馬貴范，郭文學(xué)，楊鳳，閆喜武

（1.威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東 榮成 264300；2.榮成市漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東 榮成 264300；3.大連海洋大學(xué)遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

貝類離水后，能在一段相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)維持生命力，這種離水后能維持生命活動(dòng)的時(shí)間，稱為貝類“露空時(shí)間”[17]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，開發(fā)魚類、海參、蝦蟹等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物與四角蛤蜊等灘涂貝類混養(yǎng)模式，是充分利用養(yǎng)殖水體，拓展養(yǎng)殖空間，優(yōu)化養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能，提高對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，降低養(yǎng)殖污染物排放，實(shí)現(xiàn)生態(tài)養(yǎng)殖的重要途徑與發(fā)展方向[18,19]。生產(chǎn)中，貝類苗種的轉(zhuǎn)運(yùn)是在離水狀態(tài)下進(jìn)行，若“露空時(shí)間”過長，貝類會(huì)因不能從周圍環(huán)境中獲得足夠的氧和排出二氧化碳而死亡。研究結(jié)果表明，不同發(fā)育時(shí)期的灘涂貝類稚貝轉(zhuǎn)移至野外進(jìn)行中間培育，成活率出現(xiàn)從10%～70%不等[20]，這可能與稚貝的發(fā)育時(shí)期和露空時(shí)間有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究了不同發(fā)育時(shí)期的四角蛤蜊幼蟲或稚貝對(duì)空氣暴露的耐受性，以及空氣暴露后的生長存活，探明四角蛤蜊早期生長發(fā)育對(duì)空氣暴露的響應(yīng)，精準(zhǔn)掌握四角蛤蜊不同發(fā)育時(shí)期幼蟲或稚貝的空氣暴露耐受性規(guī)律，更好地指導(dǎo)養(yǎng)殖。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2012 年8 月在莊河市海洋貝類育苗場(chǎng)進(jìn)行，所需四角蛤蜊取自該場(chǎng)的繁殖群體。

1.2 方法

根據(jù)四角蛤蜊早期生長發(fā)育規(guī)律，研究了D 形幼蟲、變態(tài)期幼蟲、30 日齡稚貝和60 日齡稚貝對(duì)空氣暴露的響應(yīng)。根據(jù)日常觀察和預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，每個(gè)時(shí)期的幼蟲或稚貝設(shè)置不同的空氣暴露時(shí)間梯度，研究其對(duì)空氣暴露的響應(yīng)和恢復(fù)自然條件后的生長存活情況。D 形幼蟲為孵化后1 d 的幼蟲，殼長（99.5±5.8）μm；變態(tài)期幼蟲為孵化后15 d 的幼蟲，殼長（246.5±23.9）μm；30 日齡稚貝殼長為（1 065±195）μm；60 日齡稚貝根據(jù)殼長分成大規(guī)格（9.15±0.87）mm、中規(guī)格（7.01±0.71）mm 和小規(guī)格（4.41±0.66）mm。實(shí)驗(yàn)組每組幼蟲數(shù)量約50 個(gè)，稚貝數(shù)量約30 枚，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)?？諝獗┞督Y(jié)束后幼蟲連續(xù)培養(yǎng)7 d、稚貝連續(xù)培養(yǎng)15 d 后觀察其生長情況。

1.2.1 D 形幼蟲在不同空氣暴露時(shí)間下存活率與生長的比較

試驗(yàn)在室溫28.8 ℃，濕度為50%～60%下進(jìn)行。用300 目的篩絹過濾一定數(shù)量的D 形幼蟲，平均分?jǐn)傇? 塊300 目的篩絹（10 cm×10 cm）上，再用干紗布從篩絹網(wǎng)底部吸干水分后，懸空在燒杯（500 mL）中進(jìn)行空氣暴露試驗(yàn)（圖1）。

圖1 幼蟲空氣暴露裝置圖Fig.1 The device diagram of air exposure test for larvae

空氣暴露時(shí)間設(shè)置7 個(gè)梯度：0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min。在各個(gè)時(shí)間組的空氣暴露脅迫完成后，依次將每塊篩絹上的D形幼蟲平均分成三份，每份幼蟲數(shù)量約50 個(gè)，放入28 ℃砂濾海水中培養(yǎng)7 d，期間連續(xù)微量充氣，每日飽食投喂鮮活等邊金藻（Isochrysis galbana）2 次，換水1 次。觀察并記錄培養(yǎng)1 d、4 d 和7 d 時(shí)各組幼蟲的死亡情況；4 d 和7 d 時(shí)測(cè)量各存活組貝殼長，按下式計(jì)算各組的存活率與生長速度。死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)為幼蟲不能上浮和活動(dòng)。幼蟲存活率和相對(duì)日生長（G）按下式計(jì)算：

幼蟲存活率=存活的幼蟲密度/實(shí)驗(yàn)開始的幼蟲密度×100%；

結(jié)合電力電纜故障診斷的具體情況，需要對(duì)各種問題進(jìn)行分析，電網(wǎng)本身不穩(wěn)定，為了保證供電的正常，需要做好故障診斷工作，盡快處理。電力電纜故障的診斷技術(shù)如下：

其中，L0：上一次測(cè)定的殼長（mm）；L1：本次測(cè)定的殼長（mm）；t0：上一次測(cè)定的日齡（d）；t1：本次測(cè)定的日齡（d）；G：相對(duì)日生長。

1.2.2 變態(tài)期幼蟲在不同空氣暴露時(shí)間下的存活率與生長的比較

變態(tài)期幼蟲空氣暴露時(shí)間梯度設(shè)置為0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h 和3 h，空氣暴露時(shí)平均室溫為29 ℃，濕度為50%～60%，空氣暴露脅迫后海水培養(yǎng)的溫度為28 ℃。其他同試驗(yàn)1.2.1。

1.2.3 30 日齡稚貝在不同空氣暴露時(shí)間下的存活率與生長的比較

試驗(yàn)時(shí)平均室溫為29.6 ℃，濕度為50%～60%，時(shí)間梯度設(shè)置為0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h 和10 h。具體操作為：隨機(jī)挑選約1 000 枚稚貝，平均分成9 份，依據(jù)設(shè)置好的空氣暴露時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)時(shí)間梯度設(shè)置3 個(gè)平行?？諝獗┞睹{迫完成后放入正常海水常規(guī)培養(yǎng)15 d，每3 d 測(cè)量一次各組的殼長，其他同試驗(yàn)1.2.1。以光學(xué)顯微鏡下觀察稚貝的貝殼張開或不能正常閉合為稚貝的死亡標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 不同規(guī)格的60 日齡稚貝在不同空氣暴露時(shí)間下的存活率的比較

將60 日齡的稚貝依據(jù)殼長劃分為大（9.15±0.87）mm、中（7.01±0.71）mm、小（4.41±0.66）mm三種規(guī)格。每種規(guī)格每個(gè)時(shí)間梯度的稚貝數(shù)量為30枚，每組設(shè)置3 個(gè)平行。時(shí)間梯度設(shè)置為0 h、6 h、12 h、18 h、24 h 和30 h。其他同試驗(yàn)1.2.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,用LSD 法進(jìn)行組間多重比較，顯著性差異水平設(shè)為P<0.05，Excel 作圖。采用半致死時(shí)間（LT50）來比較對(duì)空氣暴露的耐受能力。用100%存活的最長脅迫時(shí)間到0 存活的最短脅迫時(shí)間內(nèi)的存活率（y）與脅迫時(shí)間（x）進(jìn)行回歸分析，建立回歸方程，根據(jù)回歸方程求半數(shù)致死時(shí)間（LT50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 D 形幼蟲不同空氣暴露時(shí)間下的存活率和生長比較

四角蛤蜊D 形幼蟲空氣暴露脅迫后的存活率結(jié)果如圖2 所示。空氣暴露組的幼蟲恢復(fù)到自然海水培養(yǎng)1 d 的存活率沒有明顯降低（P>0.05）。當(dāng)連續(xù)培養(yǎng)到4 d 甚至更長（7 d）時(shí)，隨著空氣暴露時(shí)間的延長，幼蟲存活率顯著下降（P<0.05）?？諝獗┞稌r(shí)間范圍在80 min 內(nèi)，各處理組的存活率（4 d 和7 d）與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）；空氣暴露時(shí)間超過100 min，存活率顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

圖2 D 形幼蟲不同空氣暴露時(shí)間下的存活率Fig.2 The survival rate of D-shaped larvae in different air exposure periods

圖3 變態(tài)期幼蟲在不同空氣暴露時(shí)間下的存活率Fig.3 The survival rate of metamorphosis-stage larvae in different air exposure periods

經(jīng)過短時(shí)間（20 min）空氣暴露的D 形幼蟲恢復(fù)到正常海水培養(yǎng)0～4 d 與對(duì)照組相比表現(xiàn)出了一定的生長優(yōu)勢(shì)，但優(yōu)勢(shì)不明顯：4 d 兩者殼長有顯著差異（P<0.05），0～4 d 相對(duì)日生長無顯著差異（P>0.05，表1）；但連續(xù)培養(yǎng)7 d，對(duì)照組的相對(duì)日生長顯著高于其他空氣暴露組（P<0.05）。在整個(gè)培養(yǎng)期間，20 min 空氣暴露組的D 形幼蟲生長速度快于其他處理組，但差異不顯著（P>0.05）；空氣暴露100 min 后D形幼蟲的相對(duì)日生長最小，說明長時(shí)間的空氣暴露不僅對(duì)D 形幼蟲的存活有顯著影響（P<0.05），也會(huì)降低D 形幼蟲的生長速度。

表1 D 形幼蟲不同空氣暴露時(shí)間后的殼長和相對(duì)日生長Tab.1 The shell length and relative growth of D-shaped larvae in different air exposure periods

2.2 變態(tài)期幼蟲在不同空氣暴露時(shí)間下的存活率和生長的比較

空氣暴露后，變態(tài)期幼蟲的存活率，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長先降低（1～4 d）后保持平衡（4～7 d）。在相同的培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi)，隨著空氣暴露時(shí)間的延長，幼蟲的存活率顯著降低（P<0.01）。培養(yǎng)1 d 時(shí)，0.5 h處理組的存活率為100%，1 h 和1.5 h 次之，均與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05），空氣暴露2 h 幼蟲的存活率顯著降低（P<0.05），超過3 h 幼蟲全部死亡。當(dāng)

注:同列中具有相同字母的平均值間差異不顯著（P>0.05），具有不同字母的平均值間差異顯著（P>0.05），下同。

Note:the same letters in the same column are not significant differences（P>0.05）,and means with the different letters in the same column are significant differences（P<0.05）,et sequentia.培養(yǎng)至4 d 甚至7 d 時(shí)，對(duì)照組的存活率最高，0.5 h和1 h 次之，但二者顯著低于對(duì)照組（P<0.05）（圖2）。

空氣暴露對(duì)變態(tài)期幼蟲的生長影響結(jié)果見表2。在前期（0～4 d），空氣暴露對(duì)變態(tài)期幼蟲的生長表現(xiàn)為無序性，生長速度除空氣暴露1 h 和空氣暴露2.5 h 組高于對(duì)照組（P>0.05）外，其他各組均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），空氣暴露1.5 h 的生長速度最慢。在后期（4～7 d），幼蟲經(jīng)過空氣暴露后，生長速度顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；其他處理組之間部分存在顯著性差異（P<0.05），如空氣暴露1.5 h 和空氣暴露2 h 組的相對(duì)日生長最大，分別顯著高于空氣暴露1 h 組和2.5 h 組（P<0.05），其中空氣暴露1 h 組的相對(duì)日生長最低。

表2 變態(tài)期幼蟲不同空氣暴露時(shí)間后的殼長和相對(duì)日生長Tab.2 The shell length and relative daily growth of metamorphosis-stage larvae in different air exposure periods

2.3 30 日齡稚貝在不同空氣暴露時(shí)間下的存活率和生長的比較

30 日齡稚貝（殼長1.13～1.25 mm）經(jīng)過空氣暴露脅迫后，正常海水培養(yǎng)1 d 的存活率與培養(yǎng)15 d的存活率無差異（圖4）?？諝獗┞? h 內(nèi)，稚貝存活率為100%；稚貝100%死亡的最短空氣暴露時(shí)間為6 h；在2～6 h 內(nèi)，隨著空氣暴露時(shí)間的延長，存活率顯著降低（P<0.05），空氣暴露時(shí)間為4 h，存活率約為50%。

圖4 30 日齡稚貝在不同空氣暴露時(shí)間下的存活率Fig.4 The survival rate of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

30 日齡稚貝經(jīng)過空氣暴露后的生長情況見表3 和表4。海水培養(yǎng)3 d 時(shí)，空氣暴露組稚貝的生長和對(duì)照組無顯著差異（P<0.05）；繼續(xù)培養(yǎng)至6 d 時(shí)，除空氣暴露4 h 組的相對(duì)日生長顯著高于對(duì)照組外（P<0.05），其他各處理組稚貝的的相對(duì)日生長與對(duì)照組無顯著性差異（P>0.05）；在培養(yǎng)的后期（6～15 d），各處理組的生長和對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）；各處理組之間的平均日生長也無顯著差異（P>0.05）。從整個(gè)培養(yǎng)階段看，空氣暴露對(duì)1 mm 左右的稚貝生長無顯著性影響。

表3 30 日齡稚貝在不同空氣暴露時(shí)間下的殼長Tab.3 The shell length of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

表4 30 日齡稚貝不同空氣暴露時(shí)間下的相對(duì)日生長Tab.4 The relative daily growth of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

2.4 60 日齡不同規(guī)格的稚貝在不同空氣暴露時(shí)間的存活率比較

從圖5 看出，60 日齡大規(guī)格稚貝100%存活的空氣暴露時(shí)間為18 h；中規(guī)格稚貝100%存活的空氣暴露時(shí)間為6 h；小規(guī)格稚貝（4.41±0.66）mm 空氣暴露6 h 的存活率約為93%。大規(guī)格稚貝空氣暴露24 h 出現(xiàn)死亡，100%存活率的最長空氣暴露時(shí)間在18～24 h，空氣暴露24～30 h，存活率急劇下降，空氣暴露30 h 無存活；中規(guī)格稚貝空氣暴露12 h存活率為77.8%，100%存活的最長空氣暴露時(shí)間在6～12 h，空氣暴露時(shí)間超過30 h，稚貝全部死亡；小規(guī)格稚貝空氣暴露6 h 開始出現(xiàn)死亡，空氣暴露24 h 無存活。

圖5 60 日齡稚貝在不同空氣暴露時(shí)間下的存活率Fig.5 The survival rate of 60-day-old juveniles in different air exposure periods

取大、中、小三種規(guī)格稚貝的100%存活的最長空氣暴露時(shí)間和0 存活的最短空氣暴露時(shí)間內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)存活率（y，%）與空氣暴露時(shí)間（x，h）直線相關(guān)顯著（P<0.05）。直線方程依次為y=-8.3333x+255.56（R2=0.9643），y=-4.537x+129.44（R2=0.9558）和y=-5.7778x+130（R2=0.9074）。根據(jù)直線方程分別求出大，中和小規(guī)格稚貝的半致死時(shí)間分別為24.7 h、17.5 h 和13.8 h。60 日齡稚貝的耐空氣暴露能力為大規(guī)格>中規(guī)格>小規(guī)格。

3 討論

3.1 四角蛤蜊在不同發(fā)育時(shí)期的耐空氣暴露能力比較

空氣暴露對(duì)貝類存活率影響的研究已見于巨牡蠣（Crassostrea gigas）[21，26]、毛蚶（Scapharca subcrenate）[22]、長竹蟶（Solen stritus）[23]、海灣扇貝（Argopecten irradians）[24]、硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）[25]、橄欖蚶（Estellarca olivacea）[27]、扇墨西哥灣貝（Argopecten irradians concentricus）[28]、彩虹明櫻蛤（Moerella iridescen）[29]、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）[30]、文蛤（Meretrix meretrix）[31]和蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）[32]等。貝類的耐空氣暴露能力不僅與種類和空氣暴露時(shí)間的長短有關(guān)，還與貝類所處的發(fā)育時(shí)期及規(guī)格密切相關(guān)[24、26、30]。本研究中，不同發(fā)育時(shí)期的四角蛤蜊幼蟲或稚貝對(duì)空氣暴露的耐受性不同，同一發(fā)育階段不同規(guī)格的稚貝對(duì)空氣暴露的耐受能力也有較大的差異。以LT50為依據(jù)，得出四角蛤蜊不同發(fā)育時(shí)期的耐空氣暴露能力為：稚貝>變態(tài)期幼蟲>D 形幼蟲。與其他貝類不同發(fā)育時(shí)期的耐空氣暴露能力排序有所不同。海灣扇貝耐空氣暴露能力大小為：眼點(diǎn)幼蟲＞D 形幼蟲＞稚貝，太平洋牡蠣為：眼點(diǎn)幼蟲>殼頂中期幼蟲>稚貝>D 形幼蟲[24、26]。這可能與不同貝類不同發(fā)育時(shí)期殼的厚薄易碎程度以及試驗(yàn)條件有關(guān)。四角蛤蜊D 形幼蟲和變態(tài)期幼蟲個(gè)體較小，殼薄易碎，離水后在較高室溫下水分蒸發(fā)較快，耐空氣暴露能力較低；稚貝的結(jié)構(gòu)和成貝相似，軟體部儲(chǔ)存部分水分，露空后暫時(shí)利用那部分水分維持自身體內(nèi)代謝，忍受空氣暴露的時(shí)間較幼蟲期長。在相同條件下，不同規(guī)格的四角蛤蜊稚貝的耐空氣暴露能力隨規(guī)格的增加而增大，這與蛤仔對(duì)空氣暴露耐受性的研究結(jié)果相一致[30]。因此，在四角蛤蜊苗種繁育、灘涂放養(yǎng)及運(yùn)輸過程中，應(yīng)避免長時(shí)間空氣暴露，尤其是早期幼蟲階段。

3.2 空氣暴露對(duì)不同發(fā)育階段的幼蟲、稚貝生長的影響

空氣暴露脅迫除影響貝類的存活外，還影響生長的貝類。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）個(gè)別空氣暴露組（20 min）在前期（0～4 d）D 形幼蟲具一定的生長優(yōu)勢(shì)，但繼續(xù)培養(yǎng)至7 d 時(shí)，不僅生長優(yōu)勢(shì)消失，生長速度顯著減慢；（2）培養(yǎng)前期（0～4 d）變態(tài)期幼蟲在較對(duì)照組沒有明顯的生長優(yōu)勢(shì)，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長（4～7 d），生長速度快于對(duì)照組；（3）4 h 的空氣暴露脅迫對(duì)稚貝的生長影響很小，基本上與對(duì)照組同步,表明不同發(fā)育時(shí)期的幼蟲或稚貝經(jīng)過空氣暴露脅迫后的生長情況不同。而Hiwatari 等[10]對(duì)蛤仔的研究表明，稚貝在空氣暴露脅迫完成后期（7～14 d）出現(xiàn)明顯的生長優(yōu)勢(shì)。肖友翔[33]等對(duì)日本海神蛤（Panopea japonica）的研究表明，干露處理后，殼長約1.70 mm 日本海神蛤稚貝瞬時(shí)生長率顯著高于對(duì)照組，存在補(bǔ)償生長現(xiàn)象。這與四角蛤蜊稚貝空氣暴露脅迫后生長情況有所差別，說明空氣暴露對(duì)貝類產(chǎn)生的影響既與不同種類有關(guān)，也受早期生長發(fā)育階段、培育時(shí)長及實(shí)驗(yàn)條件的影響。

3.3 小結(jié)

四角蛤蜊D 形幼蟲空氣暴露80 min 內(nèi)7 d 的存活率與對(duì)照組無顯著差異，但7 d 后生長顯著低于對(duì)照組，建議D 形幼蟲期間盡量不要離水，若離水，露空時(shí)間不要超過20 min；變態(tài)期幼蟲空氣暴露時(shí)間控制在1.5 h 內(nèi)，存活率依然很高，后期生長速度顯著高于對(duì)照組，說明四角蛤蜊幼蟲變態(tài)期間適當(dāng)?shù)乜諝獗┞叮欣诖碳び紫x的變態(tài)發(fā)育，在生產(chǎn)中，可以通過換水等方式對(duì)變態(tài)期幼蟲適當(dāng)空氣暴露，以提高變態(tài)率；30 日齡稚貝空氣暴露2 h存活率仍可保持在100%，空氣暴露后對(duì)稚貝的生長沒有顯著差異，也不會(huì)降低，運(yùn)輸30 日齡稚貝只適合短途運(yùn)輸（≤2 h）；60 日齡的稚貝運(yùn)輸時(shí)若保證100%的存活率，殼長約為9 mm 的稚貝可運(yùn)輸18 h，7 mm 可運(yùn)輸6 h，4 mm 運(yùn)輸時(shí)間要小于6 h。實(shí)驗(yàn)觀察受精卵空氣暴露5 min 后均不能孵化成D形幼蟲，受精卵應(yīng)避免出現(xiàn)露空時(shí)間。