鮑文娜，趙晨浩，廖鴻秀，陳怡，張子燁，肖功年，李惠,2，潘海峰

（1.浙江科技學(xué)院,杭州 310023；2.浙江省市場(chǎng)局乳及乳制品監(jiān)管技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310006；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310023；4.湖州學(xué)院，浙江湖州 313000）

0 引言

大麥苗是大麥（Hordeum vulagre L.）的幼苗，一般指大麥抽穗前的幼嫩莖葉，尤其是株高在5～15 cm 的大麥苗營(yíng)養(yǎng)最佳。它富含蛋白質(zhì)和賴氨酸等氨基酸[1]，且為堿性食物之王，其堿性是理想堿性蔬菜菠菜的2倍[2]，大麥苗中有多種抗氧化酶，如過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶，具有清除自由基，分解體內(nèi)毒素，抗衰老等功效[3]。此外還有多種消化酶[4]，豐富的葉綠素[5]，具有抗疲勞、降血壓、抗氧化、抗衰老、消食、護(hù)肝、降血糖、通便等功能。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于大麥苗和酸奶單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功效的研究較多，但將大麥苗和酸奶共發(fā)酵的功能型酸奶報(bào)道較少，且已有研究主要集中在大麥苗酸奶制備條件優(yōu)化上[6-7]，還未對(duì)其活性功能和風(fēng)味特征進(jìn)行研究?；钚晕镔|(zhì)的穩(wěn)定性受氧、溫度、pH 等環(huán)境因素以及食品體系中蛋白、脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分影響，而食品中這類物質(zhì)在貯藏期間能否穩(wěn)定，必然會(huì)影響其最終的生物利用率和體內(nèi)生理活性的發(fā)揮。

本研究以具有良好抗氧化功能的大麥苗為對(duì)象，將其與酸奶進(jìn)行共發(fā)酵，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中功能因子的變化，模擬胃腸道環(huán)境，結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)監(jiān)測(cè)，為開(kāi)發(fā)酸鮮可口、營(yíng)養(yǎng)豐富、香味濃郁并具有良好保健功能的麥苗酸奶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉，新西蘭恒天然有限公司；大麥苗粉，海通食品集團(tuán)余姚有限公司；乳酸菌種YO-MIX 187（嗜熱鏈球菌與德式乳桿菌保加利亞乳桿菌種混合），丹麥丹尼斯克；過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒(可見(jiàn)光法) 和總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒（羥胺法），南京建成生物工程研究所；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和牛膽鹽，sigma；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 大麥苗酸奶的制備

大麥苗酸奶的制備參考趙延勝[7]的方法，燒杯中加入700 mL 去離子水，加熱至50 ℃，稱取100 g（12.5%）全脂奶粉、48 g（6 %）白糖、0.56 g（0.07 %）瓊脂、8 g（1 %）淀粉、0.8 g（0.1 %）果膠、3.6 g（0.45 %）大麥苗粉，攪拌均勻。均質(zhì)1 min，靜置30 min，95 ℃水浴殺菌5 min。溫度冷卻至42 ℃后加入0.01 %發(fā)酵劑，100 mL/瓶分裝至預(yù)先滅菌的玻璃罐中42 ℃發(fā)酵6 h。放入4 ℃冰箱內(nèi)后熟12 h，并于4 ℃冰箱保存，同時(shí)設(shè)置不添加大麥苗粉的空白對(duì)照組。

1.3 活菌數(shù)和酸度測(cè)定

乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定采用乳酸細(xì)菌(MRS)固體培養(yǎng)基傾注法，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算菌落總數(shù)；滴定酸度根據(jù)GB 5009.239—2016《食品酸度的滴定》中酚酞指示劑法測(cè)定[8]。

1.4 抗氧化活性測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，以蘆丁當(dāng)量表示（mg/100 g 提取樣）[9]；總酚含量測(cè)定采用Folin Ciocaolteus 法，以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示（mg/100 g 提取量）[10]；超氧化物歧化酶SOD 活力和過(guò)氧化氫酶CAT 活力采用南京建成SOD 試劑盒檢測(cè)；總抗氧化活力測(cè)定參照許尨[11]方法，以維生素C 當(dāng)量表示（mg/100 g）；ABTS、DPPH、O2-、OH-、H2O2自由基清除能力的測(cè)定分別采用對(duì)應(yīng)的方法[12-14]，并計(jì)算IC50值。

1.5 體外消化實(shí)驗(yàn)

取10 g 貯藏1 d 的酸奶于50 mL 離心管中，用10 mL 生理鹽水稀釋，調(diào)整pH 并進(jìn)行模擬口腔（1 min）、胃（1 h）和腸（2 h）的消化[15]。各樣品消化前后，提取和測(cè)定黃酮含量、多酚含量和總抗氧化活性。

1.6 風(fēng)味特征研究

采用SPME-GC-MS 進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定[16]，氣質(zhì)聯(lián)用儀為美國(guó)Agilent 5975C-7890A；毛細(xì)管柱HP-5（30 cm×0.25 mm,0.25 μm）；SUPELCO 萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS），并對(duì)其進(jìn)行定性RI 值和定量Ci值的計(jì)算，采用ROAV 法評(píng)價(jià)關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[17]。通過(guò)電子舌監(jiān)測(cè)酸奶發(fā)酵過(guò)程中味覺(jué)特征的變化。

1.7 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Origin 軟件作圖，SPSS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 自由基清除能力分析

大麥苗有較好的抗氧化功能，大麥苗與酸奶共發(fā)酵后，監(jiān)測(cè)其在不同濃度下對(duì)ABTS、DPPH、O2-、OH-和H2O2自由基的清除率如圖1，自由基清除率達(dá)50%所對(duì)應(yīng)的酸奶濃度（IC50）如表1 所示。大麥苗酸奶對(duì)ABTS、DPPH 和O2-自由基的清除率要顯著高于對(duì)照酸奶，其IC50值較對(duì)照組分別降低26.5%、50.1%和62.4%，但對(duì)OH-和H2O2自由基的清除并不明顯。

2.2 貯藏期間各物質(zhì)含量變化

為了考察貯藏時(shí)間對(duì)酸奶中活性物質(zhì)含量的影響，酸奶于4 ℃條件下貯存，監(jiān)測(cè)4 ℃條件下貯藏1～21 d 的酸奶中活菌數(shù)、滴定酸度、總黃酮、總酚、抗氧化能力，自由基清除能力等的變化如圖2。大麥苗酸奶的初始活菌數(shù)為29.36×108CFU/mL，是對(duì)照酸奶活菌數(shù)的1.8 倍見(jiàn)圖2（a）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大麥苗酸奶和對(duì)照酸奶的活菌數(shù)均逐漸下降，但對(duì)照酸奶的活菌數(shù)下降幅度（21 d 下降61.5%）是大麥苗酸奶（21 d下降14.3%）的4 倍以上，且21 d 后大麥苗酸奶的活菌數(shù)量為對(duì)照組的4 倍。以上說(shuō)明大麥苗與酸奶共發(fā)酵可以增加乳酸菌數(shù)量，并且顯著減緩其在貯藏期間活菌數(shù)下降幅度。無(wú)論是對(duì)照酸奶還是大麥苗酸奶，滴定酸度持續(xù)上升，且大麥苗酸奶的滴定酸度整體要比對(duì)照組高，這可能是因?yàn)榇篼溍缢崮讨泻娜樗峋鷶?shù)量較多導(dǎo)致的。21 d 貯藏后，大麥苗酸奶的滴定酸度為（124±5.6）°T，仍在消費(fèi)者可接受范圍內(nèi)。

圖2 貯藏時(shí)間對(duì)酸奶活菌數(shù)、滴定酸度、總黃酮含量、總酚含量、SOD 酶活性、CAT 酶活性、總抗氧化活力、DPPH 自由基清除率和ABTS 自由基清除率的影響

圖3 體外消化對(duì)總黃酮含量、總酚含量和總抗氧化活力的影響

圖2（c）和（d）顯示，大麥苗酸奶的總黃酮含量在0～5 d 及10～15 d 顯著下降（P＜0.05），到第21 天時(shí)含量比第1 天降低了25.9%。總酚含量在1～10 d 呈下降趨勢(shì)，10～21 d 則保持相對(duì)穩(wěn)定，到21 d 貯藏期結(jié)束時(shí)，較初期水平降低了18.5%。對(duì)照酸奶的總黃酮和總酚含量在5～10 d 有所降低并在后期保持穩(wěn)定。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，整個(gè)貯藏期內(nèi)，大麥苗酸奶的總黃酮和總酚含量都顯著高于對(duì)照酸奶。

圖2（e）和（f）顯示，大麥苗酸奶的SOD 酶活在貯藏中活性一直在下降，到21 d 貯藏期結(jié)束時(shí)，較初期水平降低30%。對(duì)照酸奶幾乎無(wú)SOD 酶活性。CAT 酶活在1～5 d 活性維持不變，5～10 d 明顯降低，后期活性降低幅度減緩，結(jié)束時(shí)較初期水平降低17.6%。對(duì)照酸奶中CAT 酶活性較低，且較初期降低33.3%。圖2（g）顯示，大麥苗酸奶的總抗氧化活力在前期的1～10 d 呈下降趨勢(shì)，之后較為穩(wěn)定，貯藏期降幅為14%。對(duì)照組在貯藏期間保持穩(wěn)定，降幅不顯著。

酸奶為30 mg/mL 時(shí)，大麥苗酸奶的DPPH 和ABTS 自由基清除率在1～10 d 下降明顯，后期較為穩(wěn)定，貯藏期降幅分別為14.9%和8.8%如圖2（h）和（i）。然而對(duì)照組DPPH 自由基清除率基本維持穩(wěn)定，ABTS 自由基清除率下降緩慢。

大麥嫩苗為“堿性食品之王”，可以中和酸性毒素、平衡酸堿，故可能提高乳酸菌對(duì)酸的耐受性，從而增加活菌數(shù)量。各種活性成分分析發(fā)現(xiàn)，大麥苗酸奶具有很好的抗氧化活性，其總黃酮、總酚、SOD 活性、CAT 活性和總抗氧化活性分別是對(duì)照組的3.2 倍、2.2倍、17.4 倍、4.3 倍和2.6 倍，并且對(duì)DPPH 和ABTS 自由基的清除能力顯著高于對(duì)照組。

酸奶中黃酮、多酚、抗氧化酶類物質(zhì)在貯藏期間的穩(wěn)定性直接影響產(chǎn)品感官品質(zhì)，同時(shí)也對(duì)其生物活性和生理功能造成影響。貯藏期活性成分動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，酸奶體系降低了總黃酮、總酚、SOD 酶、CAT酶的貯存穩(wěn)定性，特別是在1～10 d 下降的最為明顯，導(dǎo)致其總抗氧化活性和各種自由基清除效率的下降，但貯藏21 d 后大麥苗酸奶的各種活性物質(zhì)和抗氧化活性還是顯著高于對(duì)照組。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[18]，貯藏期活性物質(zhì)穩(wěn)定性降低的原因可能有如下5 方面：①乳酸菌的分解代謝作用加劇了黃酮、多酚類物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化[19]；②酸奶中蛋白不斷水解使產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)發(fā)生變化[20]，從而影響了黃酮和多酚類物質(zhì)的提??；③酸奶在加工過(guò)程中，熱殺菌和發(fā)酵時(shí)的pH變化使乳中蛋白發(fā)生變性，隱藏在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露，促進(jìn)疏水相互作用及氫鍵的形成[21]，促使酸奶中多酚和黃酮類物質(zhì)與乳球蛋白和酪蛋白發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成沉淀，從而使游離態(tài)的多酚和黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)，進(jìn)而影響了黃酮和多酚類物質(zhì)的提??；④SOD 酶和CAT 酶自身穩(wěn)定性的原因；⑤酸奶體系中酸性環(huán)境與麥苗本身堿性特質(zhì)的沖突。

2.3 體外消化前后的抗氧化分析

將大麥苗酸奶和對(duì)照組酸奶進(jìn)行口腔液（1 min）、胃液（1 h）和腸液（2 h）消化，監(jiān)測(cè)消化前后總黃酮含量、總酚含量和總抗氧化活性變化。模擬口腔消化對(duì)大麥苗酸奶和對(duì)照組的總黃酮、總酚和總抗氧化活力均無(wú)顯著變化，說(shuō)明口腔液對(duì)3 種物質(zhì)影響不大。胃液消化后可提高總黃酮（大麥苗酸奶提高66.8%，對(duì)照組提高2.5%）、總酚（大麥苗酸奶提高196%，對(duì)照組提高396%）和總抗氧化活力（大麥苗酸奶提高79.5%，對(duì)照組提高113.8%），說(shuō)明胃液消化能促進(jìn)3 類成分的釋放，可能是胃蛋白酶和胃酸有利于它們從蛋白、果膠等的交聯(lián)作用中釋放，這與已報(bào)道的結(jié)果相符合[22]。腸液消化后，大麥苗酸奶的總黃酮含量和總抗氧化活力有所下降，但總酚含量維持穩(wěn)定，保持在較高水平，較初始含量提高了438%。腸液消化后，對(duì)照組總黃酮含量維持穩(wěn)定，總酚含量稍有提高，總抗氧化活力稍有下降。大麥苗中多酚在腸液發(fā)生了部分降解，而酸奶中乳蛋白在胰蛋白酶作用下水解釋放了水溶性蛋白，從而掩蓋了大麥苗多酚的損失，因此才導(dǎo)致對(duì)照酸奶總酚含量繼續(xù)升高，而大麥苗酸奶中總酚含量繼續(xù)維持較高水平。綜上，抗氧化活性物質(zhì)主要在胃液消化階段釋放，經(jīng)體外消化后，大麥苗酸奶的總黃酮含量、總酚含量、總抗氧化活力分別比對(duì)照組提高315.7%、20.4%、100.8%。

2.4 大麥苗酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)分析

通過(guò)對(duì)比發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分總離子流圖譜，大麥苗酸奶和對(duì)照酸奶的揮發(fā)性成分較相似。經(jīng)NIST 11 標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)檢索，除去萃取頭帶來(lái)的少量硅氧烷類雜質(zhì)峰和3 組平行樣品中僅個(gè)別檢測(cè)到的峰，利用面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)峰面積百分比，按照酸類、酮類、醛類、醇類、酯類、其它化合物的方式進(jìn)行分類。共檢測(cè)出72 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中大麥苗酸奶檢測(cè)出53 種揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)照組檢測(cè)出47 種揮發(fā)性物質(zhì)。從圖4 可以看出，大麥苗酸奶的酸類和酯類化合物數(shù)量低于對(duì)照組，尤其是酸類化合物，這可能跟大麥苗粉自身的堿性特質(zhì)相關(guān)。大麥苗酸奶中醛類、醇類及芳香烷烴等其它類化合物的數(shù)量高于對(duì)照組，而酮類物質(zhì)的數(shù)量?jī)烧呦嗤?H-吡喃-2-酮，6-己基四氫、2,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯-1-甲醛、十五碳烯醛、戊醇、3-戊基--（2Z）2,4-戊二烯-1-醇、反式-3-甲基-4-辛醇、Z-10-戊烯-1-醇、甲基環(huán)庚醇、順-4-羥基-3-甲基癸酸內(nèi)酯、鄰苯二甲酸，十六-3-基異丁基酯、庚酸2-乙酰氧基甲酯等只在麥苗酸奶中檢出。丁酸、十一酸、二氫-2-甲基-3（2H）-噻吩酮、己醇、1 -氨基-2 -丁醇、1,2-苯二甲酸，雙（2-甲基丙基）酯、癸酸癸酯、苯甲基酯等只在對(duì)照組中檢出。

圖4 酸乳中各類揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量

2.5 關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定

發(fā)酵乳的風(fēng)味是由各揮發(fā)性物質(zhì)的閾值與其在風(fēng)味體系中的濃度共同決定的，為進(jìn)一步確定發(fā)酵乳的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)合共有組分的相對(duì)含量和感覺(jué)閾值，分別確定各樣品組分的ROAV。如表2 顯所示，對(duì)照酸奶中共有6 種揮發(fā)性物質(zhì)的ROAV 大于1，分別是乙醛、乙偶姻、2-壬酮、雙乙酰、2-庚酮和1-庚醇，這些物質(zhì)是混合菌種發(fā)酵對(duì)照酸奶樣品的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)。共有5 種風(fēng)味物質(zhì)（0.1≤ROAV＜1）對(duì)混合菌種發(fā)酵的對(duì)照酸奶樣品總體香氣具有重要修飾作用，分別是辛酸、丁酸、己酸、1-己醇和1-壬醇。乙醛賦予發(fā)酵乳清爽的芳香味；乙偶姻賦予發(fā)酵乳奶香氣、微甜和乳脂氣息[23]；2-壬酮賦予發(fā)酵乳果香、清香及奶油的氣息[24]；雙乙酰賦予發(fā)酵乳奶油香味[25]；2-庚酮有類似梨的水果香味；1-庚醇有油脂氣息和辛辣香氣，近似柑橘的香氣；辛酸在低濃度時(shí)呈水果香氣，但稍高濃度略有不舒適的氣味；丁酸有難聞的酸臭味；己酸帶有類似羊的氣味；1-己醇具有椰子和漿果類的香味；1-壬醇有類似于香茅油氣味。

表2 酸奶的關(guān)鍵性風(fēng)味性物質(zhì)及其對(duì)應(yīng)的ROAV

大麥苗酸奶中共有6 種揮發(fā)性物質(zhì)的ROAV 大于1，分別是雙乙酰、乙偶姻、2-壬酮、2-庚酮、1-庚醇和甲基環(huán)庚醇，這些物質(zhì)是混合菌種發(fā)酵大麥苗酸奶樣品的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)。共有5 種風(fēng)味物質(zhì)（0.1≤ROAV＜1）對(duì)大麥苗酸奶樣品總體香氣具有重要修飾作用，分別是乙醛、2-十一烷酮、1-壬醇、辛酸、δ-十二內(nèi)酯和Z-10-戊烯-1-醇。大麥苗酸奶中乙醛的含量大量降低，雙乙酰是最主要的風(fēng)味物質(zhì)。甲基環(huán)庚醇和Z-10-戊烯-1-醇是大麥苗酸奶中特有的香氣物質(zhì)，加上δ-十二內(nèi)酯（具有椰子果實(shí)的香氣）影響，大麥苗酸奶在風(fēng)味特征上比對(duì)照組有了明顯的變化。

2.6 電子舌對(duì)酸奶的滋味分析

圖5 為酸奶樣品的電子舌雷達(dá)圖。大麥苗酸奶和對(duì)照酸奶在酸味、甜味、澀味、鮮味、豐富度和苦味回味的傳感器中口感差異不明顯。咸味上稍有差別，大麥苗酸奶咸味略大于對(duì)照酸奶。

圖5 酸奶樣品的電子舌雷達(dá)

通過(guò)電子舌監(jiān)測(cè)酸奶在貯藏期間味覺(jué)特征的變化情況如圖6。大麥苗酸奶和對(duì)照酸奶在4 ℃貯藏期間，其咸味、鮮味和澀味變化均不明顯。但兩者的酸味隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并且大麥苗酸奶較對(duì)照組酸味增加明顯，這與滴定酸度結(jié)果一致，說(shuō)明電子舌能夠比較真實(shí)的反應(yīng)酸奶的酸味滋味情況[26]。此外，甜味隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，可能是由于在貯藏期間，乳酸菌還在消耗蔗糖以維持其活性[27]。

圖6 大麥苗酸奶和對(duì)照酸奶貯藏期的動(dòng)態(tài)電子舌雷達(dá)

3 結(jié)論

本文分析大麥苗與酸奶共發(fā)酵及貯存期間，抗氧化活性和風(fēng)味特征的變化結(jié)果顯示，大麥苗酸奶的總黃酮含量（25.9±0.5）mg/100 g、總酚含量（13.0±0.6）mg/100 g、SOD 酶活力（62.6±1.5）U/100 g、CAT 酶活力（5.1±0.2）U/100 g、總抗氧化活力（46.3 ±2.1）mg/100 g，活菌數(shù)29.3×108CFU/mL，分別為非添加對(duì)照酸奶的3.2 倍、2.2 倍、17.4 倍、4.3 倍、2.6 倍、1.8倍，DPPH、ABTS 和O2-自由基清除能力顯著增加。貯藏期活性成分動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，大麥苗酸奶的總黃酮總酚含量、SOD 和CAT 酶活力在1～10 d 下降最為明顯，導(dǎo)致其總抗氧化活性和各種自由基清除效率下降，但貯藏21 d 后大麥苗酸奶的各種活性物質(zhì)和抗氧化活性還是顯著高于對(duì)照組，且貯藏期活菌數(shù)下降減緩（大麥苗酸奶下降14.3%，對(duì)照組下降61.5%），4 ℃貯藏21 d 后，活菌數(shù)為對(duì)照組的4 倍。體外模擬消化結(jié)果顯示，抗氧化活性物質(zhì)主要在胃消化階段釋放，且經(jīng)體外消化后大麥苗酸奶的總黃酮含量、總酚含量、總抗氧化活力分別比對(duì)照組高315.7%、20.4%、100.8%。SPME-GC-MS 共鑒定出71 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，與對(duì)照組相比，大麥苗酸奶的風(fēng)味物質(zhì)組成、各組分相對(duì)含量及關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)都有顯著差異，雙乙酰、乙偶姻、2-壬酮、2-庚酮、1-庚醇和甲基環(huán)庚醇是表征大麥苗酸奶的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。電子舌分析顯示大麥苗酸奶與對(duì)照組在酸味、甜味、澀味、鮮味、豐富度和苦味回味的口感差異不明顯，咸味上稍有差別，并且隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，均表現(xiàn)出酸味增加甜味降低的趨勢(shì)。