徐 佳,馮昆鵬,張智強(qiáng),王穎賽

(雄安創(chuàng)新研究院,河北雄安新區(qū) 071700)

蘆葦是一種大型多年生禾本植物,在雄安新區(qū)白洋淀的濕地環(huán)境中廣泛生長(zhǎng),其地上部分高度能達(dá)到6 m,可通過(guò)種子傳播或根莖分生繁殖,在短時(shí)間內(nèi)積累大量的生物量[1]。目前,當(dāng)?shù)貙⑻J葦平衡收割后主要用于造紙和發(fā)電,經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低,導(dǎo)致農(nóng)戶(hù)收割積極性不高,棄收的蘆葦如不開(kāi)發(fā)利用,將會(huì)給白洋淀帶來(lái)新的環(huán)境污染。纖維素和半纖維素是蘆葦秸稈中的主要成分,其總含量在60%以上[2],經(jīng)過(guò)物理和化學(xué)預(yù)處理,在纖維素酶的催化作用下,可水解為五碳糖和六碳糖為主的糖液,該水解液可用作微生物發(fā)酵的碳源,制備生物化工、生物材料、生物能源、生物醫(yī)藥等產(chǎn)品[3-4]。

γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是由L型和D型谷氨酸單體通過(guò)γ-羧基與α-氨基間的γ-酰胺鍵聚合而成的一種多肽分子[5],通常由500～5 000個(gè)谷氨酸單體組成,分子質(zhì)量在100～1 000 kD之間[6]。γ-PGA是一種具有良好水溶性、能被生物降解且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害的高分子多肽[7],可作為保濕劑、增效劑、增稠劑、緩釋劑、防凍劑、醫(yī)藥載體、高吸水樹(shù)脂、生物絮凝劑和重金屬吸附劑,廣泛用于農(nóng)業(yè)、化妝品、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[8-9]。

由于γ-PGA生產(chǎn)成本較高,因而阻礙了其廣泛應(yīng)用。葡萄糖和蔗糖是大多數(shù)芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)γ-PGA的常用碳源,近年來(lái)人們開(kāi)始探索利用廉價(jià)的可再生資源來(lái)生產(chǎn)γ-PGA,如糖蜜、粗甘油、玉米秸稈等[10-12]。李海軍等[13]利用350 g/L的甜菜糖蜜作為碳源,發(fā)酵64 h后聚谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到45.34 g/L。陳鵬程等[14]采用玉米秸稈水解液,以補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式,培養(yǎng)54 h后得到的γ-PGA產(chǎn)量為25.60 g/L。這些成果為將蘆葦水解液作為生產(chǎn)γ-PGA的廉價(jià)營(yíng)養(yǎng)源提供了研究依據(jù),但γ-PGA發(fā)酵周期較長(zhǎng)、產(chǎn)率不高的問(wèn)題有待解決。

本研究以蘆葦水解糖液為原料制備γ-PGA,設(shè)計(jì)不同的補(bǔ)料策略,以5 L發(fā)酵罐上的DO值為反饋參數(shù),建立發(fā)酵工藝優(yōu)化補(bǔ)料策略,在較短發(fā)酵周期內(nèi)提升菌體生產(chǎn)γ-PGA的能力,實(shí)現(xiàn)蘆葦秸稈向天然高分子多聚氨基酸的轉(zhuǎn)化,為利用蘆葦?shù)攘畠r(jià)可再生原料發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的工業(yè)應(yīng)用提供科學(xué)方法。

1 材料、設(shè)備和方法

1.1 材料

菌株為雄安創(chuàng)新研究院保藏的枯草芽孢桿菌XII-PBS004;蘆葦取自河北雄安新區(qū)白洋淀;氫氧化鈉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、谷氨酸鈉等試劑,均為分析純;纖維素酶(Cellic CTec3,Novozymes)。

1.2 設(shè)備

HZQ-X500C恒溫?fù)u床,上海一恒科學(xué)儀器有限公司提供;BLBIO-5GJ發(fā)酵罐,百侖生物科技(江蘇)有限公司提供;UV-1800紫外分光光度計(jì),上海菁華公司提供;SBA-40E生物傳感儀,山東省科學(xué)院生物研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 蘆葦水解液制備

1)預(yù)處理

將蘆葦除塵去雜后晾干并切割至5 cm左右的碎段,按照進(jìn)料濃度25%(質(zhì)量體積比,下同)加至雙螺桿擠壓浸漬機(jī)中,控制螺桿轉(zhuǎn)速為150 r/min進(jìn)行處理,擠壓后將試樣進(jìn)行堿處理。處理?xiàng)l件:KOH用量4%,保溫溫度90 ℃,保溫時(shí)間2 h,預(yù)處理后將試樣水洗至中性進(jìn)行酶解試驗(yàn)。

2)酶解

將上述預(yù)處理蘆葦進(jìn)行酶水解,設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn),纖維素酶(Cellic CTec 3)的用量分別為5,10,15,20和25 FPU/g(底物),底物濃度分別為5%,10%,15%和20%(以預(yù)處理后絕干蘆葦計(jì)),反應(yīng)時(shí)間為48 h,酶解體系用0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為4.8,在50 ℃條件下,150 r/min水浴恒溫振蕩處理。水解結(jié)束后煮沸10 min,于12 000 r/min離心10 min,取上清液,測(cè)定還原糖含量。

1.3.2 培養(yǎng)基配制

1)種子培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NH4Cl 2.5 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO40.4 g/L,pH 值為7.0,于115 ℃滅菌20 min。

2)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基

CaCl23 g/L,K2HPO44.5 g/L,MgSO41.5 g/L,NaCl 5 g/L,玉米漿15 g/L,酵母粉5 g/L,檸檬酸鈉20 g/L,NH4Cl 17 g/L,MnSO40.05 g/L,FeSO40.02 g/L,pH值為 7.4,于115 ℃滅菌20 min。

1.3.3 種子培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌XII-PBS004的斜面菌種接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,于36.5 ℃,200 r/min培養(yǎng)12 h,得到種子培養(yǎng)液。

1.3.4 分批發(fā)酵培養(yǎng)

使用5 L攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行分批發(fā)酵,按5%的接種量將種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng),攪拌轉(zhuǎn)速為800 r/min,通氣為8 L/min,培養(yǎng)溫度恒定為36.5 ℃,發(fā)酵周期為36 h。在發(fā)酵過(guò)程中在0 h一次性補(bǔ)加滅菌后的蘆葦水解液(其總還原糖的質(zhì)量濃度為600 g/L)和谷氨酸鈉溶液(谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度為600 g/L),控制總糖和谷氨酸鈉的最終質(zhì)量濃度均為60 g/L。

1.3.5 分段式分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)

使用5 L攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行分段式分批補(bǔ)料發(fā)酵,按5%的接種量將種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng),攪拌轉(zhuǎn)速為800 r/min,通氣8 L/min,培養(yǎng)溫度恒定為36.5 ℃,發(fā)酵周期為36 h。在發(fā)酵周期0 h時(shí)連續(xù)流加滅菌后蘆葦水解液,用來(lái)維持發(fā)酵液中的總糖質(zhì)量濃度分別為60,40,20,10,5 g/L,直至發(fā)酵結(jié)束。在發(fā)酵周期13 h開(kāi)始恒速流加滅菌后谷氨酸鈉溶液,控制流加速度為15 mL/h,攪拌轉(zhuǎn)速為800 r/min,通氣為8 L/min,培養(yǎng)溫度恒定為36.5 ℃,發(fā)酵周期為36 h。

1.3.6 恒定pH值分段式分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)

使用5 L攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行恒定pH值分段式分批補(bǔ)料發(fā)酵,方法同1.3.4,其中的區(qū)別為發(fā)酵周期0 h時(shí)連續(xù)流加滅菌后蘆葦水解液,維持發(fā)酵液中的總糖質(zhì)量濃度為10 g/L直至發(fā)酵結(jié)束,并用20%磷酸和20%氫氧化鈉維持發(fā)酵體系pH值恒定,分別為6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,直至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.7 分段式溶氧反饋-分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)

使用5 L攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行分段式溶氧反饋-分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng),通氣為8 L/min,培養(yǎng)溫度恒定為36.5 ℃,pH值恒定為6.8。發(fā)酵初始,一次性加入滅菌后蘆葦水解液至發(fā)酵液中總糖最終質(zhì)量濃度為10 g/L。發(fā)酵罐采用溶氧反饋關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)速和補(bǔ)料控制模式,攪拌轉(zhuǎn)速下限設(shè)定為200 r/min,上限設(shè)定為800 r/min。發(fā)酵周期0～12 h時(shí),溶氧上限設(shè)定為40%,下限設(shè)定為20%,當(dāng)溶氧高于40%時(shí)開(kāi)始流加蘆葦水解液,溶氧低于20%時(shí)停止流加;發(fā)酵周期13～36 h時(shí),溶氧上限設(shè)定為25%,下限設(shè)定為15%,當(dāng)溶氧高于25%時(shí)開(kāi)始同步流加蘆葦水解液和谷氨酸鈉溶液,溶氧低于15%時(shí)停止流加。

1.3.8 檢測(cè)方法

還原糖濃度測(cè)定:采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[15]測(cè)定還原糖濃度。

生物量的測(cè)定:將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后,以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照,用可見(jiàn)分光光度計(jì)于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,以O(shè)D600反映菌體生長(zhǎng)狀況[16]。

發(fā)酵液中谷氨酸含量測(cè)定:使用生物傳感分析儀SBA-40E進(jìn)行測(cè)量。

γ-PGA產(chǎn)量的測(cè)定:采用十六烷基甲基溴化銨(CTAB)比濁法測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量,配置不同濃度γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)溶液,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取5 mL發(fā)酵液,于12 000 r/min 離心20 min。取3 mL上清液,加入9 mL無(wú)水乙醇使γ-PGA沉淀,并將混合物在4 ℃下保持過(guò)夜后于12 000 r/min離心20 min,棄上清液,將沉淀用2 mL去離子水充分溶解后與2 mL CTAB于室溫下反應(yīng)3 min,在400 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算γ-PGA濃度[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶用量及底物濃度對(duì)蘆葦酶解的影響

纖維素酶的用量和底物濃度對(duì)木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)水解影響很大,需考慮在較低的酶負(fù)載量下獲得較高的酶解效率。由圖1可知,隨著酶用量的增加,蘆葦纖維水解得到的還原糖增多,但當(dāng)纖維素酶添加量從10 FPU/g(底物)進(jìn)一步提升時(shí),增長(zhǎng)幅度趨于減緩。這主要是由于酶量過(guò)大引起競(jìng)爭(zhēng)性抑制[18],以及木質(zhì)素對(duì)酶的無(wú)效吸附所導(dǎo)致的。較高的底物濃度雖然可以降低成本,提高水解液總糖濃度,但底物濃度過(guò)高時(shí),反應(yīng)體系中的游離水將被限制于蘆葦中,導(dǎo)致傳質(zhì)困難,影響酶擴(kuò)散到底物的結(jié)合位點(diǎn)上,同時(shí)引起水解液中糖濃度的升高,對(duì)水解產(chǎn)生抑制作用。從圖2中可以看出,蘆葦纖維酶解的最適底物濃度為10%,在10 FPU/g(底物)的纖維素酶添加量作用下,水解液中還原糖質(zhì)量濃度可達(dá)(76.64±1.74)g/L。

圖1 不同纖維素酶用量對(duì)蘆葦酶解的影響Fig.1 Effects of different cellulase dosages on enzymatic hydrolysis of reed

圖2 不同底物濃度對(duì)蘆葦酶解的影響Fig.2 Effects of different substrate concentrations on enzymatic hydrolysis of reed

2.2 分批發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)菌體生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量的影響

利用蘆葦水解液對(duì)谷氨酸依賴(lài)型菌株枯草芽孢桿菌XII-PBS004進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)36 h,γ-PGA產(chǎn)量達(dá)到(32.62±1.22)g/L,生產(chǎn)效率為(0.89±0.03)g/(L·h)。如圖3所示,發(fā)酵過(guò)程中pH值波動(dòng)比較大,不利于菌體生長(zhǎng)和γ-PGA的合成[19]。發(fā)酵液中蘆葦水解糖和谷氨酸鈉隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減少,在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期消耗較快,發(fā)酵終止時(shí)仍有較高殘留。蘆葦水解液中含有機(jī)酸和酚類(lèi)細(xì)胞毒性抑制物,當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度過(guò)高時(shí),影響菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物表達(dá)。此外,由于谷氨酸鈉的初始添加導(dǎo)致發(fā)酵液黏度在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期急劇提升,出現(xiàn)氧轉(zhuǎn)移限制和混合效率低的問(wèn)題,阻礙了菌體生物量的增加。由于分批發(fā)酵工藝條件的不適合,致使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和前體物質(zhì)的利用效率低,菌體生物量和γ-PGA的產(chǎn)量不高,因而有必要通過(guò)調(diào)整發(fā)酵控制策略,進(jìn)一步提高發(fā)酵性能。

圖3 蘆葦水解液分批發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA過(guò)程中參數(shù)變化情況Fig.3 Changes of parameters in the process of batch fermen-tation of reed hydrolysate to produce γ-PGA

2.3 分段式分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)菌體生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量的影響

基于分批發(fā)酵培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題,提出分段式分批補(bǔ)料的培養(yǎng)方式,在菌體生長(zhǎng)期通過(guò)流加蘆葦水解液維持較低的糖濃度,并以谷氨酸鈉恒速補(bǔ)料的方式在菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期階段提供γ-PGA合成的前體物質(zhì),考察發(fā)酵過(guò)程中維持不同水解液糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量的影響。由圖4可知,當(dāng)發(fā)酵液中糖質(zhì)量濃度維持在10 g/L水平時(shí),菌體生物量OD600提升了45.76%,γ-PGA的發(fā)酵水平達(dá)到(37.72±0.03)g/L。發(fā)酵過(guò)程中控制較低的糖濃度,可使毒性抑制物一開(kāi)始處于較低的濃度,保證菌株的生長(zhǎng)活力,并促進(jìn)毒性物質(zhì)在菌株體內(nèi)被還原成低毒性物質(zhì),提高菌株的耐受性。在適當(dāng)時(shí)間補(bǔ)加谷氨酸鈉,除了可以避免前期發(fā)酵液黏度較高影響溶氧和傳質(zhì),還可以消除過(guò)高谷氨酸濃度對(duì)PGA合成酶的抑制。糖質(zhì)量濃度控制在5 g/L時(shí)結(jié)果不佳,可能是由于補(bǔ)料操控難度較大引起發(fā)酵液中糖濃度波動(dòng)過(guò)大。

圖4 蘆葦水解液分段式分批發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of segmented batch fermentation of reed hydrolysate on bacterial growth and γ-PGA yield

2.4 恒定pH值分段式分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

相關(guān)研究表明,中性pH值條件有利于菌株生長(zhǎng)和γ-PGA的合成,pH值顯著影響細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)攝取、酶活性和細(xì)胞膜形態(tài),從而影響代謝產(chǎn)物的形成[20]。如圖5所示,維持發(fā)酵液pH值為6.8時(shí),獲得的最高菌體生物量和γ-PGA產(chǎn)量表明,該pH值適合菌體生長(zhǎng)并影響其代謝,對(duì)γ-PGA的合成與釋放有正向作用。

圖5 蘆葦水解液恒定pH值分段式分批發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)和γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of segmented batch fermentation of reed hydrolysate at constant pH on bacterial growth and γ-PGA yield

2.5 分段式溶氧反饋-分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

蘆葦水解液制備γ-PGA屬于高黏度好氧發(fā)酵,溶氧是該類(lèi)型發(fā)酵過(guò)程中一個(gè)重要影響因素。本研究提出了分段式DO-stat分批補(bǔ)料發(fā)酵控制方法,基于DO值在線(xiàn)反饋,用以控制攪拌轉(zhuǎn)速以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和前體物質(zhì)的流加速度,當(dāng)?shù)孜镞^(guò)度消耗,DO值趨于增加時(shí)開(kāi)始自動(dòng)補(bǔ)料,DO值降低時(shí)減緩進(jìn)料速率,進(jìn)而維持恒定的DO水平,并保持氧消耗和供應(yīng)之間的平衡。在發(fā)酵過(guò)程中溶解氧水平直接影響不同酶的合成,導(dǎo)致細(xì)胞代謝的變化。采用分段式DO-stat分批補(bǔ)料發(fā)酵,可以保持較低的底物濃度,減少反饋抑制,加強(qiáng)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)途徑在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的能量[24]。與分批補(bǔ)料發(fā)酵相比,菌體最高生物量和γ-PGA產(chǎn)量分別提高64.32%和43.22%,水解糖液和谷氨酸鈉的利用率得到提升,發(fā)酵液中兩者的殘留大幅降低(見(jiàn)圖6)。本研究與國(guó)內(nèi)外利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的工藝相比,具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)量高、生產(chǎn)速率大的優(yōu)勢(shì)(見(jiàn)表1)。

表1 利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的對(duì)比Tab.1 Comparison of the production of γ-PGA by fermentation of lignocellulosic hydrolysates

圖6 蘆葦水解液分段式溶氧反饋-分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA過(guò)程中參數(shù)變化情況Fig.6 Changes of parameters in the process of segmented DO feed-back control of fed-batch fermentation to produce γ-PGA by reed hydrolysate

3 結(jié) 論

本文在考察蘆葦纖維最佳酶解條件的基礎(chǔ)上,對(duì)枯草芽孢桿菌利用蘆葦水解液發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA進(jìn)行了研究,優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件。

1)蘆葦經(jīng)雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理后,在纖維素酶用量為10 FPU/g(底物)和10%底物濃度的條件下,水解后還原糖質(zhì)量濃度可達(dá)(76.64±1.74)g/L,可為菌株發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA提供廉價(jià)碳源。

2)分段式分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式有利于減少底物濃度和水解液中毒性物質(zhì)對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制,在發(fā)酵周期13 h時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料加入谷氨酸鈉則有利于降低發(fā)酵液前期黏度,提高溶氧及傳質(zhì),削弱其對(duì)γ-PGA合成的抑制。將發(fā)酵過(guò)程中的pH值恒定為6.8,能進(jìn)一步達(dá)到促進(jìn)菌體繁殖、產(chǎn)物積累的雙重目的,與分批發(fā)酵模式相比,菌體生物量和γ-PGA產(chǎn)量分別提高56.40%和24.52%。

3)基于溶氧對(duì)聚谷氨酸發(fā)酵的重要性,設(shè)計(jì)并優(yōu)化了分段式溶氧反饋-分批補(bǔ)料發(fā)酵調(diào)控策略,其比分批發(fā)酵有明顯優(yōu)勢(shì),增強(qiáng)了菌株生長(zhǎng)水平和γ-PGA代謝及釋放能力,最高菌體生物量OD600由22.20±0.88提高至36.48±1.62,發(fā)酵36 h后γ-PGA的產(chǎn)量可達(dá)到(46.72±1.18)g/L,發(fā)酵生產(chǎn)效率由(0.89±0.03)g/(L·h)提升至(1.30±0.03)g/(L·h)。

4)以蘆葦水解糖液為原料發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA,可為蘆葦原料化高效利用、降低γ-PGA生產(chǎn)成本提供一種新的途徑,具有較高的商業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值。

蘆葦水解液可作為廉價(jià)碳源用于發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA。本研究中建立的分段式溶氧反饋-分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)調(diào)控策略,可以有效提高菌體生物量和γ-PGA產(chǎn)量。但對(duì)該發(fā)酵體系下諸如初始底物濃度等參數(shù)的優(yōu)化還不全面,后續(xù)研究將對(duì)其進(jìn)行深入分析,研究蘆葦水解液中葡萄糖與木糖對(duì)菌體生長(zhǎng)和γ-PGA合成的影響,從而進(jìn)一步提高γ-PGA產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本。