劉冠麟,姜淋潔,王 建,楊孝君,馬吉飛

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300380;2.天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司,天津 300080)

二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑是一種用于治療預(yù)防動(dòng)物體外寄生蟲病的復(fù)方藥物,直接涂抹在動(dòng)物脊柱皮膚上,有效抵抗犬體表蚤、蜱、虱的寄生,抑制白蛉、廄蠅和蚊子的叮咬,輔助治療過敏性皮炎[1],其中有效殺蟲成分是二氯苯醚菊酯和吡蟲啉,藥物通過昆蟲吸食給藥動(dòng)物血液進(jìn)入蟲體,干擾神經(jīng)離子通道,從而達(dá)到殺蟲作用,持續(xù)驅(qū)蟲效果長(zhǎng)達(dá)28 d[2-7]。

目前德國(guó)拜爾公司已上市的驅(qū)蟲類產(chǎn)品除了拜寵爽(滴劑),還有愛沃克(滴劑)、旺滴靜(滴劑)、索來多(項(xiàng)圈),主要成分為吡蟲啉和其他殺蟲藥。近年來,國(guó)內(nèi)已有此類殺蟲滴劑仿制藥的項(xiàng)目開發(fā),經(jīng)查閱文獻(xiàn),僅有檢測(cè)農(nóng)藥中二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的方法[8-15],但作為獸用驅(qū)蟲藥的含量測(cè)定方法目前鮮見相關(guān)研究報(bào)道,因此該研究建立一種高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)檢測(cè)二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑中二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的含量方法,為二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑二氯苯醚菊酯對(duì)照品(G1050294,99.73%,Dr.Ehrenstorfer);吡蟲啉對(duì)照品(G988243,98.55%,Dr.Ehrenstorfer);二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑(批號(hào)202204003、202204004、202204005,天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司);甲酸銨(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙腈(色譜純,天津市川普偉業(yè)科技有限公司);甲酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);超純水。

1.2 儀器安捷倫1260Ⅱ高效液相色譜儀,包括G7111A四元泵、G7129A自動(dòng)進(jìn)樣器、AT-330柱溫箱、G7115A DAD檢測(cè)器、C.01.07 SR2(255)色譜工作站,美國(guó)安捷倫科技有限公司;ES225SM-DR電子天平,普利賽斯儀器有限公司;超聲波清洗器,昆山儀器有限公司;真空泵,ASL儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(X-Terra C18,100 mm×4.6 mm,3.5 μm,批號(hào)02403032213653);以0.05 mol/L甲酸銨溶液(用甲酸調(diào)pH至4.5)作為流動(dòng)相A,乙腈作為流動(dòng)相B;按表1進(jìn)行梯度洗脫;柱溫為35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm;進(jìn)樣量為5 μL。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度Table 1 Mobile phase gradient elution

1.3.2溶液的制備。

1.3.2.1對(duì)照儲(chǔ)備液。電子天平精密稱定吡蟲啉對(duì)照品100 mg,用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(10∶90)混合溶液定容至25 mL,搖勻,配制成濃度為4.0 mg/mL吡蟲啉溶液,作為吡蟲啉對(duì)照儲(chǔ)備液;電子天平精密稱定二氯苯醚菊酯對(duì)照品500 mg,用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(10∶90)混合溶液定容至50 mL,搖勻,配制成10 mg/mL二氯苯醚菊酯溶液,作為二氯苯醚菊酯對(duì)照儲(chǔ)備液。

1.3.2.2對(duì)照品溶液。精密移取“1.3.2.1”吡蟲啉對(duì)照儲(chǔ)備液1 mL,用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(10∶90)混合溶液定容至10 mL,搖勻,配制成濃度為0.4 mg/mL吡蟲啉溶液,作為吡蟲啉對(duì)照溶液備用;精密移取“1.3.2.1”二氯苯醚菊酯對(duì)照儲(chǔ)備液2 mL,用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(10∶90)混合溶液定容至10 mL,搖勻,配制成2.0 mg/mL二氯苯醚菊酯溶液,作為二氯苯醚菊酯對(duì)照溶液備用。

1.3.2.3供試品溶液。由于藥品溶液黏稠存在掛壁現(xiàn)象,不適宜使用移液槍,故采用質(zhì)量稱定移取。精密稱定二氯苯醚菊酯和吡蟲啉滴劑120 mg,用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(10∶90)混合溶液定至25 mL,搖勻,作為供試品溶液備用。

1.3.2.4空白對(duì)照溶液。精密稱定不含二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的空白制劑120 mg,用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(10∶90)混合溶液定容至25 mL,作為空白對(duì)照溶液備用。

1.3.3專屬性試驗(yàn)。按照“1.3.2”方法分別配制吡蟲啉對(duì)照品溶液、二氯苯醚菊酯對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照溶液,按照“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣高效液相色譜儀,記錄色譜圖。

1.3.4精密度試驗(yàn)。按照“1.3.2”方法分別配制2種對(duì)照品溶液、6份供試品平行溶液,按照“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜峰面積。

1.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.3.2”方法配制2種對(duì)照品溶液、6份相同濃度滴劑供試品平行溶液,分別放置0、1、4、8、16、24 h后,按照“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜峰面積。

1.3.6線性關(guān)系確定。

1.3.6.1二氯苯醚菊酯線性關(guān)系。精密移取“1.3.2.1”二氯苯醚菊酯對(duì)照儲(chǔ)備液4.0、5.0、6.0、7.5、9.0 mL用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(10∶90)混合溶液定容至20 mL,按照“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜峰面積,并以峰面積為y軸、進(jìn)樣濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.2吡蟲啉線性關(guān)系。精密移取“1.3.2.1”吡蟲啉對(duì)照儲(chǔ)備液3、4、5、6、7 mL用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(10∶90)混合溶液定容至50 mL,按照“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜峰面積,并以峰面積為y軸、進(jìn)樣濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7加樣回收率試驗(yàn)。分別移取適量“1.3.2.1”項(xiàng)對(duì)照儲(chǔ)備液置25 mL容量瓶中,稀釋定容為80%加樣回收溶液(4 mL二氯苯醚菊酯+2 mL吡蟲啉)、100%加樣回收溶液(5 mL二氯苯醚菊酯+2.5 mL吡蟲啉)、120%加樣回收溶液(6 mL二氯苯醚菊酯+3 mL吡蟲啉),備用,按照“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜峰面積,計(jì)算加樣回收率。

1.3.8定量限和檢測(cè)限。移取“1.3.2.2”項(xiàng)中2種主藥對(duì)照品溶液,逐步稀釋,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄二氯苯醚菊酯和吡蟲啉信噪比平均數(shù),以信噪比S/N為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限(LOD);以信噪比S/N為10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。

1.3.9耐用性試驗(yàn)。移取“1.3.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液和供試品溶液各1份,供試品選用批號(hào)202204003樣品,在“1.3.1”色譜條件下,通過改變流速(±5%)、柱溫(±5 ℃)、流動(dòng)相A 酸度(pH±0.2),換用不同批號(hào)的色譜柱(批號(hào)02403032213653、02413128113605),記錄各個(gè)條件下主峰的分離情況。

1.3.10樣品含量測(cè)定。移取“1.3.2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液,另選取3批不同批號(hào)(202204003、202204004、202204005)二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑樣品,溶解稀釋,按照“1.3.1”色譜條件進(jìn)樣2次,記錄色譜峰面積,并采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中2種藥效成分含量結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗(yàn)從吡蟲啉對(duì)照品、二氯苯醚菊酯對(duì)照品、供試品、空白對(duì)照色譜圖(圖1)可以看出,吡蟲啉出峰時(shí)間在2.5～3.0 min,二氯苯醚菊酯順反異構(gòu)體出峰時(shí)間在14～16 min,供試品與對(duì)照品出峰時(shí)間一致,且空白對(duì)照無主峰出現(xiàn)對(duì)含量測(cè)定無干擾,說明該色譜條件下專屬性良好。

2.2 精密度試驗(yàn)精密度試驗(yàn)結(jié)果表明,二氯苯醚菊酯平均峰面積為10 763.4,RSD為0.17%,吡蟲啉平均峰面積為5 936.7,RSD為0.52%,峰面積RSD均小于2%,表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明(表2),二氯苯醚菊酯平均峰面積為13 310.8,RSD為0.89%;吡蟲啉平均峰面積為7 342.6,RSD為0.85%,2種主藥成分峰面積RSD均小于1.00%,表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.4 線性關(guān)系從圖2可以看出,二氯苯醚菊酯線性方程為y=6 030x-79.36(R2=0.999 8),表明二氯苯醚菊酯對(duì)照品溶液濃度在1.209 8～2.822 8 mg/mL時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好;吡蟲啉線性方程為y=15 746x+24.61(R2=1.000 0),表明吡蟲啉對(duì)照品溶液濃度在0.237 5～0.554 2 mg/mL時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 加樣回收率從表3可以看出,二氯苯醚菊酯平均回收率為99.84%,吡蟲啉平均回收率為100.33%,2種主藥成分回收率RSD均小于1.00%,表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.6 定量限和檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)S/N=10時(shí),二氯苯醚菊酯濃度為2.447 μg/mL,吡蟲啉濃度為0.082 μg/mL;當(dāng)S/N=3時(shí),二氯苯醚菊酯濃度為0.733 μg/mL,吡蟲啉濃度為0.029 μg/mL。

2.7 耐用性試驗(yàn)按“1.3.9”方法操作,結(jié)果如表4所示,在各個(gè)條件下,主峰與各雜質(zhì)峰均能分離,且二氯苯醚菊酯、吡蟲啉含量的RSD均小于2.00%,試驗(yàn)結(jié)果說明流動(dòng)相酸度、柱溫、流速及不同批次色譜柱對(duì)含量檢測(cè)無明顯影響,表明該方法耐用性良好。

注:a、b、c、d分別為吡蟲啉對(duì)照品、二氯苯醚菊酯對(duì)照品、供試品、空白對(duì)照。Note:a,b,c and d refer to imidacloprid reference substance,permethrin reference substance,test substance,and blank control,respectively.圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of specific test

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 二氯苯醚菊酯(a)、吡蟲啉(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of permethrin (a) and imidacloprid (b)

2.8 樣品含量測(cè)定經(jīng)測(cè)定(表5),3批不同批號(hào)二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑樣品中二氯苯醚菊酯和吡蟲啉這2種藥效成分含量分別為98.88%～100.80%、99.59%～100.89%,平均值分別為99.83%、100.12%,表明檢測(cè)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(95.0%～105.0%)。

3 討論

經(jīng)查閱文獻(xiàn),目前關(guān)于二氯苯醚菊酯和吡蟲啉這2種藥品的檢測(cè)僅局限于農(nóng)藥[16-22],未見獸藥制劑的含量檢測(cè),該研究對(duì)比多位國(guó)內(nèi)外學(xué)者建立的二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的測(cè)定方法,結(jié)合二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑的藥物性狀對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化,以求同時(shí)檢測(cè)2種藥品含量,建立了一種獸藥制劑的HPLC檢測(cè)方法。

以往的文獻(xiàn)資料中[16-22],HPLC法檢測(cè)二氯苯醚菊酯和吡蟲啉含量色譜條件選用的流動(dòng)相大多是高比例乙腈-水、甲醇-水,預(yù)試驗(yàn)中使用高比例甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相峰形并不理想,所以該研究選用0.05 mol/L甲酸銨-乙腈溶液作為流動(dòng)相,甲酸銨作為離子緩沖劑,有利于改善峰形,提高積分準(zhǔn)確度,調(diào)節(jié)pH至4.5可以使出峰時(shí)間提前。另外,設(shè)置梯度洗脫可以有效防止二氯苯醚菊酯對(duì)吡蟲啉出峰的干擾,以便更好地收集數(shù)據(jù)。在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇時(shí),Waleng等[23]檢測(cè)吡蟲啉時(shí)波長(zhǎng)為268 nm,吳國(guó)旭等[24]研究發(fā)現(xiàn)2種主藥的紫外最大吸收波長(zhǎng)分別為吡蟲啉270 nm、菊酯類225 nm,在預(yù)試驗(yàn)中檢測(cè)到吡蟲啉紫外最大吸收波長(zhǎng)為270 nm,二氯苯醚菊酯最大吸收波長(zhǎng)為210 nm,為了避免檢測(cè)波長(zhǎng)趨近于紫外最大吸收波長(zhǎng),兼顧2種成分最終確定235 nm為檢測(cè)器適宜波長(zhǎng),已達(dá)到同時(shí)檢測(cè)的目的。

表3 回收率考察結(jié)果Table 3 Recovery rate inspection results

表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Durability test results 單位:%

表5 樣品含量測(cè)定Table 5 Sample content determination 單位:%

由于二氯苯醚菊酯和吡蟲啉這2種主藥都易溶于極性有機(jī)溶劑,國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用乙腈或甲醇稀釋[16-26],為了提高分離度,減少傳質(zhì)阻抗,提高分離塔板數(shù),該研究采用流動(dòng)相和乙腈混合溶液作為稀釋劑,可以使峰形尖銳對(duì)稱,出峰時(shí)間穩(wěn)定。

4 結(jié)論

該研究建立了同時(shí)檢測(cè)二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑中2種藥效成分的分析方法,分別對(duì)其專屬性、精密度、穩(wěn)定性、線性關(guān)系、加樣回收率、方法耐用性和含量測(cè)定進(jìn)行了方法學(xué)試驗(yàn),結(jié)果良好,2種主藥含量平均值分別為99.83%和100.12%,符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。綜上,該方法適用于二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑藥效成分的含量檢測(cè),為新型獸藥驅(qū)蟲劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。