杜雅萍

(自然資源部第三海洋研究所,海洋生物遺傳資源重點實驗室,福建 廈門 361005)

紅樹林生長之地處于陸地與海洋的交匯,常年經(jīng)受潮汐浸淹.廈門市集美區(qū)紅樹林以秋茄為主,根植于沿海灘涂一帶,主要保護(hù)海岸帶不受風(fēng)浪侵蝕,也是廈門一道亮麗的風(fēng)景線.紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是異養(yǎng)微生物、營養(yǎng)物質(zhì)、樹和海洋生物緊密結(jié)合的有機(jī)體.紅樹林根的滲出液為很多細(xì)菌的生長和繁殖提供營養(yǎng),細(xì)菌參與了紅樹林沉積物絕大部分的碳循環(huán)[1].因此,可以利用紅樹林環(huán)境的特殊性,從其沉積物中篩選具有產(chǎn)酶活性的菌株.木聚糖來源比較廣泛,是植物細(xì)胞壁半纖維素的主要成分,包括植物組織、細(xì)菌、真菌和原生動物等[2].木聚糖酶在食品、飼料、工業(yè)等均有廣泛應(yīng)用[3-4].酸性果膠酶指內(nèi)聚半乳糖醛酸酶,可無規(guī)則地水解果膠酸分子中的α-1,4糖苷鍵,目前已廣泛應(yīng)用于果蔬汁生產(chǎn)和果酒澄清領(lǐng)域.此外,在木質(zhì)防腐、生物制漿、環(huán)境保護(hù)、污物軟化處理等行業(yè)中也有著重要作用,是四大酶制劑之一[5].纖維素在自然界中分布廣,占植物干重的35%～50%,是產(chǎn)量最多的碳水化合物資源[6-7].纖維素酶能把纖維素分子降解成葡萄糖,可有效避免浪費(fèi)和污染,且適應(yīng)溫度和酸堿度范圍較廣,可應(yīng)用于生物、食品、能源、紡織等領(lǐng)域[8].本研究試圖從紅樹林生境中獲取新穎的具有產(chǎn)酶活性的可培養(yǎng)微生物,獲得的菌株用于酶制劑的開發(fā)利用.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 沉積物樣品1份,來自于福建省廈門市集美區(qū)紅樹康橋公交站旁海邊紅樹林根際土壤(經(jīng)度:118.106 2、緯度:24.579 1),采集時間為2020年3月.

1.1.2 培養(yǎng)基 本研究采用3種酶篩選培養(yǎng)基,底物分別為木聚糖、纖維素和果膠.木聚糖富集培養(yǎng)基:木聚糖10.0 g/L,(NH4)2SO420.0 g/L,KH2PO42.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,pH值為7.2.羥甲基纖維素富集培養(yǎng)基:(NH4)2SO42.0 g/L,K2HPO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,NaCl 30.0 g/L,CMC-Na 15.0 g/L,pH值為7.2.果膠富集培養(yǎng)基:果膠10.0 g/L,Na2HPO45.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,pH值為4.5.木聚糖分離培養(yǎng)基:木聚糖10 g/L,(NH4)2SO420 g/L,KH2PO42.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,瓊脂粉20.0 g/L,pH值為7.2.羥甲基纖維素剛果紅分離培養(yǎng)基:K2HPO40.5 g/L,MgSO40.25 g/L,CMC 1.88 g/L,剛果紅0.2 g/L,明膠2.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,瓊脂14.0 g/L,pH值為7.2.果膠分離培養(yǎng)基:果膠5.0 g/L,Na2HPO45.0 g/L,NaCl 30.0 g/L,瓊脂20.0 g/L,pH值為4.5.純化培養(yǎng)基為青島海博2216E瓊脂培養(yǎng)基.酶活驗證培養(yǎng)基為2216E+底物配制瓊脂培養(yǎng)基.

1.1.3 主要試劑和儀器 細(xì)菌基因組提取試劑盒(上海賽百盛),真菌基因組提取試劑盒(Magen),PCR相關(guān)試劑(北京全式金生物),其他試劑購自國藥集團(tuán).IS-RDS4低溫疊加式恒溫振蕩器(美國精騏有限公司),BiometraPCR儀(德國耶拿分析儀器有限公司),PICO 17微量高速離心機(jī)(美國Thermo Scientific),DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠),Tanon-2500凝膠成像分析儀(上海天能科技有限公司).

1.2 紅樹林沉積物可培養(yǎng)菌株的分離、鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化分析

1.2.1 細(xì)菌富集和分離 各取樣品2 g,分別接種至裝有50 mL木聚糖富集培養(yǎng)基、50 mL果膠富集培養(yǎng)基和50 mL纖維素富集培養(yǎng)基的三角瓶中,置于搖床,28 ℃,150 r/min富集培養(yǎng).培養(yǎng)7 d后,分別取100 μL菌液,相應(yīng)地轉(zhuǎn)接到50 mL三角瓶的3種富集培養(yǎng)基中,置于搖床,28 ℃ 150 r/min進(jìn)行第二次富集;待培養(yǎng)7 d后,再分別取100 μL菌液置于已裝有900 μL無菌海水的離心管中,震蕩混勻后,梯度稀釋,最后選取10-4和10-5等2個稀釋度涂布平板,進(jìn)行細(xì)菌的第一次分離.培養(yǎng)7 d后進(jìn)行第二次梯度稀釋,取10-4、10-5、10-63個稀釋度涂布平板采用10倍梯度稀釋涂布平板法,進(jìn)行細(xì)菌的第二次分離.獲得單菌落后,采用四區(qū)劃線法分離純化,獲得純培養(yǎng)物.

1.2.2 菌株鑒定 菌株DNA參照上海賽百盛試劑盒說明書,按步驟提取.對于較難抽提的真菌菌株,用液氮冷凍研磨后再用真菌試劑盒提取[9].16S rRNA基因采用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,18S rRNA基因采用真菌通用引物ITS5F和LR6R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物送廈門鉑瑞生物科技有限公司測序.

1.2.3 菌株多樣性分析 所測基因序列經(jīng)過多序列比對、去重復(fù),提交EzBioCloud、NCBI等權(quán)威數(shù)據(jù)庫比對,確定其分類地位.

1.3 紅樹林沉積物可培養(yǎng)菌株的產(chǎn)酶活性篩選和驗證

運(yùn)用改進(jìn)的平板法,分別以可溶性淀粉、脫脂牛奶、三丁酸甘油酯、果膠、木聚糖、羧甲基纖維素鈉為底物,在2216E培養(yǎng)基上分析紅樹林沉積物細(xì)菌產(chǎn)胞外淀粉酶、蛋白酶、脂酶(三丁酸甘油酯)、果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性[10].

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 紅樹林沉積物可培養(yǎng)菌株的分離鑒定

從紅樹林沉積物樣品中,共獲得27株菌,通過16S rRNA和18S rRNA基因測序剔除重復(fù),菌株可分為18株細(xì)菌、3株酵母和6株絲狀真菌,其活性及分類地位如表1所示,所有菌種保藏于中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC).

2.2 紅樹林沉積物中篩選可培養(yǎng)菌株的多樣性分析

紅樹林沉積物菌株的多樣性分析表明:18株細(xì)菌分別屬于γ-變形菌綱(11株,69%),放線菌綱(高G+C革蘭氏陽性菌)(5株,19%),擬桿菌綱(2株,12%)3大類群.18株細(xì)菌可分為13個屬的16個種(表1),具有較高多樣性.菌株數(shù)量較多的8個屬為γ-變形菌綱中的Oceanimonas(2株)、Vibrio(2株)、Pseudomonas(2株)、Celerinatantimonas(1株)、Pseudoalteromonas(1株)、Mangrovibacter(1株)、Klebsiella(1株)、Pantoea(1株);5株放線菌綱分別屬于Curtobacterium(2株)、Isoptericola(1株)、Gordonia(1株)、Leifsonia(1株)4個屬;擬桿菌綱為1個屬Algoriphagus(2株).

這18株細(xì)菌與近緣模式菌株一起構(gòu)建Neighbour-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1.9株真菌包含3株酵母,5株絲狀真菌,1株毛霉菌門(Mucoromycota)毛霉亞門(Mucoromycotina)菌株.其中,3株酵母屬于酵母亞門(Saccharomycotina),5株絲狀真菌屬于盤菌亞門(Pezizomycotina).這9株真菌與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫菌株一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2.同時,分離得到的18株細(xì)菌包含2株潛在新種(16S rRNA基因的相似度低于98.65%),9株真菌包含2株潛在新種(18S rRNA基因的相似度低于98%).結(jié)果表明:本實驗分離到的紅樹林沉積物菌株多樣性十分豐富,且潛在新種的基因新穎有較高的研究價值.

圖1 可培養(yǎng)細(xì)菌單菌與模式菌16S rRNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 采用Neighbour-Joining法構(gòu)建的9株真菌及對應(yīng)相近菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 紅樹林沉積物中產(chǎn)酶菌株的篩選驗證

采用3種篩選培養(yǎng)基對同一個紅樹林沉積物樣品進(jìn)行了篩選,結(jié)果表明,3種培養(yǎng)基上獲得的菌株數(shù)量不同.隨后將這27株紅樹林菌株都采用平板改良法測試了淀粉酶、蛋白酶、脂酶(三丁酸甘油酯)、果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性.統(tǒng)計結(jié)果表明,這些菌株中,木聚糖酶陽性1株;纖維素酶陽性3株;果膠酶陽性7株,弱陽性1株;淀粉酶弱陽性1株;蛋白酶陽性6株,弱陽性2株;酯酶(三丁酸甘油酯)陽性2株,弱陽性9株.其中,菌株同時具有兩種以上酶活力的有3株.酶活水解圈直徑與菌落直徑比值范圍分別是:果膠酶0.3～3.3,蛋白酶0.4～2.2,脂酶(三丁酸甘油酯)1.5.

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 紅樹林可培養(yǎng)菌株多樣性

紅樹林生態(tài)系統(tǒng)不僅是鳥類、魚蝦貝類、微生物的聚集地,還蘊(yùn)含著豐富、獨(dú)特的微生物資源.紅樹林來源的微生物可產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、果膠酶、瓊脂糖酶等多種用途廣泛的酶類.此外,紅樹林微生物還可代謝產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富的次級代謝產(chǎn)物,如生物堿類、環(huán)肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、多糖類、不飽和脂肪酸類等.這些代謝產(chǎn)物大多具備生物活性,例如抗菌、殺蟲、細(xì)胞毒性、抗氧化、抑制劑等[8].因此,從紅樹林環(huán)境篩選新的產(chǎn)木聚糖酶、酸性果膠酶和纖維素酶菌株的概率較大.本研究對紅樹林沉積物產(chǎn)木聚糖酶、酸性果膠酶和纖維素酶進(jìn)行富集篩選,經(jīng)過16S rRNA基因和18S rRNA基因測序、剔除重復(fù)后,共獲得27株菌.

木聚糖篩選獲得6株細(xì)菌,分屬于Curtobacterium(2株)、Leifsonia(1株)、Mangrovibacter(1株)、Klebsiella(1株),以及Pantoea(1株)等5個屬,其中Mangrovibacter、Klebsiella、Pantoea屬于γ-變形菌綱,Curtobacterium、Leifsonia屬于放線菌綱;5株絲狀真菌分屬于Trichoderma(2株)、Aureobasidium(1株)、Fusarium(1株)、Aspergillus(1株);2株酵母菌Geotrichum(1株)和Kluyveromyces(1株).木聚糖酶產(chǎn)生菌中,以真菌和細(xì)菌為主,真菌占53.8%,這與其他木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選報道結(jié)論基本吻合.

酸性果膠篩選獲得了3株菌.分別屬于γ-變形菌綱、酵母亞門、毛霉亞門的Celerinatantimonas、Candida和Mucor3個屬.酸性果膠的相關(guān)研究較少,主要產(chǎn)酶菌株是真菌.

纖維素篩選獲得了11株細(xì)菌,分別屬于Oceanimonas(2株)、Vibrio(2株)、Pseudomonas(2株)、Algoriphagus(2株)、Pseudoalteromonas(1株)、Isoptericola(1株)、Gordonia(1株)7個屬,其中Oceanimonas、Vibrio、Pseudomonas、Pseudoalteromonasa屬于γ-變形菌綱,Algoriphagus屬于擬桿菌綱,Isoptericola、Gordonia屬于放線菌綱.已報道的纖維素酶產(chǎn)生微生物主要有真菌、放線菌和部分酵母菌[11],關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶方面的研究報道較少.

本研究針對3種不同酶篩培養(yǎng)基獲得的菌株進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示在不同的培養(yǎng)條件下獲得了不同的菌株.所有獲得的菌株,真菌占比33.3%,放線菌占比18.5%,細(xì)菌占比48.2%.其中,細(xì)菌中γ-變形菌綱占比40.7%,擬桿菌綱占比7.4%.這說明有針對性的設(shè)置培養(yǎng)方式,能有效減少細(xì)菌資源的遺漏.孫超等[12]在紅樹林沉積物中,利用不同天然有機(jī)多聚物富集分離到的優(yōu)勢可培養(yǎng)細(xì)菌為變形菌門、擬桿菌門.真菌和放線菌是紅樹林環(huán)境中的常見類群,分離的菌株一般有很好的耐鹽耐堿性質(zhì),具有潛在的研究和工業(yè)應(yīng)用價值.這與本實驗獲得菌株類型一致.

3.2 紅樹林可培養(yǎng)菌株產(chǎn)酶活性鑒定

通過底物特異性篩選表明:木聚糖酶活陽性菌株僅有1株戈登氏菌(Gordonia),且為弱陽性.纖維素酶活陽性3株分別是弧菌(Vibrio)2株和大洋單胞菌(Oceanimonas)1株.果膠酶活陽性7株,分別是弧菌(Vibrio)2株、短小桿菌(Curtobacterium)2株、雷夫松氏細(xì)菌(Leifsonia)1株、克魯維酵母(Kluyveromyces)1株、暫無(Celerinatantimonas)1株、出芽短梗霉(Aureobasidium)1株、紅樹林小桿菌(Mangrovibacter)1株;蛋白酶活陽性6株,分別是短小桿菌(Curtobacterium)2株、弧菌(Vibrio)1株、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasa)1株、噬冷菌(Algoriphagus)1株、出芽短梗霉(Aureobasidium)1株,弱陽性2株為弧菌(Vibrio)1株和克魯維酵母(Kluyveromyces)1株.酯酶(三丁酸甘油酯)酶活陽性2株弧菌(Vibrio)1株和假交替單胞菌(Pseudoalteromonasa)1株;弱陽性9株,分別是噬冷菌(Algoriphagus)1株、假絲酵母(Candida)1株、短小桿菌(Curtobacterium)2株、白蟻菌(Isoptericola)1株、克魯維酵母(Kluyveromyces)1株、雷夫松氏細(xì)菌(Leifsonia)1株、紅樹林小桿菌(Mangrovibacter)1株、毛霉(Mucor)1株.淀粉酶活弱陽性1株,為白蟻菌(Isoptericola).實驗表明產(chǎn)酶活力最好的菌株:酸性果膠酶菌株為MCCC 1A17838(Vibrio),蛋白酶、酯酶菌株為MCCC 1A17837(Pseudoalteromonasa),纖維素酶菌株為MCCC 1A17838(Vibrio)、MCCC 1A17836(Vibrio)、MCCC 1A17835(Oceanimonas),木聚糖酶菌株為MCCC 1A17909(Gordonia),可為接下來應(yīng)用提供參考價值.

據(jù)報道,Trichoderma[13]菌株具有產(chǎn)木聚糖酶能力,Aspergillus[14]菌株具有產(chǎn)木聚糖酶、酸性果膠酶能力.雖然個別菌株用酶活平板法驗證木聚糖酶活性時沒有檢測到透明圈,但定量分析卻檢測到其具有酶活性,這可能是因為活性比較弱造成的.在產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌和羧甲基纖維素鈉的研究中,Avellanedatorres等[15]從哥倫比亞內(nèi)瓦多斯國家自然公園篩選到了25株細(xì)菌,產(chǎn)纖維素酶菌群主要為假單胞菌.高兆明[16]從廈門紅樹林泥樣中分離到1株具有活性纖維素酶基因的新種Vibrio(G21),并對其纖維素酶基因進(jìn)行了克隆和重組表達(dá).在本實驗中Vibrio也同樣有纖維素酶活性.

3.3 紅樹林可培養(yǎng)菌株潛在新種資源

本研究從紅樹林沉積物中分離鑒定到27株可培養(yǎng)菌株.其中潛在新種資源4株,分別是細(xì)菌MCCC 1A17872(Celerinatantimonas)和MCCC 1A17842(Isoptericola),酵母菌MCCC 2A00428(Candida)和絲狀真菌MCCC 3A01722(Mucor),獲得的新種資源為微生物系統(tǒng)進(jìn)化提供實際依據(jù),目前已開展對MCCC 1A17872(Celerinatantimonas)的系統(tǒng)分類學(xué)鑒定.

4 結(jié)論

本研究通過對紅樹林沉積物進(jìn)行富集培養(yǎng)、分離、純化、酶活性測定、鑒定等過程,獲得了27株具有產(chǎn)木聚糖酶、酸性果膠酶和纖維素酶能力的菌株。這27株菌中,18株為細(xì)菌、3株為酵母、6株為絲狀真菌.木聚糖酶、酸性果膠酶和纖維素酶在食品、飼料、工業(yè)、能源、紡織等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值.因此,這些產(chǎn)酶菌株的獲得不僅豐富了產(chǎn)酶微生物資源,同時為酶類微生態(tài)制劑的開發(fā)應(yīng)用提供了可能.