王東光，郭淑紅，徐大平，張寧南

（1.惠州學(xué)院，廣東 惠州 516007；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520）

土沉香Aquilariasinensis(Lour.) Spreng.，為瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria木本植物。不同地域的土沉香有香材（海南）、白木香（廣東等地）、女兒香（廣東）、莞香（廣東）等別稱[1]，《名醫(yī)別錄》謂之沉香。健康生長的沉香樹體不會結(jié)香，雷電侵襲、人類干擾或昆蟲啃食等條件附加于沉香樹體后，樹體發(fā)生抗逆反應(yīng)，或有內(nèi)生真菌參與其次生代謝反應(yīng)，就可能形成富含倍半萜、色酮、酚類等化合物的油性樹脂，含有樹脂的木片或木塊密度可達(dá)1.028 g·cm-3，可沉水，所以稱之為沉香[2]。無論老幼沉香樹木若未受脅迫發(fā)生抗逆反應(yīng)，其木質(zhì)部橫截面均呈均勻的黃白色，沒有明顯的心材和邊材的分界線[3]。只有受傷的樹體，其木質(zhì)部才可能有顏色深淺不一的斑塊狀或條帶狀分布，其中變色部位中未腐爛的部分富含沉香物質(zhì)，這與其木質(zhì)部中島形的內(nèi)涵韌皮部的分布直接相關(guān)[4]，這也使得測定結(jié)香面積成為難題。近年來，野生沉香資源已接近枯竭，沉香屬全部樹種現(xiàn)已被《野生動植物國際貿(mào)易公約》（CITESⅡ)列為瀕危物種[5]。天然沉香資源的匱乏，促進(jìn)了人工培育沉香樹結(jié)香方法的發(fā)展，人工促進(jìn)沉香樹結(jié)香具有較高的效率，人工促進(jìn)1 a后就可以獲得較高質(zhì)量的沉香[6]。

人工促進(jìn)沉香樹結(jié)香的技術(shù)已經(jīng)有了較大發(fā)展，但傳統(tǒng)的人工造香技術(shù)所需結(jié)香周期長，新興技術(shù)包括化學(xué)試劑法和生物誘導(dǎo)法等產(chǎn)生的沉香安全性備受質(zhì)疑，且沉香結(jié)香量的測定非常困難，都制約了人工促進(jìn)沉香結(jié)香技術(shù)的發(fā)展[7]。近年來，沉香市場的需求量急劇增長，土沉香種植面積急速增加，截至2020年，僅在廣東惠州土沉香樹種植面積已超6 000 hm2，如何高效促進(jìn)土沉香結(jié)香且有效地測定或評價結(jié)香已迫在眉睫。沉香是沉香樹受脅迫和抵御脅迫產(chǎn)生的抗逆性物質(zhì)[8]。植物環(huán)境脅迫包括生物和非生物兩種，其中非生物脅迫包括鹽脅迫[9]、水分脅迫和低溫脅迫等，生物脅迫包括真菌等微生物侵染和動物啃食等[10]。植物激素在植物體內(nèi)的水平，通過影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑制約抗逆反應(yīng)的發(fā)生[11]。眾多研究表明，茉莉酸甲酯[12]、乙烯利[13]等植物生長調(diào)節(jié)劑和植物激素、氯化鈉等無機(jī)鹽[14]以及木霉屬Trichodermasp.[15]、鐮刀菌屬Fusariumsp.、青霉屬Penicilliumsp.和毛殼屬Chaetomiumsp.等屬[16]的真菌均可以誘導(dǎo)沉香結(jié)香。受到生物或非生物脅迫的植物，可能會“故意”減緩生長，而且這種反應(yīng)通常是系統(tǒng)性的[17]，未見沉香樹生長和防御權(quán)衡的研究報(bào)道。

本研究分別以植物生長調(diào)節(jié)劑、無機(jī)鹽和真菌為促進(jìn)劑，對沉香結(jié)香過程中樹體生長的變化進(jìn)行研究，探索無損型熒光光譜成像技術(shù)測定結(jié)香數(shù)量的有效性，綜合生長量、醇溶性浸出物含量和結(jié)香數(shù)量（結(jié)香長度和最大結(jié)香面積）等指標(biāo)首次進(jìn)行土沉香生長和防御相關(guān)性分析，采用主成分得分法評價土沉香生長和結(jié)香的平衡關(guān)系，以期為人工高效促進(jìn)土沉香結(jié)香提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于廣東省東部惠東縣橫瑤村（116°06′00″E，24°15′54″N），海拔96 m，處于南亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫約為21.9 ℃，年降水天數(shù)約為109 d，年均降水量為1 356 mm，年輻射量約為58.9 kWh/m2，年相對濕度約為80%，年蒸發(fā)量約為1 875 mm，常年基本無霜，土壤為山地紅壤。

2 研究方法

2.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

本研究設(shè)置了植物生長調(diào)節(jié)劑處理組（T1）、無機(jī)鹽脅迫處理組（T2）和真菌菌液（T3）共3個處理組，每個處理組內(nèi)包含4個處理。其中植物生長調(diào)節(jié)劑濃度極低，無機(jī)鹽亦采用低濃度且Fe和Na等均為人體所需的微量金屬元素，真菌為結(jié)香樹體所分離的非致病菌，其安全性有保障。不同處理組中，T1處理組為茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA)、6-芐氨基嘌呤（6-BA）和乙烯利（ETH）等植物生長調(diào)節(jié)劑混合制劑，T2為氯化鈉（NaCl）、氯化亞鐵（FeCl2）和亞硫酸氫鈉（NaHSO3）等無機(jī)鹽混合物，T3為真菌菌液（濃度及其他指標(biāo)見表1）。T1和T2各處理中化合物種類及水平根據(jù)前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)確定[18]。真菌菌種在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)完成后，用細(xì)紗網(wǎng)過濾后得到菌液。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組方法選取胸徑約為10 cm的土沉香樹（8年生樹，處理前生長特性等指標(biāo)無差異），設(shè)3個區(qū)組，每個區(qū)組包含12個處理和1個對照，每個處理每個區(qū)組重復(fù)6株。

表1 不同處理土沉香樹生長量差異?Table 1 The increment of the A.sinensis trees under different treatments

于2018年12月對樹體進(jìn)行最后一次處理。將上述溶液或菌液200 mL，裝入液體滴注裝置注入樹體，利用樹體蒸騰作用，使結(jié)香劑隨樹液流動，侵染或脅迫整株樹[19]，具體方法參見前期研究[18]，設(shè)置蒸餾水注射液為對照組（表1）。

2.2 測定指標(biāo)和方法

2020年10月（即結(jié)香時長為1年8個月）進(jìn)行取樣調(diào)查，生長量即為處理前后樹高、胸徑（距地面1.3 m處樹體直徑）和冠幅的增量。在每個區(qū)組中選取一個處理的3次重復(fù)樣本株，將其伐倒，分段帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行醇溶性浸出物含量和結(jié)香面積、長度等指標(biāo)的測定。

先切削截取圓盤的白木部分，再用鉤刀剔除腐木部分，剩余的結(jié)香木料用于醇溶性浸出物的提取。醇溶性浸出物提取采用有機(jī)溶劑（95%乙醇）萃取法，旋轉(zhuǎn)蒸干后測定其含量[18]。結(jié)香面積測定前，先將結(jié)香樹干沿徑向進(jìn)行樹干解析，每個樹木圓盤的厚度為5 cm，直至橫截面完全為白木為止。采用熒光光譜成像技術(shù)測定樹木圓盤結(jié)香面積[19]，掃描得到樣品的光譜立方體后進(jìn)行判別分析，測得白木、結(jié)香層、腐木和背景的面積[20]。具體測定過程為：先用紫外燈照射待測的木塊，將光學(xué)濾片設(shè)置在CCD（電荷耦合元件）相機(jī)和樣品之間，使樣品的激發(fā)光通過濾片成像于相機(jī)上，從而獲得一組光譜立方體。通過之前已經(jīng)獲得的白木、腐木和結(jié)香層的光譜曲線從光譜立方體中確定白木和腐木的部位，再通過對白木和腐木面積取交叉互補(bǔ)集得到沉香的邊緣，采用數(shù)字圖像填充內(nèi)部和外部邊緣之間的區(qū)域，最終測算得沉香的面積。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，均值多重比較采用Duncan法進(jìn)行檢驗(yàn)，采用邁維云平臺高級相關(guān)性聚類熱圖法進(jìn)行相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同處理對土沉香生長的影響

不同處理對土沉香胸徑生長有顯著影響，對樹高和冠幅生長影響不顯著（表1）。不同處理組中，胸徑增長量最小的處理分別為T1處理組的MeJA、ABA、6-BA和ETH為0.05、0.5、0.01和0.01 mg·g-1（4號處理）、T2處理組的3、10和20 mg·g-1（8號處理）以及T3處理組的龍眼焦腐病菌真菌菌液（12號處理），處理末期胸徑增量分別為對照的0.51、0.49和0.47倍。各處理組中，胸徑增量最大的處理分別為3、7和11號處理，為對照的60.2%、61.9%和63.6%。進(jìn)一步分析可得，T1處理組中土沉香樹胸徑增量最小時乙烯利和脫落酸濃度之和高于茉莉酸甲酯和6-芐氨基嘌呤之和，而T2處理組中則為鹽總濃度最高時（33 mg·g-1），土沉香胸徑生長最可能受影響。反之，當(dāng)脫落酸和乙烯利濃度之和低于茉莉酸甲酯和6-芐氨基嘌呤時，土沉香胸徑生長較同組其他處理快。無機(jī)鹽處理組中，總鹽濃度次高時（31 mg·g-1），樹體胸徑生長最快，此時酸性鹽（NaHSO3）濃度降低了一半。所有處理中對土沉香樹高影響最小的是葡萄座腔菌菌液處理，而對樹高生長影響大的是腐皮鐮孢菌液處理，但均未達(dá)顯著水平，且分別可達(dá)對照的76.3%和62.5%。各處理對土沉香冠幅生長無顯著影響，對照冠幅增量僅為最低的2號處理的1.13倍。

3.2 不同處理對土沉香醇溶性浸出物含量的影響

醇溶性浸出物的含量是衡量沉香品質(zhì)的重要指標(biāo)，《中國藥典2020版》及之前各版本藥典中的沉香入藥標(biāo)準(zhǔn)均為醇溶性浸出物的含量不低于10%。不同處理對土沉香醇溶性浸出物含量有顯著影響，各處理醇溶性浸出物含量均顯著高于對照（圖1）。其中，醇溶性浸出物含量最高的處理為6號處理（NaCl、FeCl2和NaHSO3濃度為1、2.5和5 mg·g-1），醇溶性浸出物含量為13.61%，而對照醇溶性浸出物含量最低，僅為2.00%。各處理醇溶性浸出物含量分別為對照的4.26、5.28、4.76、4.10、4.10、6.81、1.95、3.80、5.72、6.37、5.61和1.51倍。其中2號、6號、9號、10號和11號處理均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)的10%[21]，其中各處理中尤以真菌菌液處理組的處理數(shù)量最多，為3個，而其他2個處理組均只有1個。各處理組中，T1處理組中2號處理最高，顯著高于同組中其他處理，其脫落酸和乙烯利的含量均最高，說明土沉香醇溶性浸出物的產(chǎn)生與兩者關(guān)系更密切。T2處理組中，6號處理顯著高于其他3個處理，7號處理顯著低于其他3個處理，而處于中間的2個處理（5和8號）醇溶性浸出物含量無顯著差異，這可能與6號處理中總鹽濃度最低有關(guān)，而5號和8號處理中的NaCl濃度相同且FeCl2濃度也高于6號處理，說明氯離子的濃度高時不利于沉香醇溶性浸出物或者沉香物質(zhì)的形成。真菌菌液處理組中黑綠木霉、腐皮鐮孢和葡萄座腔菌3種菌種處理均能有效提高沉香醇溶性浸出物的含量，三者之間無顯著差異且均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，說明內(nèi)生真菌生物誘導(dǎo)更有利于土沉香結(jié)香。

圖1 不同處理土沉香結(jié)香部位所提醇溶性浸出物含量Fig.1 Contents of alcohol-soluble extractives extracted from agarwood under different treatments

3.3 不同處理對土沉香最大結(jié)香長度和面積的影響

各處理在土沉香樹體徑向方向擴(kuò)展量也不盡相同（表2），其中尤以6號處理擴(kuò)展長度最長，可達(dá)75 cm，且為最短處理組（5號）的3倍。各處理組中，4號處理在植物生長調(diào)節(jié)劑處理組中擴(kuò)展長度最長，與生長量數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，4號處理胸徑生長量最低，這說明沉香結(jié)香生長受抑制，次生代謝增強(qiáng)的抵抗脅迫的過程。無機(jī)鹽處理組中6號最長，說明較低濃度鹽更有利于土沉香物質(zhì)徑向擴(kuò)展。而真菌菌液處理組中，腐皮鐮孢處理最長，但擴(kuò)散最長處理組僅為最短組的1.6倍，且4個處理擴(kuò)散長度均超過40 cm，說明真菌處理組促進(jìn)結(jié)香效果較好。

表2 不同處理土沉香結(jié)香長度Table 2 The length of agarwood formation under different treatments

沉香樹結(jié)香后通常包含未結(jié)香的白木、腐木和結(jié)香層，其中后兩者的邊界難以確定，通過人工方法無法精確測量結(jié)香層的面積，采用熒光光譜成像技術(shù)無損地測定土沉香結(jié)香面積，可以精確、無損、快速地測定沉香結(jié)香面積（圖2）。最大結(jié)香面積是指同一株土沉香所有截取圓盤中上、下兩面變色面積最大的一面所測得的面積。由圖3可知，6號處理土沉香最大結(jié)香面積是所有處理中最大的，可達(dá)199.26 mm2，而對照最小，其樹干橫截面未變色（0 mm2），其次為10、11、8、9、1、4、12、2、3、7和5號處理。各處理之間差異及變化趨勢與沉香醇溶性浸出物含量相似。6號處理土沉香結(jié)香面積最大，此處理鹽總濃度是4個無機(jī)鹽處理組中第2低的濃度，說明低濃度（約為1.5 mg·g-1）的無機(jī)鹽更有利于土沉香結(jié)香。

圖2 各處理中最大結(jié)香面的土沉香木片光譜Fig.2 The spectral image of the maximum agarwood area of A.sinensis trees wood chips in each treatments

圖3 不同處理土沉香最大結(jié)香面積Fig.3 The maximum agarwood formation area of the A.sinensis trees under different treatments

3.4 不同處理土沉香生長和結(jié)香指標(biāo)相關(guān)性分析和綜合評價

由圖4可知，不同處理土沉香胸徑、樹高和冠幅等生長量指標(biāo)之間呈正相關(guān)，醇溶性浸出物含量、最大結(jié)香面積和結(jié)香長度等結(jié)香指標(biāo)亦然，而生長指標(biāo)和結(jié)香指標(biāo)之間均呈負(fù)相關(guān)，說明土沉香生長和結(jié)香為生長和防御相權(quán)衡的結(jié)果。由顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知（表3），樹高和胸徑、冠幅之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，且與最大結(jié)香面積和長度顯著負(fù)相關(guān)。最大結(jié)香面積和醇溶性浸出物含量、長度之間呈極顯著正相關(guān)，且與樹高、胸徑呈顯著負(fù)相關(guān)。樹高和最大結(jié)香面積可作為衡量土沉香生長和防御（結(jié)香）的代表性指標(biāo)。

圖4 不同處理土沉香生長和結(jié)香指標(biāo)相關(guān)性Fig.4 Correlation between growth and agarwood formation indexes of A.sinensis trees under different treatments

表3 土沉香生長和結(jié)香指標(biāo)相關(guān)性檢驗(yàn)值?Table 3 Correlation test values of the growth and agarwood formation indexes of A.sinensis trees

采用主成分分析法計(jì)算每個處理土沉香胸徑、樹高、冠幅、醇溶性浸出物含量、最大結(jié)香面積和結(jié)香長度綜合得分，可以有效評價各處理對土沉香生長和結(jié)香的綜合影響。由表4可知，不同處理土沉香生長和結(jié)香綜合表現(xiàn)各異。6號處理得分最高，其后依次為10、8、11、1、4、9、2、12、3、5和7號處理，其中對照（13號）綜合得分最低（-8.66分），這也與其結(jié)香數(shù)量和質(zhì)量均為最低的結(jié)果一致。各處理組中，植物生長調(diào)節(jié)劑處理組中1號處理得分最高（0.51分），這與其適中的生長量和較大的結(jié)香結(jié)香面積和長度有關(guān)。無機(jī)鹽處理組中6號處理得分最高（5.43分），這與其醇溶性浸出物含量、最大結(jié)香面積和擴(kuò)散長度的結(jié)果一致。而真菌處理組中腐皮鐮孢（4.16分）真菌菌液最有利于結(jié)香且對樹體生長影響最小。排名前5位的處理中，包含了2個真菌處理，是所有處理組中最多的。

表4 不同處理土沉香綜合得分Table 4 Comprehensive scores of A.sinensis trees under different treatments

4 討 論

研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑與樹木生長和代謝均有直接關(guān)系。本研究中，3號處理胸徑生長量最大，而此時脫落酸和乙烯利濃度之和高于茉莉酸甲酯和6-芐氨基嘌呤之和，反之則反，這是因?yàn)榍皟烧呤谴龠M(jìn)樹木細(xì)胞抵抗脅迫的，而后兩者與促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化的作用有關(guān)[22]。高鹽脅迫抑制植物生長，本研究中，高鹽濃度處理（8號）在同組中胸徑生長量最小，這是因?yàn)楦啕}脅迫導(dǎo)致土沉香樹干缺水，使得樹干生長量降低[23]。真菌菌液處理組中，葡萄座腔菌菌液處理對白木香胸徑生長影響最小，因?yàn)樵撜婢鸀橥脸料銟潴w內(nèi)生真菌[8]，即使外源施加也不會顯著影響樹體的正常生長。而注入非土沉香樹體內(nèi)生真菌的龍眼焦腐病菌則加速了土沉香樹木質(zhì)部細(xì)胞壁的降解，大大遲滯了土沉香胸徑、樹高和冠幅的生長[24]。

沉香醇溶性浸出物因其含有種類豐富的次生代謝物，可以應(yīng)用于化妝品、生活用品和藥物等多個產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，所以其是一種具有高價值的沉香衍生物[1]。本研究中，當(dāng)乙烯利和脫落酸濃度遠(yuǎn)高于茉莉酸甲酯和6-芐氨基嘌呤時，土沉香樹體結(jié)香部位所提醇溶性浸出物含量最高，這是因?yàn)橐蚁┖兔撀渌峥赡茏鳛樾盘柗肿泳梢杂|發(fā)抗逆脅迫反應(yīng)[25]，產(chǎn)生倍半萜、色酮等沉香的特征成分，這些物質(zhì)都是醇溶性浸出物的主要成分[8]。Zhang等[26]研究表明，火燒孔和冷鉆處理后施加適度的鹽溶液均能有效提高沉香醇溶性浸出物含量，與本研究中6號表現(xiàn)相同。除龍眼焦腐病菌處理外，黑綠木霉[18]、腐皮鐮孢和葡萄座腔菌均可以有效提高土沉香醇溶性浸出物含量，此結(jié)果與其他試驗(yàn)的研究結(jié)果一致[27]。

土沉香有其獨(dú)特的內(nèi)涵韌皮部（或稱“木間韌皮部”）[4]，可能有運(yùn)輸和貯藏初生代謝產(chǎn)物的功能[28]。本研究探索性地應(yīng)用了熒光光譜成像技術(shù)，無損測定了土沉香結(jié)香數(shù)量[20]。結(jié)香長度和最大結(jié)香面積測定結(jié)果一致，說明各種處理在樹體中橫縱向的擴(kuò)散量極大相關(guān)，這是土沉香生長和防御權(quán)衡的有力證明。低濃度酸性鹽和葡萄座腔菌處理結(jié)香面積和長度值均較大，且這些處理下醇溶性浸出物含量也均較高，說明這些處理處于既能誘導(dǎo)土沉香結(jié)香又不影響樹體生長的臨界點(diǎn)附近，這也與通體結(jié)香技術(shù)研究結(jié)果一致[29]。

植物受脅迫時，生長[30]和光合作用[31]相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)、防御蛋白分泌的增加、碳和氮等優(yōu)先用于抗逆物質(zhì)的合成等研究結(jié)果表明，植物營養(yǎng)等物質(zhì)資源從支持生長轉(zhuǎn)向防御脅迫[17]。而本研究中生長和結(jié)香（防御）指標(biāo)負(fù)相關(guān)的分析結(jié)果與上述結(jié)論一致。評價不同指標(biāo)的平衡關(guān)系以及綜合表現(xiàn)，主成分得分法具有獨(dú)特的優(yōu)勢。本研究抽取2個主成分，貢獻(xiàn)率超過84%，有效地評價了不同處理土沉香生長和結(jié)香的綜合表現(xiàn)。

本試驗(yàn)分類研究了不同處理對土沉香生長和結(jié)香的影響，不同種類、濃度植物生長調(diào)節(jié)劑和無機(jī)鹽混合物以及不同種類真菌的復(fù)合劑對土沉香生長和結(jié)香的影響機(jī)制還沒有深入研究。研究表明，在真菌菌液中加入適量的酸性鹽（NaHSO3等）和植物生長調(diào)節(jié)劑（脫落酸、6芐基嘌呤等），可能會更高效地促進(jìn)土沉香結(jié)香[18]，但是否能保證樹體的高效生長是下一步研究的內(nèi)容。此外，土沉香結(jié)香過程中，樹體生長和防御的權(quán)衡機(jī)制也應(yīng)該是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

5 結(jié) 論

12種處理對土沉香胸徑生長影響顯著，對樹高、冠幅的影響未達(dá)顯著水平，且各處理均能有效提高土沉香醇溶性浸出物含量和結(jié)香面積、長度。利用加權(quán)系數(shù)的主成分得分法計(jì)算可得，NaCl、FeCl2、NaHSO3質(zhì)量濃度為1、2.5和5（總濃度8.5）mg·g-1，植物生長調(diào)節(jié)劑MeJA、ABA、6-BA、ETH質(zhì)量濃度為0.01、0.05和0.5 mg·g-1時和腐皮鐮孢處理是各處理組中最能有效平衡土沉香生長和結(jié)香的處理。綜上所述，人工誘導(dǎo)土沉香結(jié)香的技術(shù)可以促進(jìn)樹體結(jié)香，但會減緩樹體的生長，所以結(jié)香是樹體生長和防御相互權(quán)衡的結(jié)果。