韓麗云,李艷艷,馬 云,虎紅紅,康小龍,郭殿芝,史遠剛
(1.寧夏大學農(nóng)學院,銀川 750021;2.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司,銀川 750021)
【研究意義】新疆褐牛是我國自主培育的乳肉兼用型地方牛種,具有耐寒耐熱的特性,分布于我國新疆伊犁、阿勒泰、塔城、昌吉、哈密和南疆等地。研究新疆褐牛體尺性狀基因,關(guān)聯(lián)關(guān)系對新疆褐牛的育種有實際意義?!厩叭搜芯窟M展】過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)家族是一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的總稱,在脂質(zhì)代謝、胰島素信號通路、葡萄糖代謝和脂肪細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用[1]。PPARs涵蓋了三種亞型,包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ;其中,PPARγ是一種多功能的蛋白質(zhì),具有脂肪專一性[2],保障脂肪組織能量始終處于穩(wěn)定狀態(tài),并調(diào)控多種基因表達,參與脂肪細胞分化和脂代謝[3]。MYF5屬于MRFs(Myogenic factors)轉(zhuǎn)錄因子家族,MRFs家族包括MyoD、MyoG、MYF5和MYF6[4],MRFs家族成員均含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu),可以識別并結(jié)合E-box[5]。MYF5蛋白在哺乳動物中高度保守,是調(diào)節(jié)骨骼肌前體分化的轉(zhuǎn)錄因子級聯(lián)中的第一個,在骨骼肌生長、發(fā)育分化[6]中發(fā)揮重要作用,可以影響畜禽的產(chǎn)肉[7]、肉質(zhì)和風味[8]等。磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferase,AGPAT)可以有效優(yōu)化三酰甘油,進而促進合成,屬于重要的關(guān)鍵酶[9,10]?!颈狙芯壳腥朦c】目前共發(fā)現(xiàn)11種AGPAT的亞型;除擬南芥外,AGPAT在所有物種中都具有高度的保守性[11]。AGPAT與牛的出欄重、宰前重、胴體重和凈肉重均存在顯著相關(guān)[12],參與脂肪酸氧化、生物合成和脂肪儲存等[13]。需研究鑒定與牛體尺性狀相關(guān)的基因?!緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選PPARγ、MYF5和AGPAT5基因的6個SNP位點,在褐牛群體中進行基因型分型,并進行SNP水平和單倍型水平的關(guān)聯(lián)分析及生物信息學分析,研究基因PPARγ、MYF5和AGPAT5與牛性狀的關(guān)系,為新疆褐牛的分子育種提供標記信息。
試驗群體由54頭新疆褐牛公牛和45頭新疆褐牛閹牛組成,試驗牛均飼養(yǎng)在新疆塔城地區(qū)。試驗牛12月齡時,采集每頭試驗牛的尾根靜脈血樣10 mL,隨后將樣本置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1 測 量
試驗牛10~16月齡間,測量每頭試驗??崭範顟B(tài)下的十字部高、胸寬、胸圍、體長和體重等性狀[14]。
1.2.2 血液DNA提取
使用DNA試劑盒提取試驗牛的基因組DNA,采用Nanodrop-2000型核酸分析儀檢測DNA樣品的純度和濃度。
1.2.3 引物設(shè)計
利用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)得到牛PPARγ,MYF5和AGPAT5的基因序列,并采用PremierPrimer5.0和Oligo6.0軟件對基因的目標區(qū)域進行引物設(shè)計,引物由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司合成。表1
表1 引物序列
1.2.4MYF5、PPARγ和AGPAT5目標片段擴增及測序
1.2.5 PCR產(chǎn)物酶切處理
采用1.5%凝膠將4μL PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳(80V條件下電泳30 min),37℃完成水浴處理,時間為16 h。在PCR中完成擴增處理,其質(zhì)量為8.0 μL。在限制性條件下,完成內(nèi)切酶0.5 μL的處理,以及配置10×New EnglandBiolabs公司酶緩沖液,體積為2.0 μL,最后配置9.5 μL的雙蒸水。
取8 μL酶切產(chǎn)物用2%凝膠進行凝膠電泳,80V條件下電泳15 min,在120V環(huán)境中完成電泳處理,時間為15 min,通過凝膠成像儀完成觀察,并且將最終的結(jié)果實施測序處理。
通過DNAMAN、Chromas進行序列的比對分析,并且使用PIC軟件PIC,基因型頻率等。使用SAS 8.0軟件單因素方差分析相關(guān)性。
使用RNA fold web server網(wǎng)站預(yù)測mRNA的二級結(jié)構(gòu),使用PredictProtein軟件確定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。對于染色體的定位,使用MapGene2Chromosome v2完成預(yù)期判斷?;赟NP的連鎖不平衡情況,使用Haploview4.2構(gòu)建單倍型。
研究表明,目標基因PPARγ、MYF5和AGPAT5的6個片段擴增產(chǎn)物長度與目的基因大小相符,特異性良好。圖1
注:M代表Marker,P1代表PPARγ-exon7,P2表示PPARγ-intron2,P3表示MYF5-exon1,P4表示MYF5-intron1,P5表示AGPAT5-exon7,P6表示AGPAT5-intron3。
2.2.1 PPARγ-exon7突變
研究表明,PPARγ-exon7的擴增片段大小為417 bp,經(jīng)酶切分型發(fā)現(xiàn)突變位點存在2種基因型,即AA型和AB型,并將為SNP1。exon7-74 bp存在突變,測序和酶切分型的結(jié)果可以互相印證。圖2,圖3
圖2 PPARγ-exon7-74測序結(jié)果
圖3 PPARγ-extron7的PCR-RFLP電泳結(jié)果
2.2.2 PPARγ-intron2突變
研究表明,PPARγ-intron2的擴增片段大小為1 090 bp,經(jīng)酶切分型發(fā)現(xiàn)突變位點存在3種基因型,即AA型、AB型和BB型,并將為SNP2。PPARγ-intron2存在2個突變位點,分別在intron2-133 bp(G/C)和intron2-170 bp(C/T),測序與酶切分型的結(jié)果可以互相印證。圖4,圖5
圖4 PPARγ-intron2的測序結(jié)果
圖5 PPARγ-intron2的PCR-RFLP電泳結(jié)果
2.3.1 MYF5-exon1突變
研究表明,MYF5-exon1擴增片段大小為666 bp,經(jīng)酶切分型發(fā)現(xiàn)突變位點存在2種基因型,即AA型和AB型,并將為SNP3。MYF5-exon1存在1個突變位點,為exon1-236 bp(T/C)。測序結(jié)果與酶切的分型結(jié)果一致。圖6,圖7
圖6 MYF5-外顯子1的測序結(jié)果
圖7 MYF5-外顯子1的PCR-RFLP電泳結(jié)果
2.3.2 MYF5-intron1突變
研究表明,MYF5-intron1擴增片段大小為897 bp,突變位點存在2種基因型,即AA型和AB型,并將此處定為SNP4。MYF5-intron1存在1個突變位點,為intron1-633 bp(A/G)。測序結(jié)果與酶切的分型結(jié)果一致。圖8、圖9
圖8 MYF5-內(nèi)含子1的測序結(jié)果
圖9 MYF5-內(nèi)含子1的PCR-RFLP電泳結(jié)果
2.4.1 AGPAT5-intron3突變
研究表明,AGPAT5-intron3擴增片段大小為997 bp,經(jīng)酶切分型發(fā)現(xiàn)突變位點存在3種基因型,即AA型、AB型和BB型,并將定為SNP5。AGPAT5-intron3存在3個突變位點,分別為intron3-501 bp(G/C)、intron3-515 bp(G/T)和intron3-550 bp(G/T)。測序結(jié)果與酶切的分型結(jié)果一致。圖10、圖11
圖10 AGPAT5-內(nèi)含子3的測序結(jié)果
圖11 AGPAT5-內(nèi)含子3的PCR-RFLP電泳結(jié)果
2.4.2 AGPAT5-exon7突變
研究表明,AGPAT5-exon7擴增片段大小為724 bp,經(jīng)突變位點存在3種基因型,即AA型、AB型和BB型,并將為SNP6。AGPAT5-exon7存在2個突變位點,分別為AGPAT5-exon7-72 bp(G/A)和AGPAT5-exon7-97 bp(A/G)。測序結(jié)果與酶切的分型結(jié)果一致。圖12、圖13
圖12 AGPAT5-外顯子7的測序結(jié)果
圖13 AGPAT5-外顯子7的PCR-RFLP電泳結(jié)果
研究表明,6個SNP位點中,共有4個SNP位點處于哈代-溫伯格平衡(P> 0.05)SNP4和SNP6偏離了哈代-溫伯格平衡(P< 0.05)。在SNP1、SNP2、SNP3和SNP6中,AA型為優(yōu)勢基因型,基因型頻率分別為0.85、0.51、0.96和0.73;AB優(yōu)勢基因型,基因頻率分別為0.760.55。位點SNP1、SNP3的PIC小于0.25,為低度多態(tài);位點SNP2、SNP4、SNP5和SNP6的PIC值處于0.25~0.5,為中度多態(tài)。表2
表2 6個SNPs位點基因頻率、基因型頻率以及檢驗
研究表明,SNP1位點不同基因型的個體之間,胸圍和體重有極顯著差異(P<0.01),AA型個體的胸圍和體重均極顯著低于AB型(P< 0.01)。SNP2位點不同基因型的個體之間,體重存在極顯著差異,AB型個體的體重極顯著高于AA和BB型個體(P< 0.01)。SNP3沒有顯著差異。SNP4位點中,不同基因型的個體之間,胸寬有顯著差異,AA型個體胸寬顯著低于AB型個體。SNP5位點不同基因型的個體之間,體長、胸圍、胸寬體重有顯著差異,AB型個體體長顯著低于BB型個體(P<0.05),AA和AB型個體胸圍、胸寬體重顯著高于BB型個體(P<0.01)。SNP6位點中,不同基因型之間,胸圍、胸寬均有顯著差異,AA型和AB型個體胸圍顯著高于BB型個體(P<0.01),AA和BB型個體胸寬極顯著低于AB型個體(P<0.01)。表3
表3 目標基因6個SNPs位點與體尺性狀的關(guān)聯(lián)(最小二乘均值±標準誤)
2.7.1 PPARγ-exon7(74)-intron2(133、170)
研究表明,基于連鎖不平衡,PPARγ-exon7(74)-intron2(133、170)構(gòu)建了一個單倍型塊,共包含5種單倍型,GGC為優(yōu)勢單倍型(0.417 7)。該單倍型塊對胸寬和十字步高分別有極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)的影響。GCT型個體的胸寬極顯著小于GCC、GGT和TCT型(P<0.01),顯著小于GGC型個體(P<0.05);TCT型個體的十字部高顯著低于GCT和GCC型(P<0.05)。表4
表4 PPARγ-exon7(74)-intron2(133、170)與體尺性狀的關(guān)聯(lián)(最小二乘均值±標準誤)
2.7.2 MYF5-exon1(236)-intron1(633)分析
研究表明,基于連鎖不平衡,MYF5-exon1(236)-intron1(633)構(gòu)建了一個單倍型塊,共包含3種單倍型,TG為優(yōu)勢單倍型(0.725 2)。該單倍型塊對體長和胸寬有顯著影響(P<0.05)對胸圍、十字部高和體重有極顯著影響(P<0.01)。CG型個體的體長顯著高于TG型(P<0.05),胸圍和體重極顯著高于TA和TG型個體(P<0.01),TA型個體的胸寬和十字部高分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)低于TG型個體。表5
表5 MYF5-exon1(236)-intron1(633)與體尺性狀的關(guān)聯(lián)(最小二乘均值±標準誤)
2.7.3 AGPAT5-exon7(72、97)-intron3(501、515、550)
研究表明,基于連鎖不平衡,AGPAT5-exon7(72、97)-intron3(501、515、550)構(gòu)建了一個單倍型塊,共包含6種單倍型,GTCTT為優(yōu)勢單倍型(0.390 6)。AGCTT型個體的體長極顯著低于AAGGG、ATGGG、GGGGG、GTGGG型(P<0.01),而AAGGG型個體的體長顯著高于ATGGG、GGGGG、GTCTT、GTGGG型(P<0.05)。AGCTT型個體的胸圍極顯著低于其他單倍型(P<0.01),GGGGG型個體顯著低于GTGGG型(P< 0.05)。AGCTT單倍型個體的胸寬極顯著低于AAGGG、ATGGG、GGGGG、GTCTT型(P< 0.01),而GGGGG、GTCTT型個體顯著低于GTGGG型(P< 0.05)。AAGGG和ATGGG型個體的十字部高極顯著低于其他單倍型(P< 0.01)。而AGCTT型個體的體重極顯著低于AAGGGATGGGGGGGGGTCTT和GTGGG型(P< 0.01),GGGGGGTCTT型個體的體重極顯著低于AAGGG、ATGGG和GTGGG型(P<0.01)。表6
表6 AGPAT5-exon7(72、97)-intron3(501、515、550)與體尺性狀的關(guān)聯(lián)(最小二乘均值±標準誤)
2.8.1 mRNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析
研究表明,運用在線軟件預(yù)測參考序列和PPARγ-exon7(G74T)、MYF5-exon1(T236C)、AGPAT5-exon7(G72A)等3個 SNP 位點的mRNA二級結(jié)構(gòu),參照未發(fā)生突變的參考序列,PPARγ-exon7(G74T)和AGPAT5-exon7(G72A)均會導致mRNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使得RNA二級結(jié)構(gòu)自由能發(fā)生變化,PPARγ外顯子7的G74T突變使RNA 二級結(jié)構(gòu)自由能由-56.00 kcal/mol增加到-53.30 kcal/mol,AGPAT5外顯子7的G72A突變使RNA 二級結(jié)構(gòu)自由能由-10.80 kcal/mol增加到-10.10 kcal/mol,均降低了mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。圖14
圖14 PPARγ-exon7和AGPAT5-exon7 SNP位點突變前后RNA二級結(jié)構(gòu)對比
2.8.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
研究表明,牛PPARγ基因外顯子7和AGPAT5外顯子7的2個SNP位點均為錯義突變,造成了氨基酸改變,但是突變前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相同;MYF5外顯子1的SNP位點突變?yōu)橥x突變,氨基酸和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)均未改變。
針對PPARγ、MYF5、AGPAT5這3個基因的6個突變位點進行分析發(fā)現(xiàn),AA型在SNP1、2、3、6中屬于優(yōu)勢基因,SNP4和SNP5的優(yōu)勢基因型為AB型,其中SNP1、SNP3的多態(tài)信息含量小于0.25,是低度多態(tài)的狀態(tài),而且SNP2、4、5、6是中度多態(tài),新疆褐牛群體在6個突變位點選擇潛力較大。群體遺傳學χ2檢驗表明,新疆褐牛群體中PPARγMYF5和AGPAT5基因4個SNP的基因型頻率處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài),2個SNP的基因頻率處于哈代-溫伯格不平衡狀態(tài),因為新疆褐牛在長期的選育過程中受到環(huán)境、人工選育等的影響,使群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。動物表型并不僅僅會受到SNPs的影響[15]。在PPARγ-exon7(74)-intron2(133、170)中,屬于優(yōu)勢單倍型MYF5-exon1(236)-intron1(633)優(yōu)勢單倍型而AGPAT5-exon7(72、97)-intron3(501、515、550)TCTT為優(yōu)勢單倍型。
PPARγ一直被作為許多物種肉質(zhì)和生長性狀的研究候選基因[16,17]。李麗等[18]以紹興鴨為研究材料,在PPARγ基因的8169 bp(A>C)處檢測到個多態(tài)位點,其中AC型個體在8周齡時的體重顯著高于CC型,53周齡時脛圍顯著高于AA型。對肉雞進行研究,在PPARγ5’端調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)[19]4個突變位點,其中C1590272T和C1592257T分別與胸肌肌內(nèi)脂肪和腹脂率顯著。紀永吉[20]發(fā)現(xiàn)在牦牛PPARγ的第5外顯子87 362 bp處存在TC突變,該SNP與牦牛生長性狀顯著關(guān)聯(lián)。孫太紅[21]對我國的6個肉牛品種研究,PPARγ的2和7上3個SNP,生長和肉質(zhì)性狀均有影響與研究的結(jié)果并不完全一致。研究發(fā)現(xiàn),PPARγ基因7第74 bp(G/T)存在突變(SNP1),在2的133bp(G/C)和170bp(C/T)處存在突變(SNP2)。對于胸圍體重,SNP1位點之中的AA型小于AB型。在SNP2中,體重AA型大于BB型。PPARγ突變位點SNP1和SNP2可作為新疆褐牛。
MYF5突變影響牛、羊和豬等屠宰后的肉品質(zhì),而MYF5基因突變對牛生長性能的。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn),豬MYF5外顯子2上的突變與背最長肌pH存在顯著關(guān)聯(lián),具有重要的育種價值。Zhao等[23]發(fā)現(xiàn),第3內(nèi)含子g.5785C>T和g.6535A>G的突變與秦川牛體長和胸圍呈負相關(guān)。此外,Hua等[24]以四川大恒肉雞為研究對象,發(fā)現(xiàn)MYF5外顯子1約有2個SNP(87T>C和96C>T),MYF5SNP(87T>C)與活重、胴體重、半凈膛重和全凈膛重顯著相關(guān)。姚毅等[25]MYF5與生長性狀的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),試驗羊MYF5基因第1外顯子第328位發(fā)生AC突變,該突變與試驗羊的體重管圍和體長顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)MYF5基因236 bp(T/C)處發(fā)生突變(SNP3),MYF5基因在SNP4的位置上出現(xiàn)了突變在SNP3中,AA型小于AB型。
在AGPAT5的3 501 bp(G/C)、515 bp(G/T)和550 bp(G/T)處存在3個突變位點(SNP5),在其外顯子7中存在2個突變位點(SNP6),SNP5位點AB型體長顯著高于BB型對于胸圍、胸寬體重,BB型小于其他。AB型個體體重要超過其他兩種類型。SNP6位點中的BB型個體胸圍低于另外兩種類型。AA型個體十字部高大于BB型,AB型個體胸寬和體重要超過其他兩種類型。這與衛(wèi)喜民[26]在6個肉牛品種中AGPAT5-intron3的突變位點不一致,雖然突變位點不一致,但是突變位點均與不同品種牛的生長性狀存在關(guān)聯(lián),可能是該基因在不同品種中存在較多的多態(tài)性。
對PPARγMYF5和AGPAT5 基因外顯子突變位點進行生物信息學分析,PPARγ基因74 bp發(fā)生G/T突變,AGPAT基因 72 bp(G/A)和97 bp(A/G)發(fā)生突變,均引起了氨基酸發(fā)生改變,是錯義突變。通過分析蛋白結(jié)構(gòu),蛋白結(jié)構(gòu)PPARγ-exon7(G74T)和AGPAT5-exon7(G72A)均導致 mRNA 二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,同時自由能因此個SNP突變可能會引起其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性發(fā)生改變,也可能對相應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有影響。新疆褐牛PPARγMYF5和AGPAT5基因功能。
基因PPARγ、MYF5和AGPAT5與牛體長、胸圍、胸寬、十字步高和體重性狀存在顯著關(guān)聯(lián),生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PPARγ基因外顯子1和AGPAT5基因外顯子7的2個SNP位點為錯義突變,會造成氨基酸改變,并改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)。研究確定了基因PPARγ、MYF5和AGPAT5與牛體尺性狀的關(guān)系。