伏 靖 王何瑜 胡 媛 龔一富，

（1寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315832；2寧波大學(xué)食品與藥品學(xué)院，浙江 寧波 315832）

三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）是一種生長迅速、適應(yīng)能力強(qiáng)、脂質(zhì)含量高且富含巖藻黃素的海洋單細(xì)胞模式硅藻，每年可提供全球20%的初級生產(chǎn)力［1］，在巖藻黃素生產(chǎn)和新能源方面具有重要地位［2］。巖藻黃素是一種內(nèi)縮醛類胡蘿卜素，廣泛分布于海洋藻類、單倍體和菊科［3］，巖藻黃素在動物體內(nèi)具有抗腫瘤［4］、抗炎癥［5］、抗氧化［6］、減肥［7］、抗瘧疾等效果［8］，在食品與藥品、化妝品和農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖等行業(yè)應(yīng)用廣泛［9-10］。研究表明，巖藻黃素合成受相關(guān)酶基因控制，同時也受到光合作用的影響。八氫番茄紅素去飽和酶（pds）和番茄紅素β-環(huán)化酶（lcyb）是巖藻黃素合成的關(guān)鍵酶，對巖藻黃素積累具有校高的貢獻(xiàn)率［11］。光系統(tǒng)Ⅱ蛋白D1 基因（psbA）和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶大亞基基因（rbcL）參與微藻光系統(tǒng)Ⅱ過程，與微藻光呼吸和碳同化速率密切相關(guān)，有研究表明psbA基因和rbcL基因表達(dá)下降會抑制巖藻黃素的積累［12］。微藻脂類主要分為中性脂肪酸和極性脂肪酸兩大類，其中中性脂肪酸主要包括甘油三酯、固醇類和游離脂肪酸等，極性脂肪酸主要包括磷脂和糖脂。研究表明，甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因（gpat）和Δ12脂肪酸去飽和酶基因（FAD2）是藻類脂肪酸合成的關(guān)鍵酶基因，其中甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因被認(rèn)為是甘油酯生物合成的關(guān)鍵限速酶基因［13］。目前，已有多種誘導(dǎo)物被應(yīng)用到巖藻黃素和脂肪酸生產(chǎn)過程中，但使用碳源兼養(yǎng)三角褐指藻生產(chǎn)巖藻黃素和脂肪酸的方式還相對研究不足。

葡萄糖酸鈉（sodium gluconate）是一種價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)酸鹽，化學(xué)式為C6H11NaO7，在工業(yè)、發(fā)酵、醫(yī)療等方面用途廣泛［14］。周景文等［15］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖酸鈉可以調(diào)節(jié)生物體內(nèi)NADH/NAD+比例和ATP 水平，加速糖酵解速率，提高丙酮酸產(chǎn)量。Zhang 等［16］研究表明，葡萄糖酸鈉通過提高枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）磷酸戊糖途徑來有效促進(jìn)核黃素的產(chǎn)生。雖然葡萄糖酸鈉在工業(yè)、醫(yī)療和微生物發(fā)酵過程中已有研究，但是在藻類養(yǎng)殖過程中還鮮有報道。Pang等［17］研究表明，葡萄糖酸鈉可以促進(jìn)雨生紅球藻的生物量積累。基于此，本研究將葡萄糖酸鈉應(yīng)用到三角褐指藻培養(yǎng)過程中，研究葡萄糖酸鈉對三角褐指藻生長與次生代謝物的影響，以期提高三角褐指藻巖藻黃素和脂質(zhì)含量，為規(guī)?；a(chǎn)巖藻黃素提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三角褐指藻藻種來源于寧波大學(xué)植物資源開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)。葡萄糖酸鈉（化學(xué)純）購自上海麥克林生化科技有限公司。植物RNA 提取試劑盒和ChamTMQ Universal SYBR?qPCR Master Mix kit購自諾唯贊生物科技股份有限公司。Prime Script RT Reagent Kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藻類培養(yǎng) 將處于對數(shù)生長期的藻種按照1∶10的比例接種于滅菌后的f/2培養(yǎng)基中，培養(yǎng)光照強(qiáng)度設(shè)置為60 μmol·m-2·s-1，光周期設(shè)置為光照12 h/黑暗12 h，溫度控制在（25±1）℃，培養(yǎng)基pH 值控制在7.5 左右，培養(yǎng)周期為10 d。每天定時搖晃藻瓶3 次，防止藻細(xì)胞下沉。

1.2.2 葡萄糖酸鈉濃度設(shè)置 對照組使用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)三角褐指藻，試驗(yàn)組在f/2培養(yǎng)基組分基礎(chǔ)上額外添加葡萄糖酸鈉作為補(bǔ)充碳源，設(shè)置葡萄糖酸鈉濃度為10、50、100、200、400和600 mmol·L-1，每組設(shè)置3重復(fù)。

1.2.3 三角褐指藻生長曲線測定 三角褐指藻生長曲線通過紫外分光光度法［18］進(jìn)行測量，每24 h 取3 mL三角褐指藻藻液用UV-5200 型紫外可見分光光度計(jì)（METASH，上海）測定藻液在680 nm處的吸光值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算細(xì)胞密度，并根據(jù)細(xì)胞密度繪制葡萄糖酸鈉兼養(yǎng)下三角褐指藻的生長曲線。細(xì)胞密度計(jì)算公式如下：

式中，y代表細(xì)胞密度（106個·mL-1），x代表吸光值，R2=0.99。

1.2.4 三角褐指藻比生長速率測定 用葡萄糖酸鈉

兼養(yǎng)三角褐指藻后，根據(jù)公式計(jì)算每天的比生長速率（μ），并根據(jù)μ 繪制葡萄糖酸鈉兼養(yǎng)下三角褐指藻的比生長速率曲線。μ的計(jì)算公式如下：

1.2.5 三角褐指藻次生代謝物測定 三角褐指藻的巖藻黃素與葉綠素a 按照徐潤潔等［19］的方法，通過有機(jī)溶劑浸提法進(jìn)行提取。從各樣本中取100 mL 藻液，4 ℃、5 000 r·min-1條件下離心10 min，移棄上清，將藻泥在-80 ℃冰箱中凍存24 h后冷凍干燥24 h，凍干藻泥研磨成粉，稱取0.1 g藻粉加入4 mL無水乙醇，在60 ℃條件下避光浸提2 次，每次1 h，浸提完成后4 ℃、5 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液于紫外可見分光光度計(jì)檢測在445 nm 處的吸光值，然后根據(jù)公式（3）計(jì)算巖藻黃素產(chǎn)量：

式中，Pfuc的單位為mg·L-1，A445表示浸提液在445 nm處的吸光值，N表示稀釋倍數(shù)，V表示粗提液體積（mL），A1%1cm表示巖藻黃素濃度為1 g·L-1時上清液在光徑為1 cm時的光吸收值，即1 600。

從各樣本中取10 mL藻液，4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min，用ddH2O 洗滌2 次后加入10 mL 無水乙醇避光浸提24 h，然后使用紫外可見分光光度計(jì)檢測各樣本在652和665 nm處的吸光值，然后根據(jù)公式（4）計(jì)算葉綠素a含量：

式中，Cchla的單位為μg·L-1，A665表示浸提液在665 nm處的吸光值，A652表示浸提液在652 nm處的吸光值。

參照韋鳳娟等［20］的方法，通過尼羅紅染色法［21］測量中性脂肪酸的相對含量。從各樣本中取1.25 mL藻液，加入13 μL二甲基亞砜（Dimethy sulfoxide，DMSO）于離心管中，微波處理40 s 后加入39 μL 尼羅紅染液，混勻后50 ℃水浴染色5 min，孵育結(jié)束后用的Varioskan LUX 型酶標(biāo)儀（賽默飛，美國）測量各樣本在激發(fā)波長為480 nm 時，發(fā)射波長為580 nm 處的吸光值，然后通過計(jì)算得出各樣本之間總脂肪酸的相對含量。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）檢測基因表達(dá)水平 葡萄糖酸鈉處理對數(shù)生長期的三角褐指藻24 h 后，4 ℃、5 000 r·min-1條件下離心10 min，移棄上清液。采用植物RNA 提取試劑盒提取樣本總RNA，獲得的總RNA 采用Takara Prime Script RT Reagent Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）找到三角褐指藻巖藻黃素合成相關(guān)的lcyb與pds，與光合作用相關(guān)的rbcL與psbA，與脂類合成的gpat與FAD2全基因組序列，使用Primer 5.0 設(shè)計(jì)lcyb、pds、rbcL、psbA、gpat和FAD2基因的引物（表1），以β-actin為內(nèi)參基因，引物由杭州有康生物技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR 反應(yīng)體系共20 μL：正、反向引物各0.4 μL、2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、ddH2O 6.4 μL、模板2 μL。程序在實(shí)時熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾，新加坡）上進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)程序條件為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性10 s，50 ℃退火10 s，共40個循環(huán)。基因相對表達(dá)量數(shù)據(jù)以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法［22］計(jì)算得出。

表1 目標(biāo)基因引物Table1 Primers of target genes

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用SPSS 26 進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性進(jìn)行Person 相關(guān)性分析，將P＜0.05認(rèn)定為差異顯著，將P＜0.01認(rèn)定為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻生長的影響

不同濃度葡萄糖酸鈉處理三角褐指藻后（圖1-A），三角褐指藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在200 mmol·L-1時三角褐指藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值，為8.95×106個·mL-1，其次為100 mmol·L-1組，細(xì)胞密度為8.82×106個·mL-1，均極顯著高于對照組的5.13×106個·mL-1，分別是對照組的1.75 和1.72 倍（P＜0.01）。研究表明400 mmol·L-1的葡萄糖酸酸鈉依然對三角褐指藻細(xì)胞密度具有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度達(dá)到600 mmol·L-1時，三角褐指藻細(xì)胞密度極顯著低于對照組（P＜0.01）。葡萄糖酸鈉濃度在0～200 mmol·L-1時（圖1-B），三角褐指藻最大比生長速率（μ）在第3天達(dá)到峰值，然后迅速降低，其中μ 最大值出現(xiàn)在200 mmol·L-1，為0.59。當(dāng)葡萄糖酸鈉濃度高于200 mmol·L-1時，三角褐指藻比生長速率可在較長時間保持相對穩(wěn)定。

圖1 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻細(xì)胞密度（A）與比生長速率（B）的影響Fig.1 Effect of sodium gluconate on cell density （A） and specific growth rate （B） of P. tricornutum

2.2 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻巖藻黃素與葉綠素a的影響

不同濃度葡萄糖酸鈉處理三角褐指藻后，隨著葡萄糖酸鈉濃度升高，三角褐指藻巖藻黃素產(chǎn)量（圖2-A）和葉綠素a（圖2-B）含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在10～200 mmol·L-1濃度內(nèi)，三角褐指藻巖藻黃素產(chǎn)量均顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05、P＜0.01），葉綠素a含量極顯著高于對照組（P＜0.01），表明10～200 mmol·L-1葡萄糖酸鈉有助于積累巖藻黃素和葉綠素a。葡萄糖酸鈉濃度為200 mmol·L-1濃度時，巖藻黃素產(chǎn)量最高，為0.36 mg·L-1，極顯著高于對照組0.20 mg·L-1（P＜0.01），是對照組的1.79 倍。葡萄糖酸鈉濃度為100 mmol·L-1時，葉綠素a 含量最高，為對照組的1.67倍。當(dāng)葡萄糖酸鈉濃度大于200 mmol·L-1時，三角褐指藻細(xì)胞巖藻黃素產(chǎn)量和葉綠素a 含量極顯著低于對照組（P＜0.01）。

2.3 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻中性脂肪酸含量的影響

不同濃度葡萄糖酸鈉處理三角褐指藻后，中性脂肪酸含量呈現(xiàn)逐漸提高的趨勢（圖3），各處理組中性脂肪酸含量均極顯著高于對照組（P＜0.01），600 mmol·L-1組中性脂肪酸含量最高，達(dá)到2.51 mg·g-1，極顯著高于對照組的0.15 mg·g-1（P＜0.01）。

圖3 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻中性脂肪酸的影響Fig.3 Effect of sodium gluconate on neutral fatty acids in P. tricornutum

2.4 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻基因表達(dá)的影響

研究不同濃度葡萄糖酸鈉對三角褐指藻巖藻黃素合成相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果表明，隨著葡萄糖酸鈉濃度的增加，lcyb（圖4-A）和pds（圖4-B）基因表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在葡萄糖酸鈉濃度為50 mmol·L-1時，lcyb與pds基因的相對表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），分別為對照組的2.30 和2.35 倍。葡萄糖酸鈉濃度在10～200 mmol·L-1時，對三角褐指藻lcyb和pds基因均具有促進(jìn)作用，當(dāng)葡萄糖酸鈉濃度高于200 mmol·L-1時，促進(jìn)了pds基因的表達(dá)，而抑制了lcyb基因的表達(dá)。

圖4 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻關(guān)鍵基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of sodium gluconate on the expression of key genes in P. tricornutum

研究不同濃度葡萄糖酸鈉對三角褐指藻光合作用相關(guān)基因psbA（圖4-C）和rbcL（圖4-D）基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，隨著葡萄糖酸鈉濃度的增加，psbA基因表達(dá)量逐漸降低，而rbcL基因表達(dá)量逐漸升高。當(dāng)葡萄糖酸鈉濃度大于200 mmol·L-1時，試驗(yàn)組rbcL基因表達(dá)量顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05、P＜0.01），表明高濃度葡萄糖酸鈉可以促進(jìn)rbcL基因的表達(dá)隨著葡萄糖酸鈉濃度的升高，psbA表達(dá)量呈下降趨勢，并且濃度均極顯著極于對照組（P＜0.01）。

研究不同濃度葡萄糖酸鈉對三角褐指藻中心脂肪酸合成相關(guān)的gpat（圖4-E）和FAD2（圖4-F）基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，隨著葡萄糖酸鈉濃度的增加，gpat基因表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在葡萄糖酸鈉濃度為50 mmol·L-1時，gpat基因的相對表達(dá)量最高，極顯著高于對照組（P＜0.01），為對照組的3.56倍。FAD2基因表達(dá)量與葡萄糖酸鈉濃度成正比，表明葡萄糖酸鈉可能通過促進(jìn)FAD2和gpat基因的表達(dá)來促進(jìn)中性脂肪酸積累。

3 討論

三角褐指藻能利用光能和CO2進(jìn)行光合作用，也能在額外補(bǔ)充碳源的情況進(jìn)行兼養(yǎng)生長。劉曉娟［23］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、果糖、乙酸鈉、甘油等均對三角褐指藻生長起促進(jìn)作用，王珊等［24］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)甘油能顯著提高三角褐指藻巖藻黃素含量。丁曉婷等［25］使用甘露糖作為有機(jī)碳源兼養(yǎng)三角褐指藻后顯著提高三角褐指藻生物量，并且發(fā)現(xiàn)甘露糖能促進(jìn)巖藻黃素和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）含量的積累。本研究使用不同濃度葡萄糖酸鈉兼養(yǎng)三角褐指藻過程中，發(fā)現(xiàn)采用200 mmol·L-1葡萄糖酸鈉可以顯著提高三角褐指藻生物量，是對照組的1.75 倍，與Pang等［17］的研究結(jié)果一致。推測是因?yàn)槠咸烟撬徕c與作為能源物質(zhì)的葡萄糖具有類似的結(jié)構(gòu)，進(jìn)入磷酸戊糖途徑，作為能源物質(zhì)支持三角褐指藻的生長［26-27］。在生理指標(biāo)方面，葡萄糖酸鈉有助于三角褐指藻葉綠素a和中性脂肪酸含量積累，能顯著提高巖藻黃素產(chǎn)量。前人研究表明，與葡萄糖相比，葡萄糖酸鈉作為碳源具有利用率高和培養(yǎng)基pH 值穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［28］。本研究采用葡萄糖酸鈉兼養(yǎng)三角褐指藻后顯著提高了三角褐指藻的生物量，為微藻培養(yǎng)與提供了一條有效途徑。

本研究對不同濃度葡萄糖酸鈉誘導(dǎo)下三角褐指藻的lcyb、pds、psbA、rbcL、FAD2與gpat基因定量發(fā)現(xiàn)，與巖藻黃素合成有關(guān)的lcyb和pds表達(dá)量與巖藻黃素含量趨勢一致，均呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的情況，表明葡萄糖酸鈉可以通過促進(jìn)lcyb和pds表達(dá)來提高巖藻黃素含量。Zhu等［29］使用硫酸鈰銨提高三角褐指藻巖藻黃素含量的研究中，發(fā)現(xiàn)lcyb和pds對三角褐指藻巖藻黃素合成的貢獻(xiàn)率最大，推測lcyb和pds可能是三角褐指藻體內(nèi)巖藻黃素合成的關(guān)鍵基因。葡萄糖酸鈉處理三角褐指藻后與光合作用相關(guān)的psbA出現(xiàn)下降的趨勢，表明隨著葡萄糖酸鈉的濃度的增加三角褐指藻的光合作用受到抑制，推測藻種還處于恢復(fù)期，未達(dá)到植物生長的最佳狀態(tài)，影響了psbA的表達(dá)［30］。前人研究表明，F(xiàn)AD2參與不飽和脂肪酸的合成過程。Wen 等［31］研究表明，提高FAD2的表達(dá)量可以增加食用花生油油酸含量，推測FAD2是油脂合成的關(guān)鍵基因之一。尹航等［13］研究表明，gpat的表達(dá)量與三角褐指藻總脂肪酸含量呈正相關(guān)。汪翔［32］通過對GPAT1和AGPAT1雙節(jié)點(diǎn)過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GPAT1和AGPAT1聯(lián)合作用會促進(jìn)TAG 明顯積累。葉冠華［33］通過將兩個甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因（GPAT1、GPAT2）轉(zhuǎn)入野生型萊茵衣藻體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)GPAT1、GPAT2基因表達(dá)量分別提高2.4和1.4倍后，TAG產(chǎn)量分別提高了40%和34%。本研究中FAD2與gpat在兼養(yǎng)過程中表達(dá)增加，兩個基因在各個濃度梯度下表達(dá)量整體高于對照組，說明葡萄糖酸鈉作為碳源可以通過促進(jìn)FAD2與gpat基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)中心脂肪酸含量的積累。

4 結(jié)論

研究表明，葡萄糖酸鈉能提高三角褐指藻細(xì)胞密度，葡萄糖酸鈉濃度為200 mmol·L-1時效果最好。葡萄糖酸鈉處理以后，在低中濃度（10～200 mmol·L-1）條件下三角褐指藻比生長速率在第3 天時達(dá)到最大，然后迅速降低，高濃度（400～600 mmol·L-1）葡萄糖酸鈉可以使三角褐指藻保持相對穩(wěn)定的比生長速率。葡萄糖酸鈉可以在低中濃度下能提高三角褐指藻葉綠素a含量和巖藻黃素產(chǎn)量，高濃度條件下反之。三角褐指藻中性脂肪酸含量隨葡萄糖酸鈉濃度提高而增加。qRT-PCR 結(jié)果表明，葡萄糖酸鈉通過促進(jìn)lcyb、pds、FAD2和gpat基因的表達(dá)來提高三角褐指藻巖藻黃素含量和中性脂肪酸含量。