相對標準偏差分別為2.57%、5.27%，表明該方法精密度良好。

表5 精密度試驗結果

2.7 穩(wěn)定性試驗

取摻偽樣品溶液1 份，分別于溶液配制后第0、4、8、12、16、20、24 h進樣測定，色譜峰面積測定結果列于表6。由表6 可知，24 h 內山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C色譜峰峰面積測定值的相對標準偏差分別為3.67%、3.93%，表明樣品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

表6 不同放置時間時色譜峰面積測定結果

2.8 加標回收試驗

精密稱取陰性對照制劑約4.5 g，平行稱取9份，分別精密加入高、中、低不同質量濃度水平的山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C混合標準溶液各0 mL，按1.3.1 方法制備加標樣品溶液，每種溶液分別測定3次，結果列于表7。由表7數(shù)據可知，山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 的平均回收率分別為99.16%、101.54%，表明該方法準確度較高。

3 結語

中藥材是中成藥生產的基礎物質，其質量狀況將會直接影響藥品質量，隨著中藥產業(yè)的發(fā)展及中藥材資源的短缺，中藥的質量問題屢屢發(fā)生。中藥制劑中，以山麥冬代替麥冬作為料的現(xiàn)象常見報道[12-17]，說明藥品生產企業(yè)對中藥制劑的原料把控缺失，企業(yè)質檢人員缺乏一定的鑒別能力或企業(yè)存在失信的行為，需引起相關技術部門和監(jiān)管部門的注意。采用HPLC-MS/MS 法測定天王補心丸中山麥冬專屬性強，靈敏度高，可以簡化樣品處理過程，提高檢測準確性。通過優(yōu)化梯度洗脫程序與質譜條件，采用MRM 模式，正負離子同時測定，節(jié)省了測定時間，為藥品質量監(jiān)督提供了技術支持。