譚 勇, 林春惠, 潘發(fā)光, 陳國(guó)華, 胡群英, 易綺斐

(1.中國(guó)科學(xué)院華南植物園,廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510650;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 廣州 510225)

紫紋兜蘭(PaphiopedilumpurpuratumLindl. Stein)隸屬于蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬(Paphiopedilum),主要分布于廣東、廣西、香港以及云南等省區(qū),是國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[1]。兜蘭有分株繁殖和種子繁殖兩種方式,分株繁殖的周期長(zhǎng),繁殖系數(shù)低;而種子繁殖對(duì)環(huán)境的依賴性強(qiáng),需要共生真菌入侵才萌發(fā),且自然狀態(tài)下萌發(fā)率極低[2],兜蘭繁殖特點(diǎn)導(dǎo)致野外種群狹窄,個(gè)體數(shù)量有限。由于兜蘭生存環(huán)境的惡化及其野生資源的過(guò)度采挖,兜蘭已成為最瀕危的植物物種之一[3-4]。

通過(guò)無(wú)菌萌發(fā)可以獲得兜蘭屬的試管苗,無(wú)菌萌發(fā)成了繁殖兜蘭最有效的方法[5-6],但原生種兜蘭的無(wú)性克隆極其困難,主要表現(xiàn)在外植體消毒困難且易受污染、生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)、褐變嚴(yán)重,物種間存在較大差異,同一培養(yǎng)條件對(duì)兜蘭屬內(nèi)各種沒(méi)有適用性[7]。大部分兜蘭屬的無(wú)菌繁殖技術(shù)還不成熟[8],兜蘭屬的許多原生種還未找到有效的無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)基環(huán)境,不利于兜蘭屬的資源保育和產(chǎn)業(yè)發(fā)展,其中包括紫紋兜蘭。本研究以紫紋兜蘭的種子作為外植體,探索適合種子萌發(fā)和誘導(dǎo)原球莖成苗的培養(yǎng)基配方,建立紫紋兜蘭的快速繁殖方式,為紫紋兜蘭的保育研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采集廣東省河源市紫金白溪省級(jí)自然保護(hù)區(qū)中野外自然狀態(tài)授粉210 d結(jié)實(shí)的紫紋兜蘭蒴果作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1果莢消毒處理及電鏡掃描

采集授粉210 d的綠色果莢,用自來(lái)水清洗果莢表面,在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精棉球擦拭5～10 min,再用0.13%的氯化汞浸泡15 min,取出用無(wú)菌水沖洗3次,最后用無(wú)菌濾紙擦干果莢,即完成消毒。隨后用手術(shù)刀切開(kāi)果莢取出種子,用于培養(yǎng)基接種和體視鏡下觀察種子形態(tài)。

將種子放于離心管中,加入2 mL的無(wú)水乙醇,放入超聲波清洗機(jī)5 min,隨后室溫干燥,將干燥后的種子貼在雙面碳膠帶樣品臺(tái)上,用LEICA EM ACE600離子濺射儀鍍鉑金(厚度10 nm),電流20 mA,在JSM-6360LV高低真空掃描電子顯微鏡下觀察種子形態(tài)特征。

1.2.2紫紋兜蘭種子萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選

以MS、1/2 MS、1/4 MS、花寶一號(hào)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加100 mL/L椰汁、20 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂粉,pH值調(diào)至6.0,配置4組無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)基,分別編號(hào)為A、B、C、D,用于探討紫紋兜蘭種子萌發(fā)的最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

以1/4 MS+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉為基礎(chǔ)培〗養(yǎng)基,分別添加100 mg/L香蕉泥、100 mg/L土豆泥、100 mg/L蘋(píng)果泥,pH值調(diào)至6.0,配置3組無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)基,分別編號(hào)為E、F、G,與C培養(yǎng)基組成對(duì)照組,用于探討不同有機(jī)添加物對(duì)紫紋兜蘭種子無(wú)菌萌發(fā)的影響。

以1/4 MS+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加0.3 ml/L 6-芐氨基嘌呤、0.1 mL/L 1-萘乙酸,再分別添加100 mL/L椰汁、100 mg/L香蕉泥,pH=6.0,配置2組無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)基,分別編號(hào)為H、I,與C、E培養(yǎng)基組成對(duì)照組,用于探討不同有機(jī)添加物和植物調(diào)節(jié)劑對(duì)原球莖生長(zhǎng)的影響。

每組培養(yǎng)基配制1 L,分裝成28瓶后進(jìn)行滅菌,冷卻后備用,將消毒后的種子播種于培養(yǎng)基中,置于光照強(qiáng)度1 600 lx,溫度25 ℃的條件下,保證9.5 h/d的光照時(shí)間,90 d后觀察并統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù),計(jì)算萌發(fā)率,記錄原球莖的生長(zhǎng)情況。

圖1 紫紋兜蘭果莢

1.2.3紫紋兜蘭生根壯苗培養(yǎng)

為避免生長(zhǎng)環(huán)境改變引起的褐化,當(dāng)紫紋兜蘭小苗分化生長(zhǎng)出2～3片葉子、葉長(zhǎng)1～1.5 cm時(shí),將其以根部朝下放置的方式轉(zhuǎn)移到配方與H、I完全一致的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度25 ℃,光照時(shí)間9.5 h/d。觀察并記錄生根壯苗的情況,如根系、葉片長(zhǎng)度以及整株長(zhǎng)勢(shì)。根據(jù)組培苗生長(zhǎng)的實(shí)際情況出瓶栽培。

1.2.4紫紋兜蘭試管苗煉苗移栽

將30株試管苗移至培養(yǎng)室外放置7 d,而后打開(kāi)培養(yǎng)瓶的蓋子,繼續(xù)放置7 d,完成煉苗。移栽時(shí)用清水洗去小苗根部的培養(yǎng)基,經(jīng)0.1%的多菌靈溶液浸泡幼苗5 min后用清水沖洗干凈,晾干后移入腐殖土和松樹(shù)皮配比1∶1(體積比)的栽培基質(zhì)中。

注:a為體視鏡下的種子形態(tài);b為電鏡掃描下的有胚種子;c為電鏡掃描下的無(wú)胚種子。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)種子培養(yǎng)至出現(xiàn)白色或淡綠色原球莖的種子數(shù),計(jì)算90 d的萌發(fā)率;觀察記錄種子分化成帶有2～3片葉片的原球莖,在上述條件下培養(yǎng)90～100 d后的成苗情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子表面形態(tài)特征觀察

紫紋兜蘭種子細(xì)長(zhǎng),種皮細(xì)胞接近長(zhǎng)方形,長(zhǎng)135 μm,寬40 μm左右,木質(zhì)素類(lèi)物質(zhì)的表皮細(xì)胞排列整齊,種子無(wú)胚乳,且僅有少部分種子胚發(fā)育完整,具有萌發(fā)潛力。電鏡下觀察到種皮表面皺縮,與體視鏡下觀察有一定出入,可能是浸種吸水導(dǎo)致種子膨大。在電鏡掃描下能發(fā)現(xiàn)兩種形態(tài)的種子,兩端封閉和一端有孔口兩種類(lèi)型。

2.2 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)紫紋兜蘭種子萌發(fā)的影響

由表1可見(jiàn),不同類(lèi)型的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)的影響差異較大,MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率最低,為6.85%,其次是1/2 MS,萌發(fā)率為14.50%,1/4 MS的萌發(fā)率最高,為56.60%,表明紫紋兜蘭種子在無(wú)機(jī)鹽濃度較低的情況下更容易萌發(fā)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為花寶一號(hào)的萌發(fā)率為22.22%,萌發(fā)時(shí)間比MS系列培養(yǎng)基長(zhǎng),少量原球莖出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

表1 不同培養(yǎng)基下種子的萌發(fā)率

2.3 有機(jī)物對(duì)紫紋兜蘭種子萌發(fā)的影響

紫紋兜蘭種子在添加土豆泥(F培養(yǎng)基)和蘋(píng)果泥(G培養(yǎng)基)的培養(yǎng)基上基本不萌發(fā),添加香蕉汁的E培養(yǎng)基萌發(fā)率為37.14%。添加了椰汁(C培養(yǎng)基)和香蕉汁(E培養(yǎng)基)的萌發(fā)情況如圖3所示,兩種有機(jī)添加物明顯促進(jìn)了種子的萌發(fā),添加椰汁的種子萌發(fā)時(shí)間比添加香蕉泥的萌發(fā)時(shí)間提前15 d左右,并且在添加椰汁的情況下,原球莖生長(zhǎng)得更大。

圖3 不同有機(jī)物對(duì)種子萌發(fā)的影響

2.4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)紫紋兜蘭種子萌發(fā)的影響

H、I培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為78.13%和58.55%(表1),比未添加植物激素的E、C對(duì)照組培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別提高了21.51%和21.41%,添加植物激素后,原球莖的生長(zhǎng)速度、轉(zhuǎn)綠速度及直徑大小明顯提升。種子及原球莖的生長(zhǎng)情況如圖4所示,在激素條件相同的情況下,椰汁和香蕉泥對(duì)原球莖的影響存在明顯的差異,H培養(yǎng)基顯著提高了原球莖的生長(zhǎng)速度及大小,前期分化慢,分化后生長(zhǎng)速度快。I培養(yǎng)基的原球莖為H培養(yǎng)基的1/4大小時(shí)即出現(xiàn)葉芽分化,且發(fā)生了明顯的增殖,但生長(zhǎng)緩慢。

2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)紫紋兜蘭生根壯苗培養(yǎng)和移栽的影響

當(dāng)紫紋兜蘭原球莖分化出少量根和葉時(shí),轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),幼苗生長(zhǎng)狀況如圖5所示。培養(yǎng)初期,H培養(yǎng)基中幼苗只生長(zhǎng)不增殖,幼苗根系粗壯,生長(zhǎng)速度明顯高于I培養(yǎng)基,而I培養(yǎng)基中依然有葉芽分化。培養(yǎng)后期,H培養(yǎng)基中幼苗葉片大而肥厚,根系發(fā)達(dá),可進(jìn)行移栽,移栽時(shí)抓土性強(qiáng),葉片肥厚,植株適應(yīng)性強(qiáng),成活率100%;此時(shí)I培養(yǎng)基中幼苗的數(shù)量為H培養(yǎng)基中的3～4倍,長(zhǎng)勢(shì)明顯落后,葉片瘦小,根系細(xì)短,

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)生根壯苗的影響

3 結(jié)論與討論

種子作為組織培養(yǎng)的外植體,其生物學(xué)特性直接影響萌發(fā)率。有研究表明,成熟的兜蘭種子在培養(yǎng)基中難萌發(fā),可能是形成了不可滲透的木質(zhì)素種皮,阻礙了水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[9];幼嫩的種子萌發(fā)率也低,因?yàn)榇藭r(shí)種胚還未發(fā)育完全,需要先合成營(yíng)養(yǎng)物和形成器官[10];發(fā)育到一定階段的未成熟種子萌發(fā)率較高[11]。不同種類(lèi)的兜蘭種子最適宜萌發(fā)期也有所不同,古德兜蘭、菲律賓兜蘭的最佳萌發(fā)期是授粉90 d后[12];授粉后180 d的彩云兜蘭萌發(fā)最佳[13]。本實(shí)驗(yàn)中所用的果莢較綠,部分種子的胚尚未完全發(fā)育,是影響萌發(fā)率的原因之一;種皮皺縮,木質(zhì)素類(lèi)物質(zhì)積累導(dǎo)致種皮透水性下降,與本實(shí)驗(yàn)電鏡觀察下的種胚多數(shù)發(fā)育不良,也是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)萌發(fā)率降低的原因[14];部分種子的一端有孔口,可能在種子萌發(fā)過(guò)程中起吸收作用或者在自然條件下,種子共生萌發(fā)時(shí)菌絲從該孔口進(jìn)入種子接觸種胚[15]。

兜蘭作為蘭科植物中無(wú)菌萌發(fā)機(jī)制最復(fù)雜的種類(lèi),在非共生萌發(fā)的過(guò)程中,產(chǎn)生影響的外在因素包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式及培養(yǎng)環(huán)境等[4]。培養(yǎng)基成分的確定也是眾多因素中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的,因此需要從多個(gè)方面來(lái)探討不同培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)的影響。MS系列培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果表明,紫紋兜蘭對(duì)無(wú)機(jī)鹽濃度敏感,無(wú)機(jī)鹽濃度越低越有利于紫紋兜蘭種子萌發(fā),1/4 MS為最適合紫紋兜蘭種子萌發(fā)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,與海南蝴蝶蘭[16]的基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致,大多數(shù)兜蘭的萌發(fā)研究也表明,高鹽濃度的MS培養(yǎng)基會(huì)抑制種子萌發(fā)[17],但低鹽濃度MS培養(yǎng)基容易導(dǎo)致原球莖生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分不足[5],加入有機(jī)添加物可在一定程度上解決該問(wèn)題。

在培養(yǎng)基內(nèi)加入營(yíng)養(yǎng)有機(jī)物,對(duì)種子萌發(fā)、外植體分化、增殖有明顯的促進(jìn)作用[18]。椰汁和香蕉汁是復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)混合物,含有糖分、蛋白質(zhì)、酶和作用機(jī)制不明的有機(jī)物等,能為植物的生長(zhǎng)提供生理活性物質(zhì)和一些未知的微量成分[19]。在本實(shí)驗(yàn)中,椰汁對(duì)紫紋兜蘭原球莖及幼苗的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用,很有可能是因?yàn)橐又旧砗幸欢ǖ纳L(zhǎng)激素以及一些其他的活性組分,使植物的成熟細(xì)胞快速分裂[20]。而添加香蕉汁能促進(jìn)紫紋兜蘭原球莖提前分化,增加葉芽數(shù)量。香蕉汁是廣泛使用的有機(jī)添加物,能促進(jìn)外植體增殖分化和維持培養(yǎng)基的pH值,使原球莖在適宜的酸性條件下生長(zhǎng)[21]。但生根壯苗的培養(yǎng)結(jié)果顯示,添加香蕉汁的培養(yǎng)基中紫紋兜蘭幼苗的根和葉均生長(zhǎng)緩慢,這與何松林等[22]對(duì)培養(yǎng)蝴蝶蘭幼苗的研究結(jié)果一致。綜合本實(shí)驗(yàn),含有椰子汁成分的培養(yǎng)基比含有香蕉汁的培養(yǎng)基種子萌發(fā)率更高,說(shuō)明椰子汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)的配比更適合紫紋兜蘭的種子萌發(fā)和原球莖的生長(zhǎng),繁殖周期更短;而添加香蕉汁對(duì)原球莖有明顯的增殖作用;蘋(píng)果泥和土豆泥等有機(jī)添加物也常用于植物組培[23],但在本實(shí)驗(yàn)中,添加蘋(píng)果泥和土豆泥對(duì)種子的萌發(fā)并無(wú)顯著影響,可能這些有機(jī)物含有的維生素C、氨基酸或酶較少。

高麗偉[24]研究表明,在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度對(duì)細(xì)胞增殖分化和器官發(fā)生起著重要的作用。外植體的誘導(dǎo)與培養(yǎng)基中植物激素和培養(yǎng)基的內(nèi)源激素有關(guān),培養(yǎng)基的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比達(dá)到外植體的最佳濃度才能誘導(dǎo)叢生芽[25]。周艷等[26]研究表明,添加6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L適宜硬葉兜蘭原球莖的分化;楊燕萍等[27]在亨利兜蘭原球莖增殖分化的培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L 6-BA和2.0 mg/L NAA,叢生芽的增殖倍數(shù)較高。本實(shí)驗(yàn)中,在兩種培養(yǎng)基中加入0.2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA(濃度比為2∶1),種子的萌發(fā)率得到顯著提高,說(shuō)明適宜濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用。為了實(shí)現(xiàn)最佳的促根生理效應(yīng),值得探索兩種激素最佳配比的組合濃度[28]。不同兜蘭屬植物對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度具有不同的需求,這可能是不同物種內(nèi)源激素水平差異所致。此外,NAA對(duì)芽的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用,IBA 對(duì)根的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用,因此,尋找這兩種激素的最佳比例可以潛在地提高兜蘭屬植物在組織培養(yǎng)中的整體生長(zhǎng)和發(fā)育水平。

壯苗生根是增強(qiáng)組培苗對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力和抵抗能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié),移栽后能大幅度縮短緩苗時(shí)間,加快幼苗生長(zhǎng)[29]。不同成分的培養(yǎng)基對(duì)壯苗生根有不同影響。本研究發(fā)現(xiàn),H培養(yǎng)基中幼苗根系長(zhǎng)而健壯,移栽后成活率高;I培養(yǎng)基中幼苗根系較短,植株生長(zhǎng)也相對(duì)較弱,移栽后的植株長(zhǎng)勢(shì)不如前者好。移栽基質(zhì)是移栽成活的關(guān)鍵因素,兜蘭的移栽基質(zhì)一般選擇火山石、松樹(shù)皮、泥炭土、泥炭蘚等及其混合基質(zhì)[30],如長(zhǎng)瓣兜蘭、小葉兜蘭和杏黃兜蘭適宜用保水保肥較好的水苔[31-32];亨利兜蘭、麻栗坡兜蘭和百花兜蘭適宜用保濕瀝水、通風(fēng)透氣、養(yǎng)分豐富等優(yōu)點(diǎn)的松樹(shù)皮[27,33]。而在紫紋兜蘭的栽培實(shí)驗(yàn)中,腐殖土和松樹(shù)皮配比1∶1(體積比)混合是移栽最優(yōu)基質(zhì),共移栽30株組培苗,成活率高達(dá)90%。組培苗管理也是影響長(zhǎng)勢(shì)的因素之一,如光照、水分、通風(fēng)、肥水和病蟲(chóng)害等,都需要制定科學(xué)合理的管理標(biāo)準(zhǔn)。