柯瑩瑩

（茂名市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 茂名 525000）

超聲波提取法是利用超聲波輻射產(chǎn)生的強烈的空化效應(yīng)、機械振動、擾動效應(yīng)、高的加速度、乳化、擴散、擊碎和攪拌等多種作用，增加物質(zhì)分子運動的頻率和速度、溶劑的穿透力，從而加速目標(biāo)成分進入溶劑[1]。此外Toma Maricela等人研究發(fā)現(xiàn)超聲波在促進傳質(zhì)的同時還能促進水合，這也有助于中藥有效成分的提取[2]。

水煎提取法是以水為提取溶劑，將藥材加熱煮沸一定的時間而獲得煎煮液，并重復(fù)進行若干次，以提取其有效成分的一種傳統(tǒng)方法。水煎提取法能提取較多的成分，對于有效成分尚未清楚的中藥或方劑進行劑型改進時，通常采取煎煮法粗提[3]。

烏梅為薔薇科植物。烏梅藥食兼用，能開胃、生津、止渴。其果實中含有檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸及谷甾酸等，具有一定的抑菌防腐作用[4]。近年來，集約化、工廠化養(yǎng)殖方式的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高及抗生素等抗菌藥物的使用，使養(yǎng)殖用水體日益惡化，水產(chǎn)品藥物殘留居高不下，所以進一步開展中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究成為必然趨勢[5]，而縮短中藥炮制時間，提高中藥的利用效率更是勢在必行。

本試驗以烏梅作為供試中藥，用超聲波提取及傳統(tǒng)水煎提取2種不同的提取方法，采用平皿打孔法、試管2倍稀釋法，測定兩種提取方式提取的烏梅提取液對于海洋致病性弧菌（創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌）及希瓦氏菌地方菌株（鮑魚希瓦氏菌），共四種菌的體外抑菌效果的影響，為優(yōu)化提取流程，應(yīng)用更高效率的提取方法提取中草藥進行防治動物細菌性疾病提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗中藥

供試中藥：烏梅（購自茂名某藥店）。

1.1.2 試驗菌株

創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、鮑魚希瓦氏菌、哈氏弧菌。

1.1.3 試驗試劑

營養(yǎng)瓊脂、氯化鈉（Nacl）、營養(yǎng)肉湯。

1.1.4 試驗器材

三頻多用途恒溫超聲提取機、生化培養(yǎng)箱、冰箱、潔凈工作臺、手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器、高速冷凍離心機、微量移液器、游標(biāo)卡尺。

1.1.5 藥物樣品的制備

（1）超聲波提取液制備

稱取烏梅10g，加水500 mL，浸泡30 min后，置超聲波提取儀中，2.5 s工作間歇超聲提取2次，每次30 min，然后過濾藥液；合并2次藥液，4000 r/ min離心10 min，除去沉淀，濃縮至10 mL，制備成藥液濃度為1g/ mL的提取液，121℃高壓滅菌20 min，置4℃冰箱備用。

（2）水煎液制備（煎煮法）

稱取烏梅10g，加水500 mL，浸泡30 min后，文火煎煮2次，每次30 min，然后過濾藥液；合并2次藥液，4000 r/ min離心10 min，濃縮至10 mL，制備成藥液濃度為1 g/ mL的水煎液。121℃高壓滅菌20 min，置4℃冰箱備用。

1.1.6 培養(yǎng)基的制備

3.5 %NaCl營養(yǎng)瓊脂（pH 7.8）、3.5%NaCl營養(yǎng)肉湯（pH 7.8）按常規(guī)方法配制。

1.1.7 供試菌液的制備

創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、鮑魚希瓦氏菌、哈氏弧菌經(jīng)復(fù)壯、純化后，接種到營養(yǎng)肉湯中，制成肉湯菌液，共接種2組。一組37℃恒溫培養(yǎng)18h，用于藥物敏感度測定試驗；另一組培養(yǎng)8h，用于最小抑菌濃度（MIC）測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試中藥藥物敏感度測定

采用平皿打孔法[6]將試驗菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h，制成肉湯菌液。用滅菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于3.5%NaCl營養(yǎng)瓊脂（pH7.8）平板上，然后用直徑6 mm的打洞器均勻打洞，每皿打5個洞，去除洞內(nèi)瓊脂后將試驗藥液加于洞中，以滿面不溢為宜并做好標(biāo)記，每樣品做2個重復(fù)，37℃恒溫培養(yǎng)18h后取出，觀察結(jié)果，測定抑菌圈直徑，并取平均值記錄結(jié)果。結(jié)果判斷：抑菌圈直徑小于10 mm為低度敏感或耐藥，10~15 mm為中度敏感，大于15 mm為高度敏感[8]。

1.2.2 最小抑菌濃度（MIC）測定

采用試管二倍稀釋法[7]測定樣品對供試菌株的最小抑菌濃度（MIC），具體操作步驟如下：取無菌試管8支，第1管加入1.8 mL無菌營養(yǎng)肉湯，余下7管各加1 mL營養(yǎng)肉湯；以無菌操作吸取制備好的藥物0.2 mL加入第1管中，混勻后吸取1 mL加入第2管中，依次倍比稀釋至第7管，混勻后自第7管棄去1 mL。此時，管中藥液濃度比依次為1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，第8管不加藥物作為陽性對照。

將培養(yǎng)8h的供試菌液，用無菌肉湯稀釋成10-3濃度的實驗菌液，然后各管均加入實驗菌液0.2 mL，充分混勻后，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16~18h，觀察結(jié)果。若肉湯混濁，表示細菌生長，若肉湯完全清亮，表示無細菌生長。

以肉眼觀察，無細菌生長的試管中最低藥物濃度為該藥的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 最小殺菌濃度（MBC）測定

將上述MIC測定中未生長細菌的各管中肉湯接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，做好標(biāo)記，37℃培養(yǎng)16~18h，觀察結(jié)果。以有無菌落生長作為指標(biāo)檢查試管中有無細菌生長，以仍無細菌生長的管內(nèi)藥物的濃度為該藥的最小殺菌濃度（MBC）[7]。

2 結(jié)果

2.1 供試中藥藥物敏感度測定

供試中藥烏梅對供試菌株具有良好的體外抑菌效果，呈高度敏感，詳見表1，實驗數(shù)據(jù)表明，2種提取方法對烏梅的體外抑菌效果均呈高度敏感，但水煎提取法的烏梅提取液抑菌圈比超聲波提取的烏梅提取液抑菌圈稍大一點，說明水煎提取法對烏梅的體外抑菌效果比超聲波提取法的體外抑菌效果更好。

表1 供試中藥烏梅藥物敏感度測定結(jié)果（抑菌圈直徑/mm）

2.2 最小抑菌濃度（MIC）測定

烏梅的超聲波提取液對創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、鮑魚希瓦氏菌、哈氏弧菌的MIC為1∶80；烏梅的水煎提取液對創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌的MIC均為1∶160，對鮑魚希瓦氏菌的MIC為1∶80，詳見表2。水煎提取法液的體外抑菌效果比超聲波提取液的體外抑菌效果更佳，且水煎提取法提取的烏梅提取液對弧菌的體外抑菌效果比對希瓦氏菌的體外抑菌效果更佳。

表2 烏梅的最小抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果（單位：g/mL）

烏梅提取液藥物敏感度測定結(jié)果如圖1~圖4，培養(yǎng)皿中左邊2個抑菌圈為超聲波烏梅提取液的試驗結(jié)果，右邊2個抑菌圈為水煎烏梅提取液的試驗結(jié)果。

圖2 烏梅提取液對副溶血弧菌的藥物敏感度試驗

圖3 烏梅提取液對鮑魚希瓦氏菌的藥物敏感度試驗

圖4 烏梅提取液對哈氏弧菌的藥物敏感度試驗

2.3 最小殺菌濃度（MBC）測定結(jié)果

烏梅的超聲波提取液對創(chuàng)傷弧菌、哈氏弧菌的MBC為1∶40，對副溶血弧菌、鮑魚希瓦氏菌的MBC為1∶80；烏梅的水煎提取液對創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、鮑魚希瓦氏菌、哈氏弧菌的MBC均為1∶80，詳見表3。最小殺菌濃度（MBC）測定結(jié)果與最小抑菌濃度（MIC）相似，烏梅水煎提取液的體外殺菌效果比烏梅超聲波提取液的體外殺菌效果略好。

表3 供試中藥烏梅最小殺菌濃度（MBC）測定結(jié)果（單位：g/mL）

3 討論

超聲波能大大提高植物中的多糖類物質(zhì)、類固醇和三萜系化合物、抗氧化活性的化合物的提取速率，但由于超聲波作用能斷開兩碳原子之間，所以在超聲提取過程中會產(chǎn)生很多具有較強活性的自由基，能與許多抗氧化性物質(zhì)反應(yīng)，破壞活性成分[8]。烏梅中含有大量有機酸、黃酮、萜類、甾醇、脂類、揮發(fā)性成分、生物堿、糖類、歧化酶、維生素C、維生素B1、維生素B2等活性成分[9]，加上中藥提取后儲藏一段時間后才進行試驗，烏梅超聲波提取液中部分有效成分更容易被破壞。有試驗證明，烏梅本身的熱穩(wěn)定性很高[10]，故本試驗中水煎提取、高壓滅菌所產(chǎn)生的高溫對烏梅的藥效影響并不大。因此推定，烏梅的超聲波提取液藥效不如水煎提取液的藥效。

研究表明，超聲波提取對于植物種子的物質(zhì)膨脹指數(shù)有較好的促進作用[2]。在本試驗過程中，烏梅經(jīng)過超聲波提取之后明顯膨脹，形成一大團的絮狀物，在用紗布過濾的過程中有大量的混有提取液的沉渣無法被過濾，可能有部分有效物質(zhì)或有害物質(zhì)殘留在沉渣中未被析出，對試驗結(jié)果造成誤差。

4 結(jié)論

（1）超聲波與水煎提取法提取的烏梅提取液對創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、鮑魚希瓦氏菌、哈氏弧菌的體外抑菌效果均呈高度敏感。

（2）水煎提取法相比超聲波提取法可產(chǎn)生更好的體外抑菌效果。