徐偉玲 綜述,于少飛審校

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古呼和浩特 010000;2.內(nèi)蒙古內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院兒科,內(nèi)蒙古呼和浩特 010000

病原靶向二代測序(tNGS)是使用特異性探針或引物捕獲特定DNA,通過高通量測序技術(shù)對這些DNA片段進行測序,實現(xiàn)對病原體的鑒定,與全基因組測序(WGS)、宏基因NGS(mNGS)比較,其可減少無關(guān)序列的測序,提高對靶向區(qū)域的覆蓋度和深度,對下呼吸道感染(LRTI)病原體的診斷具有較高應(yīng)用價值,既能鑒定病原體,又能區(qū)分病原體亞型、檢測耐藥和毒力基因,成本大幅縮減,具有高效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟、可精準(zhǔn)分型等優(yōu)點。本文簡要回顧了目前為止關(guān)于tNGS在LRTI病原體鑒定中的應(yīng)用價值。

1 tNGS概況

tNGS是基于多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和二代測序技術(shù)的新型病原微生物檢測方法,主要分為兩種,即基于引物PCR擴增的擴增子測序和基于探針雜交的雜交捕獲測序。多重PCR擴增子測序常用于富集基因組較小的病毒基因組,只在一定程度上檢出病毒變異的類型,很難滿足不斷變異的病毒分型;而雜交捕獲測序中探針與隨機斷裂的片段雜交,捕獲到的序列不限于探針本身所對應(yīng)的區(qū)域,相鄰探針互相補充,對病毒的多態(tài)性具有更高的寬容度,不僅可以顯著富集病毒序列提升病毒基因組覆蓋,而且可在一定范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)新病毒。mNGS和tNGS最大的區(qū)別在于測序前的PCR擴增是否是特異的,tNGS為特異的,mNGS為非特異的。DAI等[1]動態(tài)隨訪100例早產(chǎn)兒,比較常規(guī)培養(yǎng)和tNGS對LRTI患者標(biāo)本病原體的鑒定發(fā)現(xiàn),tNGS與常規(guī)培養(yǎng)有90.9%的完全或部分一致性,檢出率提高了105.9%。LI等[2]采用tNGS技術(shù),對102例成人肺炎患者同時行mNGS和tNGS,靶標(biāo)僅檢測到153種病原體,但對臨床上常見呼吸道感染病原體的覆蓋率高達95%以上,結(jié)果顯示,tNGS和mNGS總體微生物檢出率分別為82.17%和86.51%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但過程中tNGS的成本僅為mNGS的1/4,可見tNGS在呼吸道感染性疾病病原體鑒定中具有出色的表現(xiàn)及較高的性價比。GASTON等[3]對mNGS和tNGS從肺泡灌洗液(BALF)中檢測呼吸道病原體的工作流程進行了評估,分析檢測的準(zhǔn)確度及可重復(fù)性,結(jié)果顯示,tNGS工作流程總體準(zhǔn)確度為65.6%,陽性預(yù)測值為45.9%,陰性預(yù)測值為85.7%;mNGS工作流程的總體準(zhǔn)確度為67.1%,陽性預(yù)測值為56.6%,陰性預(yù)測值為77.2%,總體來說mNGS和tNGS對細菌、真菌和病毒的檢測范圍相當(dāng),在各自的檢測限內(nèi),重現(xiàn)率為100.0%。目前,tNGS已成為呼吸道感染病原體診斷的研究熱點,也可應(yīng)用于其他系統(tǒng)感染,如中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[4-5]、關(guān)節(jié)感染[6]等。

2 tNGS在LRTI不同病原體診斷中的應(yīng)用價值

2.1細菌 呼吸道細菌感染的病原菌以G+球菌為主,以金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌常見。LRTI病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為細菌培養(yǎng)和涂片鏡檢,培養(yǎng)所需時間較長,且敏感性有限。tNGS 為LRTI病原體診斷提供了新方法。有學(xué)者利用tNGS對西藏高原地區(qū)社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的病原學(xué)分布特征進行研究,發(fā)現(xiàn)G+球菌中檢出率最多的是肺炎鏈球菌,G-桿菌中檢出最多的為嗜血桿菌屬[7]。鄭凱文等[8]自主設(shè)計了40對特異性引物,聯(lián)合多重 PCR與二代高通量測序?qū)崿F(xiàn)了對肺炎克雷伯菌、化膿性鏈球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌等20 種LRTI常見病原體的高通量、快速檢測,至少覆蓋了臨床上90%的下呼吸道病原體,結(jié)果顯示,tNGS檢出率明顯高于常規(guī)培養(yǎng)法,靈敏度達100%,標(biāo)本周轉(zhuǎn)時間(TAT)比常規(guī)培養(yǎng)法明顯縮短,由此可見,tNGS可以在不損失靈敏度情況下快速明確病原體,對呼吸道感染病原體早期鑒定有較高的應(yīng)用價值。另有研究采用高通量靶向擴增子測序(TAS)對重癥CAP患兒行BALF病原體檢測,結(jié)果與常規(guī)檢查、多重PCR比較,TAS的靈敏度和特異度均較高,檢測BALF中細菌和病毒具有較好的效果[9]。有研究利用tNGS從1例患者的腦脊液中檢出皮特不動桿菌,此前各項常規(guī)檢查均為陰性,根據(jù)tNGS檢測結(jié)果給予針對性治療后,患者病情好轉(zhuǎn)。由此說明,tNGS可能是一種很好的病原體檢測技術(shù),有利于精準(zhǔn)診療的臨床實施[4]。綜上所述,在鑒定下呼吸道細菌感染中tNGS明顯優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)法,對絕大多數(shù)細菌(除外新型、罕見菌)的檢測能力與mNGS相當(dāng),并且可明顯縮短TAT。此外,tNGS單個標(biāo)本庫所需數(shù)據(jù)量遠遠低于mNGS,大大提高檢測吞吐量,降低測序成本[4]。然而,tNGS也有不足之處,有研究表明,tNGS在LRTI細菌檢測中,陽性預(yù)測值在檢測限介于103～104CFU/mL時降低,從而阻止了低豐度生物體的檢測,認為tNGS不能可靠地從臨床標(biāo)本中檢測出≤103CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)中定量的細菌[3]。此外,tNGS目前缺乏解釋結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn),不能用于確定病原體的診斷,只能作為篩查的輔助方法[6];檢測過程中所使用的生物信息學(xué)方法和數(shù)據(jù)庫也會對結(jié)果產(chǎn)生直接影響[3]。

2.2病毒 根據(jù)中國CAP研究數(shù)據(jù)顯示,近年來,CAP病原學(xué)特征發(fā)生改變,病毒性肺炎檢出率明顯增加,細菌性肺炎檢出率降低。LRTI病原體往往復(fù)雜多樣,病毒缺乏普遍保守的標(biāo)記,易突變,即使是單點突變,也會在宿主范圍、傳播性和致病性方面有所不同。因此,理想的病毒診斷平臺應(yīng)該對所有病毒及其變體進行敏感的多路檢測?，F(xiàn)階段病毒診斷通?；卺槍σ环N或幾種特定試劑的PCR,可能無法檢測到病毒變異,只能提供有限的基因型信息。目前病毒靶向測序大多采取雜交捕獲測序。一種基于tNGS的高通量病毒靶向檢測和診斷技術(shù)(ViroCap)解決了目前PCR和高通量測序診斷、分析病毒組的諸多挑戰(zhàn)。ViroCap使用一組具有高特異度的DNA探針捕獲病毒基因組序列,然后進行高通量測序,通過比對已知病毒基因組數(shù)據(jù)庫鑒定檢測到的病毒,具有高度的靈敏度和特異度,可在短時間內(nèi)檢測出多種病毒,提供更全面的病毒診斷和監(jiān)測信息,在病毒診斷、發(fā)病機制研究、流行病學(xué)調(diào)查等方面有廣泛的應(yīng)用前景,可幫助科學(xué)家更好地了解病毒的種類、分布和傳播途徑,從而制訂針對性的防控措施。目前已有多個研究使用ViroCap進行病毒檢測。不同于mNGS技術(shù),DNA和RNA檢測流程需分開進行,tNGS可實現(xiàn)DNA和RNA共檢。LI等[2]的研究中tNGS就檢出了鼻病毒A、B、C,而mNGS未檢測出,因為鼻病毒為RNA病毒,而研究中mNGS只進行了DNA過程,但mNGS在33例患者中檢出人皰疹病毒,而tNGS未檢測到。有研究指出,mNGS雖檢出較多人皰疹病毒,但多數(shù)患者未予治療病情好轉(zhuǎn),考慮定植可能性大[7]。WYLIE等[10]在研究中比較了ViroCap和宏基因鳥槍測序檢測病毒的效能,發(fā)現(xiàn)捕獲富集后,基因組代表性顯著增強,病毒序列讀數(shù)百分比的中位數(shù)和中位覆蓋寬度明顯增加,且除檢測到所有預(yù)期的病毒外,還檢測到30個額外的病毒,其中大多數(shù)是臨床實驗室沒有檢測的病毒,或來自標(biāo)本上沒有被要求檢測的病毒。由此可見,病毒捕獲測序不僅可以檢出病毒,還可以在一定范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)新病毒。但其也存在局限性,首先,探針捕獲與文庫雜交、測序及分析前的標(biāo)本處理都增加了檢測時間;其次,新病毒基因組可能不會與捕獲探針序列高度不同的病毒基因組富集;最后,若只檢測少量標(biāo)本,捕獲探針的成本可能會讓人望而卻步[10]。ViroCap通過雜交到較大基因組片段中的短保守序列檢測新病毒,降低宿主背景,提高了平均覆蓋率,幾乎獲得了所有病毒的全長序列[11],提供更多關(guān)于病毒遺傳多樣性、基因分型和毒力的信息[12]。tNGS解決了病毒變異的問題,增加病毒基因序列讀數(shù)、覆蓋的廣度及深度,對病毒感染的診斷具有明顯優(yōu)勢,且基因序列可進行病毒分型。

2.3結(jié)核桿菌 有學(xué)者利用靶向DNA富集技術(shù)對43份痰標(biāo)本進行結(jié)核分枝桿菌測序,認為痰測序比痰培養(yǎng)有潛力提供更綜合、快速的耐藥檢測[12]。WU等[13]對上海肺科醫(yī)院130例肺結(jié)核患者的BALF標(biāo)本進行tNGS檢測,結(jié)果顯示,tNGS的檢出率明顯高于抗酸桿菌涂片、培養(yǎng)和免疫檢測,與抗酸桿菌涂片和培養(yǎng)相比,tNGS在涂片陰性和培養(yǎng)陰性病例中檢出率較高,而與結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥檢測比較,則顯示出幾乎相同的靈敏度;以表型藥敏試驗作為參考標(biāo)準(zhǔn),tNGS檢測利福平耐藥性的靈敏度和特異度均為100%,檢測異煙肼耐藥性的靈敏度和特異度分別為80%和100%。由此可見,tNGS可能是一種有前途的工具,可擴大結(jié)核病檢測的技術(shù)儲備。有研究發(fā)現(xiàn),tNGS對不同耐藥譜結(jié)核分枝桿菌的檢測與WGS一致性相當(dāng),優(yōu)于Sanger測序的一致性,tNGS可在耐藥結(jié)核病中全面準(zhǔn)確預(yù)測耐藥性[14]。自WHO指南發(fā)布以來,WGS和tNGS已用于預(yù)測結(jié)核病的耐藥性,特別是tNGS可為靶向耐藥基因提供覆蓋深度大的全長序列信息,對預(yù)測耐藥非常重要[15]。tNGS的優(yōu)勢還在于可區(qū)分結(jié)核和其他抗酸桿菌,抗酸桿菌包括結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)桿菌和其他非結(jié)核分枝桿菌,痰涂片抗酸染色不能區(qū)分上述三者。LI等[2]采用多重PCR靶向測序鑒定10種涉及人類疾病的主要分枝桿菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可特異地識別分枝桿菌物種,且不會發(fā)生交叉反應(yīng),同時檢測某些抗菌藥物耐藥基因型也是可行的。CHAE等[16]在研究中亦正確識別結(jié)核分枝桿菌和5種非結(jié)核分枝桿菌物種,包括M.膿桿菌亞種。tNGS 檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度較高,可提高檢測效能,還可區(qū)分結(jié)核與其他抗酸桿菌,在區(qū)別亞型、檢測耐藥基因方面的優(yōu)勢顯著。

2.4真菌 下呼吸道真菌感染多繼發(fā)于免疫功能紊亂或低下、長期使用抗菌藥物等情況,近年來肺部真菌感染的發(fā)病率及病死率逐年上升,但目前肺部真菌感染的診斷存在一些問題,如耗時長、特異度低、易污染等。姚璐[17]報道了1例經(jīng)DNA靶向測序明確診斷為M.暗色絲孢霉的播散性感染,根據(jù)測序結(jié)果給予針對性抗真菌治療后,患者病情明顯好轉(zhuǎn),查閱文獻發(fā)現(xiàn),報道的9例人類感染M.暗色絲孢霉均為個案報道,其中8例通過基因測序確診,僅1例通過常規(guī)培養(yǎng)確診,可見病原靶向測序可提高檢測的靈敏度。在一項關(guān)于102例成人肺炎的研究中tNGS真菌檢出率為12.56%,mNGS真菌檢出率為13.45%[2]。真菌細胞壁厚,細菌DNA的提取方法應(yīng)用于真菌核酸的提取很有可能會使提取效率降低,且不同真菌DNA檢測方法可能會產(chǎn)生不一樣的結(jié)果,因此,仍需繼續(xù)優(yōu)化相關(guān)配套技術(shù)和條件。鄭凱文[18]選擇屎腸球菌和白色念珠菌兩種厚壁、較難破碎的病原菌為代表進行物理破壁條件的探索,結(jié)果破壁后靶向測序檢出5例屎腸球菌,未檢出白色念珠菌,常規(guī)培養(yǎng)對這兩種菌株均未檢出。由此可見,若改善破壁條件可提升核酸提取率,tNGS對真菌的檢出很可能會優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)法。目前tNGS在呼吸道真菌感染鑒定中的研究較少,未來仍有很大探索空間。

2.5其他非典型病原體 引起LRTI的非典型病原體包括支原體、衣原體和立克次體等。在DUNLAP等[19]的1份病例報告中,1例患者經(jīng)tNGS發(fā)現(xiàn)為肺炎支原體感染,予針對性治療后,病情明顯改善,而此前血培養(yǎng)結(jié)果為壞死梭桿菌,可見下一代測序可早期建立病因診斷指導(dǎo)精準(zhǔn)抗菌藥物管理。肺炎支原體沒有細胞壁,主要定植于呼吸道黏膜表面,正確的采集方法和時機對檢測結(jié)果影響較大。有研究指出,BALF中肺炎支原體的檢出率明顯高于痰標(biāo)本[7]。目前tNGS在肺炎支原體感染中的研究較少,有研究顯示tNGS在肺炎支原體中的檢出率較低[2],但因標(biāo)本來自成人,故不能以偏概全反映靶向測序在肺炎支原體感染中的實際診斷效能。就呼吸道感染的衣原體而言,肺炎衣原體感染的概率并不是很高,近年來鸚鵡熱衣原體感染有增加的趨勢,不應(yīng)再單純檢測肺炎衣原體,而應(yīng)將鸚鵡熱、沙眼衣原體也加入到檢測項目中。目前已有多篇研究探討了mNGS在鸚鵡熱衣原體感染鑒定中的應(yīng)用,均表現(xiàn)出良好的檢測效能[20-21],但尚無tNGS應(yīng)用于衣原體檢測的報道,有待進一步研究。立克次體病在急性期很難進行病因診斷,因確診常需在康復(fù)后再次采血,比較急性期和恢復(fù)期的血清變化。HUANG等[6]報道了1例全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生假體移位和假體周圍骨溶解的病例,通過mNGS和tNGS檢測到貝納柯克斯體,而此前微生物培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。有研究通過分型培養(yǎng)的嗜肺軍團菌驗證了tNGS的實用性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在tNGS中,全部的基因分析得到了與全基因組數(shù)據(jù)分析相同的嗜肺軍團菌株分類,并在隨后直接對患者呼吸道標(biāo)本進行的嗜肺軍團菌靶向檢測中,也可根據(jù)相應(yīng)的培養(yǎng)菌株正確對患者進行分類,由此可見,tNGS有潛力在肺炎軍團菌感染鑒定中發(fā)揮重要作用[22]。目前,tNGS在非典型病原體中的應(yīng)用多集中在個案報道,期待未來有更多的研究體現(xiàn) tNGS 對非典型病原體的診斷價值。

2.6混合感染 LRTI具有病原譜復(fù)雜、多樣,且易混合感染的特點,常規(guī)檢測手段難以在單一標(biāo)本中同時檢出多種病原體,而NGS可在鑒別混合感染中發(fā)揮重要作用。有研究表明,在混合標(biāo)本中病原靶向測序的基因組覆蓋率未受到影響,2份標(biāo)本中兩種病毒的基因組覆蓋率均達到95%～100%[23],TAS和多重PCR檢測在鑒別混合感染方面比常規(guī)培養(yǎng)法有明顯優(yōu)勢[24]。

3 總結(jié)與展望

LRTI是常見且多發(fā)的感染性疾病,也是導(dǎo)致患者病情加重、甚至死亡的重要原因。在靶標(biāo)范圍內(nèi),tNGS與mNGS的檢測效能相當(dāng),而對新型、罕見菌的檢測,mNGS明顯優(yōu)于tNGS。相對于mNGS,tNGS去除了人源基因的影響,靈敏度提升,實現(xiàn)了DNA和RNA共檢,時間和經(jīng)濟成本大幅降低,更重要的是tNGS可在鑒定病原體的同時,區(qū)分病原體的亞型、檢測耐藥性和毒力基因,這些都是臨床應(yīng)用中需要著重考慮的因素。目前,tNGS在非典型病原體感染中的研究較少,有待進一步探索。tNGS的局限性:(1)缺乏統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范的測序流程[3];(2)無法鑒別污染、定植還是活動性感染;(3)沒有解決對真菌、胞內(nèi)菌等檢出率低的問題,相關(guān)配套技術(shù)和條件仍需繼續(xù)優(yōu)化;(4)tNGS只對靶標(biāo)進行擴增測序,雖增加了靈敏度,但勢必會錯過非靶向序列。未來tNGS技術(shù)仍需不斷改善,以提高其在LRTI中的診斷效能,從而更好地滿足臨床應(yīng)用需求。