鄭海嬌， 許文輝， 賈瓊

乙烯砜功能化磁性顆粒的制備及在棕櫚酰化肽分析中的應(yīng)用

鄭海嬌， 許文輝， 賈瓊

（吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012）

以乙烯砜修飾的磁性顆粒作為磁性固相萃取(MSPE)平臺(tái)的載體, 與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜或液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜樣品中低豐度棕櫚?；牡姆蛛x富集. 通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、 紅外光譜、 振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、 X射線衍射和Zeta電位測(cè)定等手段對(duì)合成的功能化磁性材料進(jìn)行了表征. 用自合成的棕櫚?；淖貦磅］o酶A模擬棕櫚?；臉?biāo)準(zhǔn)樣品, 在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下, 構(gòu)建的MSPE-MS平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)棕櫚酰化肽的高選擇性(牛血清白蛋白酶解物與棕櫚?；牡哪柋葹?000∶1)和高靈敏度(檢出限為1.0 fmol/μL)檢測(cè). 研究結(jié)果表明, 經(jīng)乙烯砜功能化的磁性材料對(duì)小鼠肝細(xì)胞裂解液中低含量的棕櫚酰化肽具有較高的選擇性, 所建立的方法適用于復(fù)雜樣品的分離分析.

乙烯砜； 磁性顆粒； 磁性固相萃?。?棕櫚?；模?質(zhì)譜檢測(cè)

長(zhǎng)鏈脂肪酸在蛋白質(zhì)上進(jìn)行共價(jià)加成的過(guò)程被稱為蛋白質(zhì)脂質(zhì)化修飾. 作為唯一完全可逆的脂質(zhì)化修飾， 蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾是棕櫚酸分子通過(guò)不穩(wěn)定的硫酯鍵將脂質(zhì)長(zhǎng)鏈共價(jià)結(jié)合在可溶性跨膜蛋白分子的半胱氨酸（S）的巰基側(cè)鏈上. 長(zhǎng)鏈脂質(zhì)分子的加入增加了蛋白質(zhì)的疏水性， 從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、 組裝、 活性、 亞基定位與蛋白-蛋白相互作用等功能. 蛋白質(zhì)的棕櫚?；诩?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 代謝等過(guò)程中起著重要作用［1～3］. 大量研究揭示了棕櫚?；鞍自谏頇C(jī)能和疾病發(fā)生發(fā)展中起到潛在的機(jī)制調(diào)節(jié)功能. 如， 引發(fā)全球范圍內(nèi)流行的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus disease 2019， COVID-19）的新型冠狀病毒（Servere acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）的刺突蛋白S和包膜蛋白E上均有棕櫚?；稽c(diǎn)， 研究這些蛋白的棕櫚?；蔀檠芯啃滦凸跔畈《镜闹虏C(jī)制提供思路［4，5］. 目前， 對(duì)棕櫚酰化蛋白組學(xué)的研究主要依靠棕櫚?；鞍椎募兓?lián)合高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù). 由于脂質(zhì)修飾的亞化學(xué)計(jì)量水平以及棕櫚酰化肽的疏水性和硫酯連接的潛在不穩(wěn)定性， 使得采用質(zhì)譜技術(shù)直接對(duì)棕櫚?；鞍走M(jìn)行分析仍然具有一定的挑戰(zhàn)性， 因此， 在質(zhì)譜檢測(cè)前對(duì)樣品進(jìn)行富集純化的前處理步驟十分重要.

蛋白質(zhì)棕櫚?；募兓夹g(shù)主要有酰基-生物素交換法（Acyl-biotin exchange， ABE）和點(diǎn)擊化學(xué)法［1，6～8］. ABE法的主要原理是利用羥胺試劑選擇性地標(biāo)記含有硫酯鍵的棕櫚?；稽c(diǎn). 點(diǎn)擊化學(xué)法是使用炔標(biāo)記的棕櫚酸配體進(jìn)行代謝標(biāo)記， 然后用帶有熒光團(tuán)的疊氮化物對(duì)棕櫚?；倪M(jìn)行生物正交標(biāo)記檢測(cè)或用帶有親和標(biāo)記的疊氮化物進(jìn)行親和富集. 然而， 許多檢測(cè)方法仍會(huì)受到大量假陽(yáng)性結(jié)果的干擾. 這種大量出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因是所采用的分離富集過(guò)程操作繁多， 不可避免地影響了方法的靈敏度和選擇性. 2018年， Lu等［9］發(fā)展了一種基于二硫二吡啶功能化磁性納米顆粒的針對(duì)棕櫚?；牡男滦透患呗詠?lái)系統(tǒng)性地鑒定復(fù)雜樣品中的棕櫚?；揎? 該研究首次實(shí)現(xiàn)了利用功能化磁性材料富集棕櫚酰化肽， 將磁性固相微萃取技術(shù)（Magnetic solid phase extraction， MSPE）引入到蛋白質(zhì)棕櫚?；牡那疤幚磉^(guò)程中， 鑒定當(dāng)時(shí)最大的小鼠棕櫚?；瘮?shù)據(jù)庫(kù)， 同時(shí)降低了分析結(jié)果的假陽(yáng)性， 為實(shí)現(xiàn)易修飾、 易操作、 耗時(shí)短及靈敏度高的棕櫚?；姆蛛x富集方法提供了新思路. 由此可見(jiàn)， 進(jìn)一步開(kāi)發(fā)對(duì)棕櫚?；木哂休^強(qiáng)捕獲能力的功能化磁性富集材料是棕櫚?；揎棞?zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)需求.

乙烯砜是一種活性不飽和烴， 由于砜基的強(qiáng)吸電子作用而具有較高的反應(yīng)活性， 在不同pH條件下可識(shí)別巰基、 氨基和糖羥基. 在pH=6.5～7.5的中性條件下僅能識(shí)別巰基［10～12］， 是選擇性專(zhuān)一的保證. 乙烯砜識(shí)別巰基的條件溫和、 識(shí)別迅速且操作簡(jiǎn)便； 同時(shí)乙烯基砜基在水溶液中具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性， 副反應(yīng)少且易于儲(chǔ)存， 所以制備基于乙烯砜基的磁性納米材料用于棕櫚酰化肽的捕獲具有較高的可行性. 其主要機(jī)理為乙烯基可以與親核基團(tuán)巰基發(fā)生Michael加成反應(yīng)， 且該反應(yīng)沒(méi)有副產(chǎn)物［13］. 研究表明， 乙烯基砜的雙鍵與1分子的親核試劑發(fā)生加成反應(yīng)生成單加合物后， 裸露的另一端仍保持高反應(yīng)活性， 易與其它基團(tuán)反應(yīng)生成交聯(lián)加合物［14］， 該性能為將乙烯砜基引入各類(lèi)基底材料提供了基礎(chǔ). 本文利用水熱法合成了四氧化三鐵（Fe3O4）納米顆粒， 以硅酸四乙酯（TEOS）對(duì)其進(jìn)行包覆后再以3-巰丙基三乙氧基硅烷（MPTS）對(duì)硅烷化的磁性納米顆粒進(jìn)行第一步后修飾， 使磁性納米顆粒表面帶有巰基. 再通過(guò)巰烯點(diǎn)擊反應(yīng)將雙（乙烯砜基）丙醇（BVP）包覆到巰基修飾的顆粒表面， 得到乙烯砜基功能化的磁性納米顆粒（命名為MagBVP）. 實(shí)驗(yàn)采取成本低、 耗時(shí)短、 簡(jiǎn)單且產(chǎn)量高的有機(jī)合成方法， 制備了可重復(fù)利用的磁性納米顆粒. 以棕櫚?；淖貦磅；o酶A作為標(biāo)準(zhǔn)肽段模型， 建立了MSPE-MS平臺(tái)， 考察了基于乙烯砜基修飾的磁性納米顆粒對(duì)棕櫚?；牡母患芰胺椒ǖ倪m用性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

乙二胺四乙酸（EDTA， 純度99%）、 三氟乙酸（TFA， 純度≥98%）、 硅酸四乙酯（TEOS， 純度99%）、 3-巰丙基三乙氧基硅烷（MPTS， 純度99%）、 乙腈（ACN， 純度99%）、 2，5-二羥基苯甲酸（DHB， 純度99%）、 羥氨（NH2OH， 純度99%）、 棕櫚酰輔酶A（palmitoylcoA， 純度99%）、 牛血清蛋白（BSA， 純度99%）、 胰蛋白酶（Trypsin， 純度99%）、 二硫蘇糖醇（DTT， 純度99%）、 碘乙酰胺（IAA， 純度99%）、 鹽酸緩沖溶液（Tris-HCl， 純度99%）、 雙（乙烯砜基）丙醇（BVP， 純度99%）、 十二烷基硫酸鈉（SDS， 純度99%）、 乙二胺四乙酸（EDTA， 純度99%）、 棕櫚酰氯（純度≥95%）、 甲酸（純度99%）和二羥基苯甲酸（DHB， 純度99%）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 三氯化鐵（FeCl3·6H2O， 純度≥98%）、 醋酸鈉（NaAc， 純度99%）、 鹽酸（HCl， 純度99%）、 氨水（NH3·H2O， 純度25%）、 石油醚（純度≥98%）、 無(wú)水乙醇（純度≥98%）、 乙二醇（純度≥98%）、 甲醇（純度≥98%）、 甲苯（純度≥98%）、，-二甲基甲酰胺（DMF， 純度≥98%）、 氯化鈉（NaCl， 純度≥98%）和三氯甲烷（純度≥98%）均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司； AML12細(xì)胞裂解液購(gòu)于上海生物科技有限公司； 實(shí)驗(yàn)用水均采用Milli-Q超純水儀制備的高純水； 所用緩沖溶液為現(xiàn)配的鹽酸緩沖溶液（50 mmol/L， Tris-HCl）.

UID-VSM型磁學(xué)性能測(cè)試系統(tǒng)（美國(guó)Quantum Design公司）； SU8020型冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本 Hitachi公司）； SQNicolet IS5型傅里葉變換紅外光譜儀（德國(guó)Bruker公司）； Zetasizer Nano ZS ZEN3600型納米粒度和ZETA電位分析儀（英國(guó)Malvern公司）； X射線衍射儀（荷蘭PANalytical B.V.公司）； Milli-Q型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）； AB Sciex 5800型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）； Thermo Scientific Q Exactive?液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）.

1.2　實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)棕櫚?；哪Ｐ偷暮铣蓸?biāo)準(zhǔn)棕櫚酰化肽模型（命名為PalmitoylcoA-palm）通過(guò)棕櫚酰氯與棕櫚酰輔酶A的?；磻?yīng)合成［15］. 將50 μg棕櫚酰輔酶A與5 μL棕櫚酰氯溶于1 mL TFA溶液中， 于25 ℃攪拌30 min. 所得產(chǎn)物經(jīng)重結(jié)晶后用石油醚和無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌， 再經(jīng)真空烘干， 烘干的粉末經(jīng)真空凍干成棕櫚?；牡膬龈煞?， 備用.

1.2.2羥胺化處理稱取上述凍干粉（1.0 mg）溶解于1 mL Tris-HCl緩沖溶液中， 混合均勻后加入EDTA和三氯甲烷-甲醇溶劑， 靜置10 min， 再依次加入0.04 g/mL SDS， 150 mmol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA和0.67 mol/L的NH2OH（pH=7.5）， 加熱至沸騰并保持10 min［16］.

1.2.3酶解步驟稱取1 mg BSA凍干粉標(biāo)準(zhǔn)品溶解于含有8 mol/L尿素的1 mL Tris-HCl緩沖溶液中， 加入100 μL DTT（1 mol/L）， 在56 ℃下反應(yīng)1 h， 隨后加入37 mg IAA， 室溫下于暗室中繼續(xù)反應(yīng) 45 min. 將烷基化處理后的樣品用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至尿素濃度小于1 mol/L， 將BSA樣品置于100 ℃金屬浴中加熱10 min使蛋白發(fā)生變性反應(yīng). 待樣品冷卻至室溫后， 按比例加入1 mg/mL的胰蛋白酶（BSA與胰蛋白酶的質(zhì)量比為50∶1）， 于37 ℃振蕩水浴裝置中進(jìn)行酶解反應(yīng)， 反應(yīng)16 h后加入2 μL甲酸充分混勻， 室溫下靜置1 h， 所制備的酶解液均保存于-20℃冰箱中備用［17］.

1.2.4實(shí)際樣品的處理AML12細(xì)胞裂解液經(jīng)上述酶解步驟后進(jìn)行羥胺化處理， 備用.

1.2.5MagBVP的合成MagBVP顆粒的合成主要包括以下4步： （1） 采用水熱法合成Fe3O4顆粒［18～20］. 稱量1.35 g FeCl3·6H2O溶于75 mL乙二醇溶劑中， 攪拌均勻后加入3.60 g NaAc， 繼續(xù)攪拌至生成黃色溶液. 將黃色混合溶液移至100 mL的不銹鋼反應(yīng)釜中， 置于200 ℃烘箱中反應(yīng)16 h后， 冷卻至室溫. 將產(chǎn)物用乙醇和超純水依次反復(fù)沖洗， 通過(guò)磁吸法分離得到Fe3O4顆粒. （2） 對(duì)合成的Fe3O4顆粒進(jìn)行硅烷化. 稱量350 mg Fe3O4顆粒均勻分散于275 mL乙醇-水（體積比4∶1）溶液中， 加入1.4 mL NH3·H2O（質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%）并充分混勻， 再加入1 mL TEOS， 于25 ℃攪拌反應(yīng)12 h， 通過(guò)磁吸法分離得到硅烷化的Fe3O4顆粒（命名為MagTEOS）. （3） MagTEOS的巰基化. 稱量100 mg MagTEOS分散到30 mL乙醇中， 加入1.3 mL MPTS， 室溫下攪拌1 h， 通過(guò)磁吸分離得到巰基化的磁性顆粒（命名為MagMPTS）［21］. （4） BVP的后修飾. 稱量100 mg BVP和10 mg DMAP， 依次加入到10 mL DMF和400 μL DIPEA的混合溶液中， 充分混勻后加入MagMPTS， 室溫下攪拌24 h. 依次用DMF和純水清洗產(chǎn)物， 通過(guò)磁吸分離得到終產(chǎn)物——BVP修飾的磁性顆粒（命名為MagBVP）.

1.2.6MSPE富集棕櫚?；倪^(guò)程將制備的MagBVP用Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L， pH=6.5）多次洗滌后再將其分散于Tris-HCl緩沖溶液（10 mg/mL）中備用. MSPE前處理步驟主要包括上樣、 清洗和 解吸［22，23］. 首先， 取20 μL上述儲(chǔ)備液加入到100 μL樣品溶液中（所需的不同濃度的樣品均用緩沖溶劑進(jìn)行稀釋?zhuān)?用恒溫振蕩器在室溫下振蕩45 min后， 通過(guò)磁吸分離樣品與材料. 除去溶劑后， 每次用100 μL Tris-HCl緩沖溶劑對(duì)材料反復(fù)洗滌3次， 以清洗去除非目標(biāo)肽段. 最后， 在清洗過(guò)的材料中加入30 μL解吸液（50% ACN/H2O + 0.1% TFA）， 室溫下振蕩20 min， 以磁吸的方式分離材料并收集解析液以用于后續(xù)分析.

1.2.7儀器條件設(shè)置MALDI-TOF MS條件設(shè)置： 標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)樣品均用AB Sciex 5800型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)試， 選用陽(yáng)離子模式， 采用含25 mg/mL DHB的50%ACN/H2O+0.1%TFA溶液作為基質(zhì). 測(cè)試前， 取待測(cè)樣品與DHB基質(zhì)溶液各0.5 μL， 均勻混合后滴于質(zhì)譜儀靶板表面. 其它參數(shù)設(shè)置如下： 離子源溫度110 ℃； 電噴霧電壓2.3 kV； 掃描范圍/z 1000～3500； 毛細(xì)管電壓3500 V； 碰撞解離能量10 eV.

LC-MS/MS的液相色譜條件設(shè)置： RSLC C18色譜柱（75 μm i.d.×150 mm）， 流動(dòng)相A為0.1%甲酸， 流動(dòng)相B為0.1%甲酸+80% ACN， 梯度洗脫模式： 0～3 min， 95%A； 3～28 min， 90%～62%A； 31～40 min， 62%～0%A. 流速500 nL/min. 質(zhì)譜條件設(shè)置： 一級(jí)質(zhì)譜分辨率120000， AGC target： 4×105， Maximum IT： 50 ms， 掃描范圍/350～1550； 二級(jí)質(zhì)譜分辨率50000， AGC target： 1×105， Maximum IT： 100 ms， TopN： 20， NCE/stepped NCE： 32.

1.2.8數(shù)據(jù)庫(kù)分析采用 PEAKS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索， 蛋白酶解類(lèi)型為胰蛋白酶， 最多允許3個(gè)漏切位點(diǎn)， 母離子質(zhì)量偏差1.5×10?5， 碎片離子質(zhì)量誤差0.03 Da， 可變修飾： Palmitoylation， 固定修飾： Carbamidomethylation.

2 結(jié)果與討論

2.1　MagBVP的合成與表征

MagBVP的合成及MSPE流程見(jiàn)Scheme 1. 經(jīng)BVP修飾前后Fe3O4顆粒的形貌和大小可通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）來(lái)觀察. 由圖1可見(jiàn)， 只經(jīng)TEOS硅烷化后的Fe3O4顆粒表面較光滑且顆粒有明顯聚集的現(xiàn)象［圖1（A）］； 經(jīng)MPTS進(jìn)一步修飾后的顆粒表面略微粗糙， 聚集現(xiàn)象無(wú)明顯改善， 顆粒直徑尺寸略大于MagTEOS［圖1（B）］. 經(jīng)BVP第二步后修飾的Fe3O4顆粒表面更加粗糙的同時(shí)分散性有一定改善， 且顆粒尺寸為3種顆粒中最大的， 主要原因是通過(guò)表面覆蓋的修飾物降低了顆粒之間的磁性偶極吸引［圖1（C）］. 采用紅外光譜（FTIR）對(duì)MagBVP及合成過(guò)程中的中間產(chǎn)物進(jìn)行了表征， 結(jié)果見(jiàn)圖2. 圖2（A）譜線～中， MagTEOS， MagMPTS及MagBVP 3種磁性顆粒在1078和788 cm-1處均有相似的特征吸收峰， 分別由Fe—O鍵的彎曲振動(dòng)、 Si—O—Si鍵不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和Si—O鍵的彎曲振動(dòng)引起， 說(shuō)明Fe3O4顆粒的已硅烷化. 對(duì)比譜線和發(fā)現(xiàn)， 在3469和1568 cm-1處出現(xiàn)了屬于S—H和C—S的特征吸收峰， 證實(shí)了MTPS已修飾. 對(duì)比譜線和發(fā)現(xiàn)， 增加了1188 cm-1處的吸收峰， 該峰歸屬于S=O的伸縮振動(dòng)， 說(shuō)明MagBVP已制備. 圖2（B）為3種磁性顆粒的振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（VSM）曲線， 修飾前/后磁性微球的飽和磁通量分別為77.4， 71.8和53.9 A·m2·kg?1， 均達(dá)到磁性分離要求. 圖2（B）中插圖表明在外界磁場(chǎng)作用下， MagBVP可以在約30 s的時(shí)間內(nèi)迅速與溶液分離. 圖2（C）中譜線～為3種磁性顆粒的X射線衍射（XRD）譜圖， 對(duì)比JCPDS粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合委員會(huì)中數(shù)據(jù)庫(kù)， 3種磁性顆粒均出現(xiàn)的衍射峰（2=30.3°， 35.6°， 43.4°， 57.3°， 63.0°）與Fe3O4的（220）， （311）， （400）， （511）和（440）晶面相匹配［24］， 說(shuō)明基團(tuán)的后修飾并未破壞鐵磁顆粒的晶格結(jié)構(gòu). 圖2（D）為在弱酸性條件下測(cè)定的3種磁性顆粒表面的電性. MagTEOS由于表面的多羥基使Zeta電位為負(fù)值， 與之對(duì)比， MagMPTS由于表面修飾了大量巰基基團(tuán)， 表面電負(fù)性增強(qiáng)， 而MagBVP表面修飾了可與巰基結(jié)合的乙烯砜， 材料表面電負(fù)性進(jìn)一步增強(qiáng)， 驗(yàn)證了材料的吸附機(jī)理.

Fig.1　SEM images of MagTEOS(A), MagMPTS(B) and MagBVP(C)

Scheme 1Synthetic route of MagBVP(A) and workflow of palmitoylated peptides enrichment by MagBVP(B)

2.2　MagBVP對(duì)棕櫚酰化肽的富集能力

采用胰蛋白酶酶解的20 pmol BSA酶解產(chǎn)物與合成的棕櫚?；牡幕旌先芤鹤鳛闃?biāo)準(zhǔn)樣品， 考察了MagBVP對(duì)棕櫚?；牡母患芰? 由于MagBVP選擇性識(shí)別巰基的行為依賴于中性的pH環(huán)境， 因此對(duì)樣品溶液的pH條件進(jìn)行了優(yōu)化. 考察了不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L， pH= 4.5～10.5）的影響， 結(jié)果表明， 當(dāng)pH=6.5時(shí)， 質(zhì)譜所檢測(cè)到的棕櫚?；呢S度最高； 而在pH=4.5～5或9.5～10.5范圍內(nèi)， 幾乎未檢測(cè)到棕櫚酰化肽［圖3（A）］. 最終， 確定Tris-HCl（50 mmol/L， pH=6.5）為最佳的樣品緩沖溶液. 通過(guò)紫外光譜法計(jì)算了MagBVP與棕櫚?；闹g的結(jié)合能， 得到飽和結(jié)合能為117.9 mg/g［圖3（B）］. 最后， 通過(guò)分子對(duì)接計(jì)算模擬出乙烯砜基與棕櫚?；牡慕Y(jié)合位點(diǎn)［25］［圖3（C）］. 以上結(jié)果均說(shuō)明， MagBVP對(duì)棕櫚?；木哂休^好的捕獲能力， 可以用于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的分析.

Fig.3　Effects of pH on the enrichment capacity of palmitoylcoA?palm by MagBVP(A), saturated adsorption isotherms for palmitoylcoA?palm at pH 6.5(B), and affinity and binding sites between the active sites in MagBVP and palmitoylcoA?palm(treated with NH2OH)(C)

隨后， 測(cè)定了MagBVP對(duì)棕櫚?；牡母患芰Γ?與MALDI-MS聯(lián)用， 同樣采用胰蛋白酶酶解的20 pmol BSA酶解產(chǎn)物與合成的棕櫚?；牡幕旌先芤鹤鳛闃?biāo)準(zhǔn)樣品. 如圖4所示， 未經(jīng)富集的質(zhì)譜圖中沒(méi)有目標(biāo)待測(cè)物的信號(hào)峰［圖4（A）］， 且背景信號(hào)峰干擾明顯； 而經(jīng)過(guò)MagBVP富集后， 質(zhì)譜圖中出現(xiàn)明顯的棕櫚酰化肽信號(hào)峰［1005.9， 如圖4（B）］， 且背景信號(hào)峰干擾極小. 在相同的實(shí)驗(yàn)條件下， 用未經(jīng)BVP修飾的MagTEOS和MagMPTS分別對(duì)棕櫚?；臉悠愤M(jìn)行了富集. 如圖4（C）和（D）所示， 經(jīng)MagTEOS和MagMPTS富集后的質(zhì)譜圖中未出現(xiàn)目標(biāo)待測(cè)物的信號(hào)峰. 綜上所述， 經(jīng)BVP修飾的磁性顆粒具有較強(qiáng)的捕獲棕櫚?；牡哪芰?

Fig.4　MALDI mass spectra of BSA tryptic digest and palmitoylcoA?palm mixture before(A) and after enrichment by MagBVP(B), MagTEOS(C) and MagMPTS(D)

（A） BSA： palmitoylcoA-palm molar ratio is 100∶1； （B） palmitoylated peptides are marked.

考察了基于MagBVP的MSPE-MS方法的靈敏度， 配制濃度分別為1.0～5.0 fmol/μL的棕櫚?；臉?biāo)準(zhǔn)溶液并經(jīng)羥胺處理， 分別經(jīng)MagBVP富集后再用質(zhì)譜檢測(cè). 圖5（A）～（C）結(jié)果表明， 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)肽段溶液的濃度<1.0 fmol/μL時(shí)， 在質(zhì)譜圖中觀察不到該目標(biāo)肽段的信號(hào)峰， 而當(dāng)濃度≥1.0 fmol/μL時(shí)， 質(zhì)譜圖中存在目標(biāo)肽段信號(hào)峰， 且 S/N>3. 由此測(cè)得本方法的最低檢出限（LOD）為1.0 fmol/μL. 考察了基于MagBVP的MSPE-MS方法的穩(wěn)定性， 制備的MagBVP經(jīng)7次循環(huán)使用后質(zhì)譜圖中信號(hào)豐度并未明顯下降［圖6（A）和（B）］. 隨后， 考察了基于MagBVP的MSPE-MS方法對(duì)棕櫚酰化肽的選擇性， 將BSA的酶解產(chǎn)物與合成的棕櫚酰化肽段按摩爾比2000∶1混合作為復(fù)雜樣品. 結(jié)果表明， 在未經(jīng)任何富集的質(zhì)譜譜圖中未觀察到棕櫚?；牡男盘?hào)［圖6（C）］； 在經(jīng) MagBVP富集后的質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)明顯的棕櫚?；牡男盘?hào)［圖6（D）］， 而非棕櫚?；牡男盘?hào)被抑制， 說(shuō)明MagBVP適用于捕獲復(fù)雜樣品中棕櫚?；?， 后續(xù)可以考慮將MagBVP用于實(shí)際樣品分析應(yīng)用中.

Fig.6　MALDI mass spectra of tryptic digest mixtures of BSA and palmitoylcoA?palm after enrichment by MagBVP

（A） For the first time； （B） after 7 cycles； （C） before and （D） after enrichment by MagBVP. Palmitoylated peptides are marked. （A， B） BSA： palmitoylcoA-palm molar ratio was 100∶1； （C， D） BSA： palmitoylcoA-palm molar ratio was 2000∶1.

Fig.5　MALDI mass spectra of tryptic digest mixtures of palmitoylcoA?palm and BSA after enrichment by MagBVP

（A） 5.0 fmol/μL； （B） 2.5 fmol/μL； （C） 1.0 fmol/μL. Palmitoylated peptides are marked.

2.3　實(shí)際樣品的分析

基于MagBVP的MSPE-MS方法對(duì)復(fù)雜樣品的富集效果評(píng)價(jià)了所建立的方法實(shí)際應(yīng)用的可行性. 選取AML12細(xì)胞裂解液（=3）作為實(shí)際樣品， 在最優(yōu)化的富集條件下對(duì)8 μL細(xì)胞裂解液樣品進(jìn)行檢測(cè)， 經(jīng)分析得出其中含有260種棕櫚?；鞍祝蹐D7（A）與表S1， 見(jiàn)本文支持信息］. 對(duì)實(shí)際樣品中的棕櫚?；鞍走M(jìn)行GO功能注釋及富集分析［圖7（B）］［26］， 結(jié)果表明， 所鑒定的棕櫚酰蛋白主要富集于細(xì)胞質(zhì)中， 并通過(guò)與各種分子結(jié)合參與脂質(zhì)代謝過(guò)程.

Fig.7　Venn’s diagrams of the identified palmitoylated peptides(n=3)(A) and GO analysis results of identified palmitoylated proteins categorized by biological process, cellular component, and molecular function(B)

a. Lipid metabolic process； b. positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter； c. negative regulation of apoptotic process； d. spermatogenesis； e. response to drug； f. fatty acid metabolic process； g. cytoplasm； h. membrane； i. cytosol； j. nucleoplasm； k. mitochondrion； l. intracellular membrane-bounded organelle； m. protein binding； n. metal ion binding； o. nucleotide binding； p. ATP binding； q. identical protein binding； r. oxidoreductase activity.

3 結(jié) 論

制備了乙烯砜修飾的磁性納米顆粒吸附劑， 通過(guò)SEM， FTIR， VSM及XRD表征了材料的結(jié)構(gòu)與性能. 制備的MagBVP具有良好的分散性和均勻的顆粒結(jié)構(gòu)， 晶型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定， 磁感應(yīng)性強(qiáng)， 飽和磁化強(qiáng)度為53.9 A·m2·kg?1. MagBVP表面枝接的雙（乙烯砜基）丙醇化合物可提供大量的乙烯砜， 在中性pH條件下能夠快速高效地與巰基發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)， 適用于識(shí)別經(jīng)羥胺處理過(guò)的表面巰基暴露的棕櫚?；? 乙烯砜副反應(yīng)少， 通過(guò)簡(jiǎn)單地控制溶液pH條件即可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)專(zhuān)一的對(duì)巰基的識(shí)別. 將MagBVP用于MSPE前處理技術(shù)， 以棕櫚?；M肽段作為標(biāo)準(zhǔn)樣品， 結(jié)合MALDI-TOF MS平臺(tái)， 證明了方法用于棕櫚?；牡姆治鲂阅? 結(jié)果表明， 該方法具有較高的靈敏度（檢出限低至1.0 fmol/μL）和較好的選擇性［（BSA酶解產(chǎn)物）∶（棕櫚?；模?2000∶1］. 以上結(jié)果均表明， 所構(gòu)建的基于MagBVP和MSPE-MS的聯(lián)用方法在棕櫚?；牡姆治鰴z測(cè)方面具有良好的可行性. 最后， 將所建立的平臺(tái)用于小鼠肝臟細(xì)胞裂解液中棕櫚?；牡蔫b定， 共鑒定出260種棕櫚?；鞍?， 證明該方法可用于復(fù)雜實(shí)際生物樣品的分析檢測(cè)， 為日后將該方法用于臨床樣品分析提供了理論基礎(chǔ)， 同時(shí)為蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾的鑒定提供了新方法.

支持信息見(jiàn)http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20230239.

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Vinyl Sulfone Functionalized Magnetic Nanoparticles and Its Application in Palmitoylated Peptides Enrichment

ZHENGHaijiao， XUWenhui， JIAQiong*

（，，130012，）

Vinyl sulfone modified magnetic nanoparticles（denoted as MagBVP） were synthesized and used as the magnetic carrier of magnetic solid phase extraction（MSPE） platform， combined with MALDI-TOF MS or LC-MS/MS. The MagBVP was characterized by means of vibrating sample magnetometer， field emission scanning electron microscopy， infrared spectroscopy， zeta potential measurement and X-ray diffraction. The synthesized palmitoylated palmitoyl-coA was selected as the modeling palmitoylated peptide sample. Under the optimal conditions， the MSPE-MS platform could achieve high selectivity（BSA tryptic digests/palmitoylated peptide molar ratio of 2000∶1） and sensitivity（the detection limit was determined to be as low as 1.0 fmol/μL） for palmitoylated peptide. Finally， the method was applied to the determination of palmitoylated peptides in cell lysates samples. These results showed that the magnetic material modified by vinyl sulfone had a high selectivity for palmitoylomics.

Sulfone， Magnetic nanoparticle； Magnetic solid phase extraction； Palmitoylomics； Mass spectrometry

2023-05-18

賈 瓊, 女, 博士, 教授, 主要從事復(fù)雜樣品分離分析研究. E-mail: jiaqiong@jlu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 22004045)資助.

O652.6； O657.6

A

10.7503/cjcu20230239

2023-07-11.

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.22004045).

（Ed.： N， K）