卞彬彬 趙峻祥 鄭楊晨 孔令芝 劉宇洋 李井春 李雁冰*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大慶 163319;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大慶 163319)

近年來,隨著我國“糧改飼”以及牧草相關(guān)政策的推進(jìn),青貯玉米種植面積逐步擴(kuò)大,發(fā)展態(tài)勢良好[1]。作為支撐我國草食畜牧業(yè)快速發(fā)展的優(yōu)質(zhì)飼草資源,青貯玉米具有生長周期短、產(chǎn)量高、適口性好等特點(diǎn)。隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展,奶牛的養(yǎng)殖規(guī)模隨之增加,疾病的傳播途徑也更加多樣復(fù)雜,群發(fā)性疾病更加常見[2]。致病微生物常由食物及飲水進(jìn)入畜禽體內(nèi),進(jìn)而引發(fā)多種疾病[3]。常見的致病微生物包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等[4]。涂會(huì)鑫等[5]研究表明,由金黃色葡萄球菌誘發(fā)的奶牛乳房炎,在奶牛場感染率高達(dá)50%。李彥霞等[6]指出,大腸桿菌在感染奶牛乳房時(shí)會(huì)造成奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)的乳合成能力與分泌功能下降,從而導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降。楊若璇等[7]研究表明,奶牛在感染沙門氏菌后通常會(huì)出現(xiàn)腹瀉、產(chǎn)奶量降低、乳品質(zhì)變差等問題,進(jìn)而造成養(yǎng)殖行業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。而且,有大量研究表明,上述3種致病菌能在人和動(dòng)物之間進(jìn)行傳播感染,造成人畜共患病[8-9]。

在動(dòng)物生產(chǎn)中,為了防止畜禽感染,最有效的方法是采取抗生素治療,而在養(yǎng)殖期間濫用抗生素不僅會(huì)增強(qiáng)致病菌的耐藥性,而且還會(huì)使藥物在畜禽體內(nèi)殘留,對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響[10]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告指出,自2020年1月1日起,禁止在飼料中添加除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑[11]。目前,能夠抑制病原微生物的飼料添加劑主要有乳酸菌添加劑、化學(xué)添加劑、抗菌肽、天然多糖和中草藥添加劑等[12]。我國利用中草藥治療禽畜疾病具有悠久的歷史[13],中草藥添加劑具有無毒、無污染、無耐藥性、無殘留等特點(diǎn)[14],且種類多、來源廣泛、成本低廉,因此,其作為飼料添加劑的應(yīng)用越來越廣泛[15]。

辣蓼(PolygonumhydropiperL.)為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物,別名水蓼、大馬蓼、水蓼草等,在中國大部分地區(qū)都有分布,是一種資源豐富、價(jià)格低廉的植物[16]。有研究表明,辣蓼全草均可入藥,具有清熱解毒、除濕、活血化瘀的作用[17]。在《本草綱目》中就有“古人種蓼為蔬,收子入藥”這樣的記載[18]。路熙強(qiáng)[19]研究表明,辣蓼具有治療子宮出血、清除畜禽腸道寄生蟲和畜禽痢疾的功效;陶俊宇等[20]將復(fù)方辣蓼散作為飼料添加劑研究其對(duì)肉雞生長性能的影響,結(jié)果表明復(fù)方辣蓼散有效提高了肉雞屠宰率和抗氧化能力;黃立等[21]將辣蓼與木薯渣進(jìn)行青貯,青貯后產(chǎn)物中的黃酮、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)指標(biāo)含量均顯著提升。有研究表明,辣蓼中含有大量的具有抑菌作用的黃酮類化合物,例如槲皮素、金絲桃苷等[22-23],這些物質(zhì)具有促進(jìn)生長、增強(qiáng)免疫機(jī)能、抗氧化的作用[24],且能明顯抑制金黃葡萄球菌等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌生長[25-26]。

蓼屬植物中的活性成分種類繁多,具有多種功效,對(duì)畜禽健康、動(dòng)物產(chǎn)品安全具有重要的意義。然而,關(guān)于辣蓼在青貯玉米中的抑菌作用、營養(yǎng)及藥用價(jià)值鮮見報(bào)道。綜上所述,本研究采用非靶向代謝組學(xué)手段分析辣蓼中主要代謝物以及添加不同比例辣蓼與全株玉米混合青貯,探究對(duì)其抑菌能力、青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

全株玉米于2020年9月中旬采自黑龍江省大慶市(坐標(biāo)位置:北緯46°32′13.28″,東經(jīng)125°14′12.38″),全株辣蓼同年9月采自黑龍江省大慶市與安達(dá)市交界處(坐標(biāo)位置:北緯46°31′8.46″,東經(jīng)125°16′40.18″)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞沙門氏菌由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究室分離、鑒定,由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)研究所保存。

1.2 辣蓼非靶向代謝組測定與分析

1.2.1 乙酸乙酯提取液的制備

精密稱取辣蓼干燥粉末10 g放入圓底燒瓶,加入濃度為60%的乙醇300 mL,水浴溫度為80 ℃,100 W超聲提取50 min,提取3次,合并3次濾液,將布氏漏斗插入抽濾瓶后連接真空水泵,將濾液倒入抽濾藥渣,將抽濾后的樣液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,浸膏采用蒸餾水定容至10 mL,制得乙醇提取液[27]。將乙醇提取后的辣蓼提取液進(jìn)行蒸干,蒸干后的浸膏混懸于適量蒸餾水中,按體積比1∶1加入乙酸乙酯,振蕩混合后靜置2 h,將上層液體倒出,得乙酸乙酯萃取液。繼續(xù)按體積比1∶1加入乙酸乙酯,萃取操作重復(fù)3次后合并3次萃取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),將浸膏用蒸餾水定容至10 mL,121 ℃高壓滅菌15 min,制得乙酸乙酯無菌提取液[28]。

1.2.2 色譜條件

色譜條件:Thermo Vanquish(Thermo Fisher Scientific)超高效液相系統(tǒng),使用ACQUITYUPLC?HSS T3(2.1 mm×150 mm, 1.8 μm)(Waters, Milford)色譜柱,0.25 mL/min的流速,40 ℃的柱溫,進(jìn)樣量2 μL。正離子模式,流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈(B2)和0.1%甲酸水(A2),梯度洗脫程序?yàn)?0～1 min,2% B2;1～9 min,2%～50% B2;9～12 min,50%～98% B2;12～13.5 min,98% B2;13.5～14 min,98%～2% B2;14～20 min,2% B2。負(fù)離子模式,流動(dòng)相為乙腈(B3)和5 mmol/L甲酸銨水(A3),梯度洗脫程序?yàn)?0～1 min,2% B3;1～9 min,2%～50% B3;9～12 min,50%～98% B3;12～13.5 min,98% B3;13.5～14 min,98%～2% B3;14～17 min,2% B3。質(zhì)譜條件Thermo Q Exactive Focus質(zhì)譜檢測器(Thermo Fisher Scientific),電噴霧離子源(ESI),正負(fù)離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為3.50 kV,負(fù)離子噴霧電壓為-2.50 kV,鞘氣30 arb,輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃,以分辨率70 000進(jìn)行一級(jí)全掃描,一級(jí)離子掃描范圍m/z 100～1 000,并采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解,碰撞能量為30 eV,二級(jí)分辨率為17 500,采集信號(hào)前3離子進(jìn)行碎裂,同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

1.2.3 非靶向代謝組數(shù)據(jù)分析

通過Proteowizard軟件包(v3.0.8789)[29]中MSConvert工具將原始質(zhì)譜下機(jī)文件轉(zhuǎn)換為mzXML文件格式。采用R XCMS軟件包[30]進(jìn)行峰檢測、峰過濾、峰對(duì)齊處理,得到物質(zhì)定量列表,參數(shù)設(shè)置有bw=2,ppm=15,peakwidth=c(5, 30),mzwid=0.015,mzdiff=0.01,method=‘centWave’。采用公共數(shù)據(jù)庫HMDB[31]及自建物質(zhì)庫進(jìn)行物質(zhì)的鑒定,參數(shù)設(shè)置為ppm<30 ppm。采用總峰面積歸一化的方法實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)校正,消除系統(tǒng)誤差。

亞鐵離子螯合力、DPPH自由基清除能力以及總還原力均屬于酶解產(chǎn)物抗氧化能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)，從圖2～4可以看出各指標(biāo)的結(jié)果并不完全一致，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是不同方法的機(jī)理不同以及酶解產(chǎn)物抗氧化體系的復(fù)雜性[17]?？傮w而言，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化性較強(qiáng)。

1.3 抑菌試驗(yàn)

在青貯30 d開封時(shí),取120 g青貯飼料添加1×105CFU/mL的大腸桿菌、金黃葡萄球菌、沙門氏菌混勻,取實(shí)驗(yàn)室無菌樣品袋,將每袋120 g的飼料平均分裝到12個(gè)樣品袋中,每袋約為10g,用真空封口機(jī)封口,放置室溫下青貯。設(shè)置4個(gè)不同青貯時(shí)間:8、24、48和72 h,分別在對(duì)應(yīng)時(shí)間使用平板涂布法檢測3種有害菌數(shù)量。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將新鮮辣蓼放置實(shí)驗(yàn)室陰干,陰干后使用粉碎機(jī)粉碎,將粉碎后的樣品放進(jìn)實(shí)驗(yàn)室無菌樣品袋保存?zhèn)溆谩⑷暧衩浊谐?～3 cm,設(shè)置3個(gè)組,以無添加辣蓼記為對(duì)照組,以分別添加5%、10%辣蓼為添加組,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),重300 g,分別裝入聚乙烯袋中,使用真空包裝機(jī)進(jìn)行真空包裝。置于通風(fēng)陰涼處分別在3、7、14、30 d進(jìn)行開封檢測。青貯原料組成見表1。

表1 青貯原料組成

1.5 全株玉米青貯檢測指標(biāo)及方法

開封后的青貯飼料放置于65 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9240B,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),稱量差值得出干物質(zhì)含量。取開封的青貯飼料樣本20 g分別與180 mL滅菌生理鹽水(0.85%)混合,并逐層稀釋,進(jìn)行微生物數(shù)量的檢測。參考劉宇洋等[32]的方法測定乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌數(shù)量(MRS培養(yǎng)基、VRBA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司),使用電熱恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9272,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)37 ℃培養(yǎng)48 h。用精密pH計(jì)(PSH-3C,上海虹益儀器儀表有限公司)測定pH并保留適量混合溶液。使用中速定性濾紙(102,杭州富陽北木漿有限公司)過濾后,利用高效液相色譜法測定有機(jī)酸的含量,色譜條件為:色譜柱Carbomix H-HP5(8%交聯(lián)度,5 μm,8%交聯(lián)度,7.8 mm×300 mm);流動(dòng)相2.5 mmol/L硫酸,臨用前用超聲波脫氣; 流速0.6 mL/min,進(jìn)樣10 μL;溫度55 ℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測器為示差檢測器。將青貯飼料樣品放入1 L的聚乙烯罐中,罐口完全敞開,但使用雙層醫(yī)用無菌紗布覆蓋防止干燥和污染,7 d后再次檢測青貯飼料樣本的pH,以此來檢測青貯的有氧穩(wěn)定性。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Excel 2019進(jìn)行初步處理。采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析,采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,均以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn);采用SPSS 23統(tǒng)計(jì)軟件中一般線性模型單變量方差分析實(shí)現(xiàn)交互效應(yīng)的方差分析,均以P<0.05為具有顯著交互效應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn),以P<0.01為具有極顯著交互效應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣蓼代謝產(chǎn)物測定

由表2可知,對(duì)辣蓼乙酸乙酯萃取液成分進(jìn)行篩選,選出表達(dá)量最高的前20個(gè)有效成分,其中,黃酮類化合物含有6種,其他類化合物包括酯類、醛類、萜類、維生素類苯醌類、環(huán)氧類和其他化合物。

表2 辣蓼乙酸乙酯萃取液中表達(dá)量高的前20個(gè)代謝產(chǎn)物

2.2 添加辣蓼對(duì)青貯玉米的抑菌效果

由表3可知,青貯30 d后開封接種有害菌,對(duì)照組和5%辣蓼組在8 h時(shí)檢測到了3種有害菌,有害菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),10%辣蓼組在8 h只檢測到了沙門氏菌,且沙門氏菌數(shù)量顯著低于5%辣蓼組和對(duì)照組(P<0.05),菌數(shù)為2.36 lg(CFU/g);24 h時(shí),對(duì)照組3種有害菌數(shù)量降低,5%辣蓼組只檢測到了沙門氏菌,數(shù)量為2.10 lg(CFU/g),10%辣蓼組3種有害菌均未檢出;48 h后3組均未檢測到有害菌。

表3 青貯30 d后添加辣蓼對(duì)青貯玉米抑菌效果的影響

2.3 辣蓼與全株玉米混合青貯對(duì)青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響

2.3.1 添加辣蓼對(duì)青貯玉米青貯品質(zhì)的影響

相同天數(shù),不同大寫字母表示同一青貯天數(shù)不同添加量之間的差異顯著(P<0.05);相同組,不同小寫字母表示相同添加量不同青貯天數(shù)之間差異顯著(P<0.05)。T:表示青貯天數(shù);G:表示添加量;T×G:表示青貯天數(shù)和添加量的交互作用。下圖同。

由圖2可知,不同青貯時(shí)間和不同添加量對(duì)青貯玉米的各項(xiàng)發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)均有顯著影響(P<0.05),兩者的交互作用對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著影響(P<0.05)。對(duì)照組和5%辣蓼組pH隨著青貯時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,10%辣蓼組pH逐漸降低,青貯14和30 d時(shí)2個(gè)辣蓼組的pH顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。辣蓼組乳酸含量隨著青貯的進(jìn)行呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,青貯14 d時(shí)各辣蓼組乳酸含量均達(dá)到最高。對(duì)照組乳酸含量先降低后升高,在7 d時(shí)達(dá)到最低,青貯7 d后2個(gè)辣蓼組乳酸含量均顯著高于對(duì)照組。各組乙酸含量均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢,青貯14 d時(shí)均達(dá)到最高。5%辣蓼組乙酸含量在青貯前14 d均高于其他2組。辣蓼組乳酸菌數(shù)量隨著青貯的進(jìn)行逐漸升高,青貯30 d時(shí)5%辣蓼組乳酸菌數(shù)量顯著高于10%辣蓼組(P<0.05)。對(duì)照組乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。各組酵母菌數(shù)量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,5%辣蓼組酵母菌數(shù)量在青貯3 d后各時(shí)期均顯著低于10%辣蓼組和對(duì)照組(P<0.05),青貯30 d時(shí)達(dá)到最低。各組大腸桿菌的數(shù)量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,且在青貯30 d時(shí)均未檢出。10%辣蓼組大腸桿菌數(shù)量在青貯7 d時(shí)顯著降低(P<0.05),在青貯14 d時(shí)未檢出,對(duì)照組大腸桿菌數(shù)量降低速率小于辣蓼組。

2.3.2 添加辣蓼對(duì)青貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響

由表4可知,青貯玉米添加辣蓼后,各組在開封當(dāng)天和有氧暴露后7 d所測的pH均差異顯著,且pH顯著升高(P<0.05)。青貯3 d有氧暴露測得10%辣蓼組pH顯著高于其他2組(P<0.05)。青貯7 d有氧暴露測得10%辣蓼組pH顯著低于對(duì)照組和5%辣蓼組(P<0.05)。青貯14、30 d有氧暴露,測得10%辣蓼組pH顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 添加辣蓼對(duì)青貯玉米抑菌效果的影響

對(duì)照組青貯玉米在8和24 h時(shí)均檢測到了3種有害菌,10%辣蓼組只在8 h時(shí)檢測到了沙門氏菌。辣蓼組有害菌數(shù)量減少的原因可能與辣蓼以及全株玉米中的黃酮類化合物有關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn),玉米穗、玉米須、玉米花粉和玉米籽粒中都存在黃酮類化合物[33-34]。Adom等[35]研究表明,玉米中87%的酚類化合物存在于麩皮和胚乳中,且自身的黃酮類化合物與其總抗氧化能力直接相關(guān)。Agati等[36]研究發(fā)現(xiàn),黃酮類化合物在B環(huán)C-3′上額外的自由羥基(-OH)的取代使其具有更強(qiáng)的清除活性氧能力。此外,黃酮類化合物中最活躍的羥基,如黃酮中的7-OH或黃酮醇中的3-OH,通常被糖基化,使其在細(xì)胞環(huán)境中更容易溶解,利于保護(hù)活性羥基免受自身氧化[37],植物自身的這種抵抗氧化反應(yīng)的能力可能與青貯過程中辣蓼的抗菌成分相互協(xié)同,從而起到聯(lián)合抑制有害菌的作用。閆佳佳等[38]通過提取漢麻葉中的黃酮成分,并通過抑菌試驗(yàn)證明黃酮類化合物能夠?qū)Υ竽c桿菌和金黃色葡萄球菌起到抑制作用。宋立立[39]研究表明,銀杏葉中的黃酮成分可以有效抑制病原微生物的生長,將其作為飼料添加劑可以有效提高動(dòng)物生長性能和治療由細(xì)菌引起的疾病,對(duì)產(chǎn)氣型腸桿菌和大腸桿菌均有良好的抑制效果;李程野等[40]通過對(duì)3種黃酮類化合物抑制沙門氏菌的抑菌試驗(yàn)得出,槲皮素具有抑制沙門氏菌的能力,且研究表明中草藥中所含的黃酮類化合物對(duì)致病菌具有很好的抗菌活性[41-42]。Naeem等[43]通過用不同有機(jī)溶劑提取貫葉連翹中的黃酮類化合物,通過定量和定性分析,檢測出主要成分為山奈酚、異鼠李素、槲皮素等,并通過96孔法進(jìn)行抑菌試驗(yàn),結(jié)果表明,黃酮類化合物對(duì)于大腸桿菌和綠膿桿菌具有抗菌活性;戴燊等[44]研究表明,中草藥經(jīng)發(fā)酵后,在微生物的作用下,將中草藥細(xì)胞壁破壞,使其含有的活性成分大量釋放,對(duì)于提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值有顯著的影響,從而增強(qiáng)畜禽抵抗疾病的能力,值得一提的是,黃酮類化合物的抑菌機(jī)制是其高效抑菌能力的基礎(chǔ);辣蓼與青貯原料長時(shí)間青貯后,對(duì)3種有害菌的抑制能力明顯增強(qiáng),這與青貯對(duì)于代謝產(chǎn)物藥效增強(qiáng)或產(chǎn)生了新的抑菌成分有關(guān)。有研究表明,黃酮類化合物的抗菌機(jī)理主要有:抑制核酸的生成、抑制微生物的附著作用以及生物膜的形成、改變細(xì)胞膜的通透性、抑制能量代謝等[45]。但其代謝產(chǎn)物在青貯過程中的具體變化及機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

表4 有氧暴露過程中青貯玉米pH的變化

3.2 添加辣蓼對(duì)青貯玉米青貯品質(zhì)的影響

本試驗(yàn)青貯玉米原料各組干物質(zhì)含量為28%左右,研究表明此時(shí)的干物質(zhì)含量適宜青貯[46]。張金山等[47]研究表明,云南沙棘果實(shí)中3種主要黃酮類化合物對(duì)4種病原菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等)具有抑制作用。本試驗(yàn)中,對(duì)照組水溶性碳水化合物含量在青貯后期呈現(xiàn)降低的趨勢,而2個(gè)辣蓼組水溶性碳水化合物含量未顯著降低,可能是由于辣蓼的添加抑制了某些微生物的活動(dòng),導(dǎo)致水溶性碳水化合物的利用下降。邵越楣等[48]研究表明,桂花黃酮能夠?qū)Π咨钪榫纬梢种谱饔?是由于黃酮阻礙了其生物膜的早期形成。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維是評(píng)價(jià)青貯纖維品質(zhì)的主要營養(yǎng)指標(biāo)[49]。Zhan等[50]研究表明,苜蓿黃酮提取物能提高瘤胃微生物群落的豐度和多樣性,本試驗(yàn)中2個(gè)辣蓼組中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量在青貯后期均低于對(duì)照組,可能是由于辣蓼中的黃酮類物質(zhì)促進(jìn)了某些纖維素分解菌的生長。本試驗(yàn)中,2個(gè)辣蓼組的粗蛋白質(zhì)含量在青貯后期顯著高于對(duì)照組。梁小玉等[51]研究表明,全株玉米和菊苣以1∶1等比例混合青貯后其粗蛋白質(zhì)含量顯著升高,中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著降低。孫小龍等[52]將玉米秸稈和苜蓿混合青貯,研究結(jié)果表明,隨著苜蓿添加量的增加,混貯中粗蛋白質(zhì)含量升高,中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量降低。唐慶鳳等[53]將桑枝葉與玉米秸稈以不同比例混合貯存,研究發(fā)現(xiàn),提高桑枝葉的比例,增加了混合青貯中粗蛋白質(zhì)的含量,降低了粗纖維含量,與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中,對(duì)照組各時(shí)期粗脂肪含量差異不顯著,10%辣蓼組在青貯后期粗脂肪含量顯著升高,蔣金娟等[54]將全株玉米與甘蔗梢以7∶3混貯,隨著甘蔗梢添加比例的增加,混貯料的粗脂肪含量在后期顯著升高,這與本研究結(jié)果相一致,5%辣蓼組粗脂肪含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢可能是由于辣蓼添加量較低導(dǎo)致。Huang等[55]研究指出,中藥渣中含有大量的粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維等營養(yǎng)物質(zhì),且價(jià)格低廉,將其應(yīng)用于玉米青貯中能夠改善青貯飼料的營養(yǎng)品質(zhì)。由此可見,可以通過向青貯玉米中加入不同原料進(jìn)行混合青貯,來實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)的均衡,改善青貯品質(zhì)。

pH是評(píng)價(jià)青貯品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,優(yōu)良青貯飼料的標(biāo)準(zhǔn)是pH在4.0以下[56],當(dāng)pH降低時(shí),可以有效抑制飼料中有害菌的增殖[57]。本研究中,對(duì)照組pH高于4,隨著辣蓼的添加,辣蓼組的pH逐漸降低到4以下,說明辣蓼的添加能夠降低青貯飼料的pH,改善青貯品質(zhì)。有機(jī)酸總量和種類構(gòu)成也是反映青貯飼料青貯品質(zhì)的重要指標(biāo),乳酸和乙酸含量是其中的關(guān)鍵因素,乳酸的含量越高,青貯飼料的品質(zhì)越好,乙酸能夠提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性,并且能在防止氧化變質(zhì)方面發(fā)揮重要作用。李君風(fēng)等[58]在青貯苜蓿和西藏燕麥共同青貯時(shí)添加乙酸,結(jié)果表明,添加乙酸組有氧穩(wěn)定性提升。本試驗(yàn)中,辣蓼添加組青貯14 d時(shí)乳酸和乙酸的含量隨著辣蓼的添加不斷升高,10%辣蓼組在青貯30 d后,各組乳酸菌數(shù)量最高,此時(shí)的青貯更為穩(wěn)定。楊君等[59]研究表明,生地黃不同添加量可以促進(jìn)保加利亞乳桿菌的增殖。酵母菌在有氧環(huán)境下進(jìn)行活動(dòng),進(jìn)而使青貯發(fā)生霉變腐敗[60],青貯腐敗變質(zhì)與酵母菌的數(shù)量和種類有關(guān),引起腐敗的酵母菌可以分為2類:一類為可以消化乳酸,一類為可以消化水溶性碳水化合物[61]。王雁[62]向紫花苜蓿中添加黨參、當(dāng)歸和黃芪等中草藥,結(jié)果表明,辣蓼組的乳酸含量和乳酸菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照組,本試驗(yàn)與其結(jié)果相一致。

3.3 添加辣蓼對(duì)青貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響

青貯飼料在取用時(shí)與空氣接觸,此時(shí)空氣中的氧氣會(huì)侵入飼料,激活受到抑制的好氧微生物使其代謝活動(dòng)加強(qiáng)pH升高,對(duì)有氧穩(wěn)定性帶來不好的影響,使青貯飼料發(fā)生霉變。影響飼料有氧穩(wěn)定性的微生物包括酵母菌、霉菌等其他好氧型細(xì)菌[63]。本試驗(yàn)中,在青貯各個(gè)時(shí)期進(jìn)行開封取樣,進(jìn)行7 d有氧暴露試驗(yàn)。取青貯14、30 d進(jìn)行有氧暴露,10%辣蓼組7 d后青貯pH升高幅度小于5%辣蓼組和對(duì)照組。這說明10%辣蓼組有氧穩(wěn)定性更好,對(duì)照組有氧穩(wěn)定性差。辣蓼中乙酸乙酯萃取液表達(dá)量最高的代謝產(chǎn)物主要為黃酮類化合物、苯酚類化合物、酯類化合物等。研究表明,黃酮類化合物是蓼屬植物最主要的次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于蓼屬植物中,具有抗氧化、抗病毒、抗菌等作用[24],與本研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

① 抑菌試驗(yàn)中,10%辣蓼組在8和24 h時(shí)均未檢測到大腸桿菌和金葡萄球菌,且沙門氏菌數(shù)量均低于其他2組,證明添加10%辣蓼能夠在一定程度上抑制有害菌的增殖。

② 全株玉米青貯中添加5%或10%的辣蓼,在青貯達(dá)30 d時(shí)與對(duì)照組相比pH分別下降了0.20和0.28,顯著降低了全株玉米青貯的pH。

③ 有氧暴露試驗(yàn)中,在有氧脅迫下14和30 d時(shí),10%辣蓼組pH均顯著低于對(duì)照組,證明添加10%辣蓼能夠有效提高青貯的有氧穩(wěn)定性。

④ 綜上可知,辣蓼的添加對(duì)大腸桿菌、金葡萄球菌、沙門氏菌具有一定的抑制作用,且能夠提高全株玉米青貯的品質(zhì),并延長其有氧穩(wěn)定性。