楊 濤, 牛茵茵, 向極釬, 張 馳, 商龍臣

(湖北民族大學生物與食品工程學院1,恩施 445000)(恩施土家苗族自治州農(nóng)業(yè)科學院2,恩施 445000)

硒是一種人體必要的微量元素,其缺乏往往導致多種疾病如大骨節(jié)病、克山病和癌癥等[1]。硒的營養(yǎng)價值日漸為人所知,各類富硒食品如富硒茶、富硒大米、富硒麥芽等也不斷出現(xiàn)在消費者的視野中。膳食硒是決定機體中硒元素生物利用度的關鍵因素之一,隨著居民健康意識不斷地提高,富硒食品成為了當前消費者主流的補硒途徑[2, 3]。

活性硒肽不僅是優(yōu)質(zhì)的硒補充劑,更是生物活性肽的重要組成部分。生物活性肽是一類廣泛存在于動、植物及微生物蛋白中的天然小分子聚合物,一般由2～20個氨基酸組成[4]。食源性活性肽具有免疫原性低、特異性強、毒性低等優(yōu)點,其潛在的健康益處也使其常被用作功能性食品與新型藥物的生產(chǎn)與開發(fā)中[5, 6]。隨著硒肽促健康作用研究不斷地深入,研究人員充分報道了硒肽的相關研究。如賈蕾等[7]重點論述了硒肽的生物活性并揭示了硒肽在體內(nèi)的抗氧化機制。黃繼紅等[8]評價了當前硒肽的主要制備方法及其生物利用度體系。Zhang等[9]綜述了硒肽結構與活性之間的關系,并總結了硒肽的分離、純化和鑒定過程中的關鍵技術。這些研究在硒肽制備及相關活性研究中發(fā)揮著重要作用,但受到我國硒資源分配不均及生產(chǎn)技術的限制,硒肽主要從富硒植物中獲取[7, 10]。硒肽的相關研究主要集中于傳統(tǒng)酶解法制備硒肽、硒肽的分離與純化等方面,此類方法存在周期長、效率低等問題。利用新興的計算機技術輔助制備活性肽并探究其生物學功能與作用機制的方法有效緩解了天然活性肽在上述研究的痛點,而在硒肽相關研究中則并不多見。

綜述了當前國內(nèi)外硒肽的生物活性、制備方法及生物信息技術輔助活性肽制備方面的研究進展,以期為硒肽在功能性食品、硒補充劑或肽類藥物的開發(fā)與應用方面提供參考。

1 硒肽的生物學功能

探究源于富硒農(nóng)產(chǎn)品中硒蛋白、硒肽的生物活性一直以來都是硒營養(yǎng)學領域的研究熱點[11]。相比硒蛋白,硒肽更易于被人體消化與吸收,且本身也兼具抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學功能。因此,探究這些小分子化合物的生物活性具有重要意義。

1.1 抗氧化活性

機體的新陳代謝往往會產(chǎn)生活性氧類自由基,當自由基的生成累積達到一定量時,則會導致氧化應激[12],進而導致心血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生,損害人體健康[13]。因此,攝入外源性抗氧化劑對于維持機體氧化還原狀態(tài)至關重要。Zhu等[14]研究發(fā)現(xiàn),分子質(zhì)量小于1 ku的碎米薺混合硒肽對D-半乳糖誘導的氧化應激小鼠具有一定的抗氧化和抗疲勞功能。

在肽類抗氧化劑中,部分氨基酸也具有一定的抗氧化活性,如:芳香族氨基酸(Tyr、Trp、Phe和His)可貢獻自身電子將自由基轉化為穩(wěn)定物質(zhì)[15]。Li等[16]研究表明,硒肽清除自由基的能力強于非含硒肽,且硒肽中的硒含量與其抗氧化能力呈正相關關系。而硒具有抗氧化特性得益于硒元素的外層電子結構疏松,是良好的親核試劑。研究表明,含硒化合物與活性氧類自由基發(fā)生反應時,生成的含Se-O鍵氧化物無法形成π鍵,導致含Se-O共價鍵氧化物易發(fā)生還原反應[17],含硒化合物也因此具有良好的抗氧化活性。

1.2 免疫調(diào)節(jié)活性

免疫系統(tǒng)是機體預防和控制各類疾病的自主防御系統(tǒng)[18]。免疫活性肽主要通過增強免疫細胞功能或提高免疫細胞因子活性等方式在人體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用[19]。Wu等[20]探究了2種源自富硒水稻的硒肽(T-Se-MMM和Se-MDPGQQ)對Pb2+誘導的小鼠海馬體HT22細胞氧化應激的神經(jīng)保護機制,其研究結果表明,2種硒肽通過增強HT22細胞活力和減少此細胞凋亡的方式抑制Pb2+誘導的細胞毒性作用,小鼠HT22細胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性則分別提高了47.79%和13.93%,谷胱甘肽過氧化物酶活性也分別提高了94.7%和78.73%。王程等[21]的研究表明含硒65肽(Se-ZnCu-65P)可有效增強由脂多糖誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力。

1.3 抗高血壓活性

高血壓是導致心腦血管疾病、腎臟疾病的首要風險因素[22],其影響范圍甚廣、發(fā)病機制復雜,且降壓藥副作用明顯[23, 24]。因此,食物中天然具有抗高血壓活性的多肽日漸引起了相關學者的關注[25],硒肽被認為是一種相對安全的血壓管理補充劑。研究最廣泛的具有抗高血壓活性的多肽是血管緊張素轉換酶(Angiotensin-Converting Enzyme,ACE)抑制肽。ACE可將無活性的血管緊張素Ⅰ(Angiotensin I,ANG Ⅰ)轉化為有活性的血管收縮劑即:血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,ANG Ⅱ),從而導致血壓上升。高東方等[26]表明使用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶共同水解條件下制備的ACE抑制肽活性顯著高于其他單一蛋白酶水解制備的ACE抑制肽活性(P<0.05)。陳冰冰等[27]制備了富硒辣木葉蛋白ACE抑制肽,其ACE抑制率達到88.97%。

1.4 其他功能活性

研究人員還發(fā)現(xiàn)了硒肽的其他生物活性。如Liao等[28]制備了一種具有抗癌功能的含硒核桃肽(WP1-Se-NPs),并發(fā)現(xiàn)其能通過誘導人乳腺癌細胞MCF-7發(fā)生S期(DNA合成期)細胞停滯和DNA斷裂方式使MCF-7細胞凋亡。Liu等[29]研究表明,富硒大豆肽提高了細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶活性,從而效緩解了由CCl4引起的肝細胞纖維化。Wu等[30]研究表明源自富硒蛹蟲草的2種硒肽(VPRKL-Se-M和RYNA-Se-MNDYT)對腸道菌群及神經(jīng)炎癥具有一定的調(diào)節(jié)作用。

2 硒肽的制備方法

2.1 酶促水解法

酶促水解法是活性肽制備最常用的方法,因其操作簡單且不破壞其他營養(yǎng)物質(zhì)而被廣泛應用于硒肽的制備[31, 32]。生產(chǎn)活性肽的商業(yè)酶制劑主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶等。酶的作用位點是影響多肽分子質(zhì)量及其活性的關鍵因素之一,研究人員根據(jù)測定不同蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解度進而判斷酶對蛋白的水解效率,經(jīng)鑒定后篩選出目標肽段[33]。盡管不能通過酶切位點直接確定水解產(chǎn)物的氨基酸序列與活性,但相關研究表明,使用枯草桿菌蛋白酶水解的產(chǎn)物比使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的產(chǎn)物具有更高的生物活性[34, 35]。賈蕾等[36]使用堿性蛋白酶酶解碎米薺硒蛋白,并發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于1 ku碎米薺硒肽具有良好的體外抗氧化活性,所得硒肽的硒含量為362.378 mg/kg。雖然酶促水解法是一種高效且能有效控制酶解程度的方法,但在實際生產(chǎn)應用中需要反復試錯,且酶解產(chǎn)物種類繁多,品控困難。

2.2 化學合成法

化學合成法是一類基于已鑒定出氨基酸序列的多肽直接合成方法,因保護基形態(tài)不同分為液相合成法與固相合成法[37]。液相合成法是在液態(tài)保護基下使用縮合劑將氨基酸添加至多肽鏈上,或分段縮合以制備目標肽段。Shimodaira等[38]使用液相合成法合成了硒谷胱甘肽(G-Se-H)類似物G-Se-G,其產(chǎn)率高達98%。液相合成法具有成本低、適用范圍廣、保護基種類多等優(yōu)勢,但因其存在操作難度大及產(chǎn)品分離復雜等問題,主要適用于短鏈肽的生產(chǎn)[39, 40]。固相合成法則是將氨基酸的C端固定在樹脂載體后,將其N端與第2個活化的氨基酸通過縮合反應連接,以此制備目標肽鏈。相比液相合成法,固相合成法具有操作簡便、易實現(xiàn)自動化、產(chǎn)物易分離等優(yōu)勢,適用于中長肽或肽類藥物的制備[39]。鄒險峰[41]利用固相合成法成功合成含硒8肽(Se8P,DGR-SeC-SeC-RGD),并發(fā)現(xiàn)其能高效誘導人黑素瘤A375細胞凋亡。Fang等[42]以源自富硒大米蛋白水解物中的含硒肽為參照,使用固相合成法合成了硒肽T-SeM-MM,其純度高達98%,發(fā)現(xiàn)其具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。

隨著固相合成法在多肽生產(chǎn)、制藥領域的廣泛應用與發(fā)展,多肽固相合成系統(tǒng)也隨之出現(xiàn)。有些儀器合成公司開發(fā)了多肽合成儀器產(chǎn)品,但因其價格昂貴、維護成本高而未能廣泛應用。Nathaniel等[43]使用化學實驗室常見流體處理部件設計出一款經(jīng)濟的多肽固相合成系統(tǒng),該系統(tǒng)實現(xiàn)了以每個氨基酸殘基1美元的成本生產(chǎn)合成多肽,大幅降低了多肽定向合成的價格。

2.3 多肽的硒化修飾

將無機硒與天然多肽螯合轉化為有機硒的多肽硒化修飾方法主要是利用Se4+可以提供的4d空位軌道與提供孤對電子的N和O元素形成配位鍵,以實現(xiàn)多肽的硒化修飾。相關研究表明,Se螯合的主要基團是—NH2與—NH,而—COOH也參與螯合過程中配位鍵的形成[9]。Li等[44]使用螯合方法制備了具備抗癌活性的硒肽ACBP-S-Se,其研究結果表明,ACBP經(jīng)巰基化修飾后,以巰基作為Se的結合位點,形成了ACBP-S-Se肽。Ye等[45]以大豆分離蛋白肽(SPIPs)為對象,螯合制備硒肽Se-SPIPs,其研究結果證實了Se-SPIPs相比SPIPs具備更強的羥基自由基清除活性,且發(fā)現(xiàn)Se-SPIPs通過增強抗氧化酶的活性的方式修復了由H2O2介導Caco-2細胞的氧化損傷。

目前,經(jīng)典酶解法制備硒肽還存在效率低、純化難度大、時間成本高及與其他活性成分作用產(chǎn)生協(xié)同效應等諸多問題,但解析天然硒肽的精確結構是化學合成硒肽的前期基礎[46, 47]。硒化修飾法制備硒肽雖操作簡便,但此法的硒肽制備效率較低,無法滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。因此,優(yōu)化傳統(tǒng)硒肽制備方法、提高硒肽的制備效率是硒肽工業(yè)發(fā)展的必然趨勢。隨著計算機技術的發(fā)展,生物信息學方法利用數(shù)據(jù)庫中有效信息,在優(yōu)化多肽制備工藝及多肽活性驗證中發(fā)揮了重要作用,有望為促進傳統(tǒng)方法提供強大的驅動力。

3 生物信息學在多肽制備中的應用

生物信息技術是一種結合計算機科學、生命科學、統(tǒng)計分析學及數(shù)學對復雜生物數(shù)據(jù)進行采集、處理、存儲、分析和解釋,從而揭示其所賦有的生物學特性的方法[48]。生物信息學方法在多肽制備主要有以下三方面的應用:評估蛋白質(zhì)作為生物活性肽前體的潛力;模擬酶解并計算關鍵工藝參數(shù);識別新型活性肽并確定其生物活性[34,49]。這類方法能大幅度降低時間與經(jīng)濟成本,且在蛋白質(zhì)和多肽的結構、活性預測、構效關系、釋放特定活性肽的酶切位點等研究中有著重要意義,因而倍受國內(nèi)外學者關注[50-52]。

3.1 蛋白模擬酶解及多肽活性預測

蛋白模擬酶解是一種利用數(shù)據(jù)庫(如:NCBIProteinDatabase)檢索獲得蛋白質(zhì)序列,再結合目標需求選擇虛擬蛋白酶進行酶切,從而獲得活性肽序列的方法。其操作流程如圖1所示,首先使用多肽數(shù)據(jù)庫(如:BIOPEP-UMW)中“Profilesofpotentialactivity”工具對檢索得到的蛋白質(zhì)進行評估,該工具是利用已知的肽序與其活性之間的關系檢索出蛋白質(zhì)內(nèi)潛在的活性肽片段類型與位置,并計算出生物活性肽片段出現(xiàn)頻率[53]。使用在線模擬酶解工具“Enzyme(s) action”基于酶的切割位點對蛋白質(zhì)執(zhí)行模擬酶解[54]。模擬酶解后,將得到的序列輸入至多肽活性預測程序(如:PeptideRanker),并根據(jù)程序給出的預測得分值(超過0.5即認為該多肽具有生物活性[55])篩選出具有活性的多肽片段,結合多肽數(shù)據(jù)庫(如:BIOPEP-UMW)中已有的生物活性肽序列分析肽段的生物活性。此外,一些模擬酶解相關工具在分析多肽生物活性中顯示出強大的能力與優(yōu)勢,如PepCalc可預測多肽的理化性質(zhì),NCBI網(wǎng)站中的BLAST分析工具可用于分析蛋白質(zhì)和多肽之間的同源性以評估其功能等,現(xiàn)將蛋白、多肽數(shù)據(jù)庫及模擬酶解相關工具列于表1。

表1 蛋白、多肽數(shù)據(jù)庫及模擬酶解相關工具[59-72]

圖1 蛋白模擬酶解的流程(圖片字體有修改)

隨著活性肽潛在的健康益處逐漸清晰,這種利用計算機工具和數(shù)據(jù)庫資源獲得活性肽序列的方法被廣泛報道。周湘人等[56]研究表明,大米谷蛋白經(jīng)虛擬蛋白酶模擬酶解后得到的虛擬活性肽主要為二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽及ACE抑制肽,且兩類活性肽均無細胞毒性。Ma等[57]使用PeptideCutter工具模擬酶解了來自青蛙表皮分泌的GV30蛋白,發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物中的一條多肽(GV21)對金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用。Fu等[58]使用PepideRanker程序對模擬酶解的多肽進行活性預測發(fā)現(xiàn),FP與WG兩種二肽的預測得分值均為0.99,FP多肽已在西班牙曼切戈奶酪中發(fā)現(xiàn)并鑒定為ACE抑制肽(IC50=1 215.7 μmol/L),而與FP相同得分的WG鮮見報道,其是否具有生物活性還有待進一步評估。盡管PeptideRanker程序不能100%的預測出肽的生物活性,但因其操作簡便、預測速度快等優(yōu)勢,該程序仍然適合作為基于結構與肽活性關系的初步探索工具。

3.2 神經(jīng)網(wǎng)絡模型在多肽制備中的應用

神經(jīng)網(wǎng)絡(Artificial Neural Network,ANN)模型是一種基于生物神經(jīng)網(wǎng)絡原理建立的數(shù)據(jù)模擬系統(tǒng)。ANN模型是通過擬合現(xiàn)有數(shù)據(jù)的規(guī)律的方式,探索數(shù)據(jù)中復雜系統(tǒng)關系的人工智能技術之一[73]。ANN因高度的并行性、獨特的魯棒性(Robust的音譯,指計算機軟件或者程序在輸入錯誤、網(wǎng)絡過載、磁盤故障等異常狀況下計算機或程序不死機、崩潰的能力)和具有自我學習能力等優(yōu)點,在解決非線性、非穩(wěn)定態(tài)的工藝優(yōu)化及過程模擬等問題中得到了廣泛應用[74, 75]。相關研究表明,在復雜的非線性多元建模中,ANN模型比Box-Behnken響應面(Response Surface Methodology,RSM)模型具有更高精度的擬合響應值及預測值,且ANN模型正在發(fā)展為RSM模型方法的代替方案[76, 77]。劉盟夢等[78]使用ANN模型模擬了牡蠣蛋白酶解程度與OH-自由基清除活性間的關系,其模型相關系數(shù)為0.994 3,實現(xiàn)了牡蠣抗氧化活性肽的可控制備。岳陽等[79]使用ANN模型及遺傳算法方法共同優(yōu)化了大米抗氧化肽酶解工藝,在最佳工藝條件下制備的大米抗氧化肽其ABTS自由基清除率達到82.22%。

隨著人工智能技術的高速發(fā)展,ANN模型不僅應用于優(yōu)化工藝過程,還在多肽的活性預測[80]、定量構效關系(Quantitative Structure-Activity Relationship,QSAR)模型的建立[81]、質(zhì)譜解析[82]、多肽毒性預測[82]及多肽含量檢測[83]等領域中發(fā)揮著重要應用。

3.3 分子對接技術在多肽制備方面的應用

分子對接(Molecular Ducking)技術是通過計算機程序預測與評估配體和受體間的結合過程的方式來探究小分子物質(zhì)(如:活性肽)作用機制的重要工具[84, 85]。該技術是基于幾何與能量互補的原則,將配體分子結合到受體的口袋(活性位點)上,并通過算法給出的得分值實時評價配體對受體目標結合的特異性,找到兩分子結合最佳狀態(tài)的方法。Zhang等[86]使用AutoDock 4.2軟件以最小結合能為指標(Binding Energy)完成了84條分子質(zhì)量小于1 ku的硒肽與DPPH分子對接,并收集了7條結合自由能小于-5 kcal/mol的硒肽,人工合成了上述7條肽段后驗證了其抗氧化活性結果表明,抗氧化能力最弱的硒肽(RVSeMI)清除DPPH的EC50為5.65 mmol/L。隨著核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)光譜和X射線晶體衍射(X-ray diffraction,XDR)等蛋白質(zhì)結構解析技術的發(fā)展,分子對接技術已被廣泛應用于多肽藥物的探索,如篩選抗癌細胞增殖肽[87]、ACE抑制肽[88]和DPP-Ⅳ抑制肽[89]等。

目前,用于學術研究及商業(yè)應用開發(fā)的分子對接程序約有60多種,包括Duck、AutoDuck、FlexX、Glide、GOLD等。在多肽藥物設計的實際應用中,預測準確性與位姿預測的正確性主要取決于肽的柔性鍵數(shù)量、程序的構象搜索算法和結果評價方法[90]。而啟發(fā)式遺傳算法在解決構象搜索及全局優(yōu)化問題上受到了研究人員的普遍認可,有關常用的分子對接軟件內(nèi)在算法及打分函數(shù)情況如表2所示[91, 92]。評估這些程序的關鍵因素包括:蛋白質(zhì)與配體復合物評估的正確率、位姿預測正確性、目標蛋白質(zhì)因素、配體富集率、處理時間、均方根偏差(Root Mean Square Deviation,RMSD)、配體富集率、接收器操作特性(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲線和統(tǒng)計顯著性結果等[93]。Oda等[94]評估了458種復合物對GOLD、eHiTS 2009、AutoDock 4.0、Auto Dock Vina、Fred 2.2.3和DOCK 6.3的配體結合程序,結果表明GOLD、eHiTS和Fred的成功率優(yōu)于AutoDock、AutoDock Vina和DOCK(AutoDock Vina>AutoDock),并表明在對接計算之前應該對配體分子進行一些構象搜索。

生物信息技術因其操作方便且近乎沒有資源消耗,在非修飾肽的制備及活性探究等領域已經(jīng)得到了廣泛應用。此類技術在硒肽制備上的應用并不多見,其主要原因可能有:1)硒與多肽均可具備一定的生物學功能,硒肽的生物學功能便更為復雜;2)硒肽相關數(shù)據(jù)的數(shù)量不能滿足揭示其構效關系,導致一些工具還不支持硒蛋白、硒肽和硒代氨基酸使用;3)計算機輔助工具的算法及蛋白質(zhì)的數(shù)字結構信息難以達到100%的準確度。因此,在使用這些工具輔助工具的同時還應結合實際情況進行驗證以及對程序算法進行優(yōu)化修正。

4 結語

隨著人們對硒營養(yǎng)價值探索不斷深入,生物活性含硒肽作為硒補充劑的重要載體,其對人體健康的重要性已深入人心,也促使相關科研工作者持續(xù)地開展深入研究。然而,盡管有關含硒肽的分離純化和及其生物學功能的報道日漸增加,但關于人工合成硒肽的安全性、硒肽能否完整進入體內(nèi)并發(fā)揮其生物學功能等問題,仍缺乏深入的研究與系統(tǒng)性的評估。此外,硒肽的傳統(tǒng)制備方法往往耗時長,產(chǎn)物純度低且缺乏有效的遞送手段,極大地制約了生物活性含硒肽的研究與應用。未來,硒肽的制備應在傳統(tǒng)的方法上不斷與蛋白質(zhì)組學、多肽組學及生物信息學等方法的相結合,以更加清晰明確的路徑指導生物活性含硒肽的制備,推動硒肽產(chǎn)業(yè)高效、快速且穩(wěn)定地發(fā)展。