趙心雨，林海濤

（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006）

石油資源的逐漸減少和社會(huì)工業(yè)的不斷發(fā)展，以及不可生物降解的合成聚合物材料加劇了環(huán)境污染，使得纖維素、大豆蛋白和動(dòng)物毛發(fā)角蛋白這類(lèi)可生物降解并可再生的天然高分子聚合物受到人們的重視[1]。其中鴨毛除了用作填料的少量隔熱材料外，大多數(shù)都被丟棄，導(dǎo)致其利用率不高，這不僅浪費(fèi)了大量的動(dòng)物蛋白資源，還污染了人們賴以生存的環(huán)境[2]。合理提取現(xiàn)有鴨毛蛋白資源，從而實(shí)現(xiàn)紡織材料資源再生對(duì)環(huán)境保護(hù)有重要意義。

鴨毛角蛋白包含不同種類(lèi)氨基酸，其中胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸含量較高。α-helix 和β-sheet 是蛋白質(zhì)中主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)[3]。角蛋白中二硫鍵含量較多的原因是存在胱氨酸，其在蛋白質(zhì)肽鏈中起交聯(lián)作用，因此角蛋白化學(xué)性質(zhì)特別穩(wěn)定，有較高的機(jī)械強(qiáng)度[4]。羊毛角蛋白的提取最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是破壞其化學(xué)鍵，尤其是二硫鍵。目前，提取羊毛角蛋白的方法主要有物理法和化學(xué)法[5]。由于物理法提取物不純，利用價(jià)值不高，故應(yīng)用比較多的是化學(xué)法?；瘜W(xué)法提取羊毛角蛋白主要有氧化法、酸堿法、還原法、離子液體法等，其中還原法是應(yīng)用較多的一種化學(xué)提取方法[6]。然而，在提取過(guò)程中，常用的還原劑存在毒性大、價(jià)格高、溶解率低、提取效果差等問(wèn)題。為了解決這些存在的問(wèn)題，本文選用無(wú)毒、無(wú)害和多樣的化合物L(fēng)-半胱氨酸作為還原劑。L-半胱氨酸結(jié)構(gòu)中的巰基用于破壞鴨毛蛋白大分子之間的二硫鍵，以獲得具有完整和均勻結(jié)構(gòu)的微米級(jí)角蛋白材料。本研究在超聲協(xié)同的條件下，探討了超聲功率、超聲頻率以及攪拌速率對(duì)羽毛溶解的影響[1，7]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鴨毛（臺(tái)前縣飛騰羽絨制品有限公司），尿素（四川西隴科學(xué)有限公司），L-半胱胺酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司]，氫氧化鈉（四川西隴科學(xué)有限公司），乙酸（四川西隴科學(xué)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

YB71 型旦尼爾電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司)，BPG-9240A 精密鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），SHA-C 水浴恒溫振蕩器（鄭州生元儀器有限公司），PHS-25CW pH 計(jì)（上海般特儀器制造有限公司），Phenom prox 掃描電子顯微鏡[復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司]，DM4B 自動(dòng)熒光顯微鏡（德國(guó)徠卡公司），HJ-6 恒速電動(dòng)攪拌器（上海般特儀器制造有限公司），TF-FD18 冷凍干燥機(jī)（上海田楓實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鴨毛清洗除雜

在溶解前，將鴨毛放在洗潔精和去離子水混合液中浸泡并清洗3～5 次，同時(shí)清理鴨毛表面的其他雜質(zhì)，去除灰燼，確保清洗干凈，最后放進(jìn)65℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 角蛋白材料的制備

稱(chēng)取適當(dāng)質(zhì)量干凈的鴨毛，放入濃度為8mol/L 尿素溶液中，浴比為1∶50，再加入0.1wt%半胱氨酸還原劑，用5wt%NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至8.5，在恒溫控制的超聲波磁力攪拌器中反應(yīng)10h，在80℃下提取，獲得角蛋白懸浮液。角蛋白懸浮液經(jīng)過(guò)濾、離心、收集后倒入透析袋中，用去離子水透析3d，透析結(jié)束后用8wt%乙酸溶液將溶液的pH 值調(diào)節(jié)為約4.5，沉淀角蛋白，以8000r/min 離心并收集新鮮角蛋白。新鮮角蛋白經(jīng)沉淀、冷凍干燥后研磨粉碎得到干燥角蛋白，在干燥、避光的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將攪拌速率設(shè)置為0rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，超聲功率設(shè)置為100W、200W、300W、400W、500W，超聲溶解時(shí)間設(shè)置為6h、7h、8h、9h、10h，在此實(shí)驗(yàn)條件下采用單因素控制法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 測(cè)試方法

1.4.1 溶解率測(cè)定

將溶解前的鴨毛質(zhì)量計(jì)作M1，經(jīng)純化干燥后制得純角蛋白粉體質(zhì)量計(jì)為M2，按公式（1）進(jìn)行溶解率計(jì)算。

式中：M1為溶解前質(zhì)量，g；M2為溶解后質(zhì)量，g；η為溶解率。

1.4.2 顯微鏡觀測(cè)

用滴管取適量的角蛋白溶液，放在載玻片上，準(zhǔn)備另一個(gè)臨時(shí)載玻片。用顯微鏡觀察溶解的角蛋白溶液，觀察鴨毛的溶解率并拍照記錄。

1.4.3 掃描電鏡觀察

采用日本日立公司JSM-6510LV 電子顯微鏡（SEM）觀察角蛋白粉形態(tài)結(jié)構(gòu)。將適量角蛋白粉粘在電鏡樣品臺(tái)上，并做噴金處理（電流10mA，處理時(shí)間60s）。工作電壓為3kV、電流為10μA，保存SEM 影像后，對(duì)樣品進(jìn)行形貌觀察分析。

1.4.4 傅里葉紅外光譜（FTIR）測(cè)試

將需要的角蛋白研磨成細(xì)小的粉末狀，取適量粉末與溴化鉀粉末（比例為1∶100）充分混合后通過(guò)壓力設(shè)備制成薄片狀，用FTIR 對(duì)其進(jìn)行紅外測(cè)試，掃描范圍500～4000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)64 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 在超聲輔助下攪拌速率對(duì)鴨毛角蛋白溶解的影響

選擇單因素控制法，在超聲功率為100W，超聲溶解時(shí)間為10h、溫度為80℃的條件下，研究攪拌速率對(duì)鴨毛角蛋白溶解程度的影響。

2.1.1 溶解率測(cè)定

圖1 為角蛋白纖維溶解率在100W 超聲功率輔助下隨攪拌速率變化曲線圖，從圖中可以看出，攪拌對(duì)角蛋白纖維溶解率的影響明顯，且在誤差范圍內(nèi)變動(dòng)。攪拌速度200rpm 時(shí)，溶解率上升了5%；攪拌速度200rpm～300rmp 時(shí)，溶解率逐漸增大，且上升速率較快。當(dāng)攪拌速率達(dá)到400rpm 時(shí)，溶解率達(dá)到66.3%，但此時(shí)攪拌速率過(guò)快，造成杯壁出現(xiàn)細(xì)小裂紋。攪拌速率的增大可以增加溶液與鴨毛接觸，使其充分反應(yīng)，從而溶解率增大。圖2 為不同攪拌速率對(duì)角蛋白纖維溶解情況光學(xué)顯微鏡觀測(cè)實(shí)拍圖，由圖可知溶解過(guò)程未攪拌時(shí)，角蛋白纖維被溶解成較長(zhǎng)的纖維，均勻性較好；而在溶解過(guò)程中進(jìn)行持續(xù)攪拌，速率達(dá)到200rpm 時(shí)，角蛋白纖維被溶解成長(zhǎng)短不一致的短纖維，均勻性相對(duì)較差，且尺寸不一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攪拌速率的大小對(duì)生成的短纖維或微粒均勻性影響明顯，持續(xù)進(jìn)行攪拌即可得到均一性較好的產(chǎn)物。

圖1 角蛋白纖維溶解率隨攪拌速率變化曲線圖

圖2 不同溶解攪拌速率對(duì)角蛋白纖維溶解情況光學(xué)顯微鏡觀測(cè)圖

2.1.2 形貌觀察

圖3 為不同浴比所得角蛋白材料的SEM 圖。當(dāng)攪拌速率為0rpm 時(shí)，可以看出在一定超聲協(xié)同下L-半胱氨酸/尿素溶解體系能夠溶解鴨毛角蛋白材料，但是其均勻性不佳，仍存在大尺徑角蛋白材料。當(dāng)攪拌速率為200rpm 時(shí)，相比于0rpm 的均勻性并無(wú)提升，尺徑變化較小。當(dāng)攪拌速率為250rpm、300rpm 時(shí)，角蛋白材料均勻性相對(duì)變化較大，能看到大量的角蛋白原纖從表面脫落，尺徑進(jìn)一步減小。當(dāng)攪拌速率為350rpm 時(shí)，可以看出此時(shí)的角蛋白材料均勻性相對(duì)最佳。因?yàn)閿嚢杷俾实脑龃髸?huì)導(dǎo)致材料結(jié)構(gòu)分散，所以在尺寸方面的影響較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攪拌速率對(duì)于角蛋白材料的均勻性、溶解程度均有一定的影響，但是過(guò)大的攪拌速率會(huì)導(dǎo)致燒杯出現(xiàn)少量裂紋，故選擇攪拌速率為250rpm 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同攪拌速率所得角蛋白材料的SEM 圖

2.1.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

使用紅外光譜測(cè)試研究再生角蛋白粉末的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖4。5 種樣品的曲線都具有相似的特征峰，表明在不同攪拌速率下獲得的角蛋白是一致的。

圖4 不同攪拌速率所得角蛋白材料的傅里葉紅外光譜圖

經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)5 種樣品特征峰相似，都顯示出相似的特征透射帶，也證明了攪拌速率對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有造成影響，原因主要是其中含有肽鍵（-CONH-），這些肽鍵分為酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ。酰胺Ⅲ條帶提供了關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)造以及骨架結(jié)構(gòu)的重要信息。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和圖形分析，所有的樣品都含有αhelix 和β-sheet 這2 種微觀結(jié)構(gòu)。而隨著攪拌速率的增加，α-helix 和β-sheet 這2 種微觀結(jié)構(gòu)的含量也隨之增大。

2.2 超聲功率對(duì)鴨毛角蛋白溶解的影響

選擇單因素控制法，在攪拌速率為250rpm，溶解時(shí)間為10h、溫度為80℃的條件下，研究超聲功率對(duì)鴨毛角蛋白溶解程度的影響。

2.2.1 溶解率測(cè)定

角蛋白纖維溶解率隨超聲功率變化曲線圖見(jiàn)圖5。從圖中可以看出角蛋白纖維的溶解率受超聲功率影響較大。當(dāng)超聲功率從100W 增大至500W 時(shí)，溶解率從63.1%增大至70.1%，提高了7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶解率隨著超聲功率的增大而增加，這說(shuō)明超聲功率越大越有利于促進(jìn)L-半胱氨酸/尿素溶解體系對(duì)角蛋白纖維的溶解。在放大200 倍條件下不同超聲功率對(duì)角蛋白纖維溶解情況光學(xué)顯微鏡觀測(cè)實(shí)拍圖見(jiàn)圖6。從圖中可以看到，當(dāng)超聲功率為100W 時(shí)，角蛋白纖維被溶解成長(zhǎng)短不一致的短纖維，均勻性相對(duì)較差，且尺寸不一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，角蛋白纖維的平均長(zhǎng)度隨超聲功率的增加而減小，且均勻性也隨超聲功率的增加而變得更好。這說(shuō)明增加超聲功率，可以促使L-半胱氨酸/尿素溶解體溶液更快溶解角蛋白纖維，可生成尺寸更小、均勻性更好的絲素蛋白材料。

圖5 角蛋白纖維溶解率隨超聲功率變化曲線圖

圖6 不同超聲功率對(duì)角蛋白纖維溶解情況光學(xué)顯微鏡觀測(cè)圖

2.2.2 形貌觀察

不同超聲功率所得角蛋白材料的SEM 圖見(jiàn)圖7。當(dāng)超聲功率為100W 時(shí)，角蛋白纖維的溶解性較差，所得產(chǎn)物基本為尺徑較長(zhǎng)的短纖維。當(dāng)超聲功率為200W 時(shí)，材料仍具有較為完整的纖維狀態(tài)，但纖維表面已經(jīng)呈現(xiàn)潰散性。當(dāng)超聲功率為300W 時(shí)，所得材料結(jié)構(gòu)相對(duì)變化明顯，纖維結(jié)構(gòu)受到破壞程度加劇，溶解成為分散性纖維結(jié)構(gòu)。當(dāng)超聲功率為400W 時(shí)，角蛋白材料呈現(xiàn)出較為均勻的分散結(jié)構(gòu)，破壞加劇，尺徑明顯減小且均勻性達(dá)到較好狀態(tài)。當(dāng)超聲功率為500W 時(shí)，角蛋白材料尺徑繼續(xù)減小，形貌為不規(guī)則分散結(jié)構(gòu)，已處于要被進(jìn)一步分散的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著超聲功率的增大，所得的角蛋白材料結(jié)構(gòu)破壞加劇，尺徑更小，均勻性更佳。

圖7 不同超聲功率所得角蛋白材料的SEM 圖

2.2.3 分子結(jié)構(gòu)分析

不同超聲功率所得角蛋白材料的傅里葉紅外光譜圖見(jiàn)圖8。5 種樣品都顯示出相似的特征透射帶。

圖8 不同超聲功率所得角蛋白材料的傅里葉紅外光譜圖

結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和圖形分析，隨著超聲功率改變，L-半胱氨酸/尿素溶解體系角蛋白材料的特征峰增強(qiáng)，說(shuō)明超聲L-半胱氨酸/尿素溶解體系溶解能夠促進(jìn)角蛋白結(jié)構(gòu)的無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)向α-helix 結(jié)構(gòu)和β-sheet 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。當(dāng)超聲功率為400W 時(shí)α-helix 和β-sheet 結(jié)構(gòu)的特征峰最為明顯，而當(dāng)超聲功率為500W 時(shí)其特征峰明顯減弱，說(shuō)明該功率下角蛋白的α-helix 結(jié)構(gòu)遭到破壞，其與形貌觀察結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲輔助對(duì)于L-半胱氨酸/尿素溶解體系溶解角蛋白纖維的結(jié)構(gòu)有促進(jìn)作用，但是功率過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。當(dāng)超聲功率為400W 時(shí)，L-半胱氨酸/尿素溶解體系對(duì)于溶解角蛋白纖維結(jié)構(gòu)的促進(jìn)最大，故本實(shí)驗(yàn)采用超聲功率為400W。

2.3 在超聲輔助下時(shí)間對(duì)鴨毛角蛋白溶解的影響

選擇單因素控制法，在攪拌速率為250rpm，超聲功率為400W、溫度為80℃的條件下，研究超聲溶解時(shí)間對(duì)于鴨毛角蛋白溶解程度的影響。

2.3.1 溶解率測(cè)定

在400W 超聲功率輔助下，角蛋白纖維溶解率隨超聲溶解時(shí)間變化曲線圖見(jiàn)圖9。從圖9 可以看出，溶解率隨超聲溶解時(shí)間的增加而增加，但溶解率的增加速率隨著時(shí)間的增加而減小。當(dāng)超聲溶解時(shí)間從6h延長(zhǎng)至10h 后，溶解率由69.2%提高到73.8%，提高了4.6%。圖10 為超聲協(xié)同下不同超聲溶解時(shí)間對(duì)角蛋白纖維溶解情況光學(xué)顯微鏡觀測(cè)實(shí)拍圖。從圖中可以看到，在超聲溶解時(shí)長(zhǎng)為10h 以內(nèi)時(shí)，制得的角蛋白短纖長(zhǎng)度和粒徑隨超聲溶解時(shí)間的增加而減小，且均勻性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在超聲輔助下，雖然溶解率隨時(shí)間的增加而增大，但溶解率變化較小，可為制得均勻角蛋白膜溶液提供良好基礎(chǔ)。

圖9 角蛋白纖維溶解率隨超聲溶解時(shí)間變化曲線圖

圖10 不同超聲溶解時(shí)間角蛋白纖維溶解情況光學(xué)顯微鏡觀測(cè)圖

2.3.2 形貌觀察

不同超聲溶解時(shí)間所得角蛋白材料的SEM 圖見(jiàn)圖11。當(dāng)超聲溶解時(shí)間為6h 時(shí)，角蛋白材料纖維未能達(dá)到較好的溶解狀態(tài)，纖維尺徑較長(zhǎng)，均勻性較差。當(dāng)超聲溶解時(shí)間為7h 時(shí)，角蛋白材料具有一定的原纖結(jié)構(gòu)，溶解程度加劇，尺徑減小。當(dāng)超聲溶解時(shí)間為8h時(shí)，角蛋白材料纖維已經(jīng)溶解松散且均勻。當(dāng)超聲溶解時(shí)間為9h 時(shí)，角蛋白材料纖維表面呈現(xiàn)潰散現(xiàn)象并具有良好的纖維形態(tài)。當(dāng)超聲溶解時(shí)間為10h 時(shí)，角蛋白材料纖維表面呈現(xiàn)嚴(yán)重脫落和潰散現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲溶解時(shí)間為8～10h 時(shí)，隨著超聲溶解時(shí)間的增加，所得的角蛋白材料尺寸不斷變小，會(huì)對(duì)纖維的表面造成一定的破壞。

圖11 不同超聲溶解時(shí)間所得角蛋白材料的SEM 圖

2.3.3 分子結(jié)構(gòu)分析

不同超聲溶解時(shí)間所得角蛋白材料的傅里葉紅外光譜圖見(jiàn)圖12。5 種樣品都顯示出相似的特征透射帶。

圖12 不同超聲溶解時(shí)間所得角蛋白材料的傅里葉紅外光譜圖

根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析，3293cm-1（酰胺A）的峰表示α-helix 結(jié)構(gòu)，1539cm-1～1515cm-1（酰胺Ⅱ）范圍與βsheet 結(jié)構(gòu)相關(guān)，1666cm-1和1655cm-1（酰胺Ⅰ）的分裂峰是α-helix 結(jié)構(gòu)和β-sheet 結(jié)構(gòu)的結(jié)合。由圖12 可以看出，隨著超聲溶解時(shí)間的延長(zhǎng)，3293cm-1（酰胺A）和1539cm-1～1515cm-1（酰胺Ⅱ）的特征峰增強(qiáng)，說(shuō)明在一定反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，角蛋白結(jié)構(gòu)中無(wú)卷曲結(jié)構(gòu)向αhelix、β-sheet 結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化。當(dāng)超聲溶解時(shí)間超過(guò)8h時(shí)，其特征吸收峰相似，α-helix 結(jié)構(gòu)、β-sheet 結(jié)構(gòu)含量最高。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究基于L-半胱氨酸/尿素溶解體系制備角蛋白材料，用超聲協(xié)同的方法，探究了不同攪拌速率、不同超聲功率、不同超聲溶解時(shí)間對(duì)于角蛋白纖維溶解的影響，確定超聲優(yōu)化后最佳的溶解工藝參數(shù)，具體結(jié)論如下：超聲協(xié)同L-半胱氨酸/尿素法制備角蛋白材料的最佳工藝參數(shù)是轉(zhuǎn)速為250rmp、超聲功率為400W、超聲溶解時(shí)間為8h。此時(shí)，相較于未加超聲實(shí)驗(yàn)，溶解率達(dá)到72.6%，相對(duì)提高了26.7%，溶解時(shí)間縮短2h，且所得材料的尺寸以及表面形貌相對(duì)最佳，角蛋白纖維具有較為完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)化學(xué)結(jié)構(gòu)完整性表現(xiàn)良好，可為后續(xù)制備膜材料提供原材料。此外，本研究將利用大量廢棄羽毛制得角蛋白材料，對(duì)實(shí)現(xiàn)紡織材料資源再生，促進(jìn)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。