操禮軍，汪 暉，杜婷婷，劉 莉*，胡永青*

1 新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，新疆烏魯木齊 830000

2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830000

0 引言

在畜牧業(yè)中，胚胎移植技術(shù)已成為動(dòng)物學(xué)家和育種學(xué)家改善畜群遺傳，并迅速增加優(yōu)良畜種的有力工具，目前已廣泛應(yīng)用在遺傳改良、種畜繁育和保種、疾病控制、基因工程研究等方面。具體到牛上，胚胎移植技術(shù)是指將一頭良種母牛配種后的早期胚胎取出，移植到另外一頭或數(shù)頭同種的、生理狀況相同或相似的母牛生殖道的適當(dāng)部位，使之繼續(xù)發(fā)育成新個(gè)體的過(guò)程。該方法提升了遺傳改良并縮短了世代間隔，是一種提高繁殖力的有效方法[1]。

牛胚胎移植技術(shù)涉及供體和受體動(dòng)物的選擇和管理，以及胚胎的收集和移植。在牛中使用胚胎移植的主要目標(biāo)是提高有價(jià)值的雌性的繁殖率。因此，有價(jià)值的雌性的后代數(shù)量增加到至少比正常情況下高出5 倍的水平。胚胎移植被描述為將從供體動(dòng)物的生殖道中獲得的胚胎或在實(shí)驗(yàn)室條件下在體外產(chǎn)生的胚胎移植給一個(gè)或多個(gè)同步受體。體內(nèi)胚胎生產(chǎn)的階段包括供體動(dòng)物和受體動(dòng)物的選擇，所選供體和受體的發(fā)情周期的同步，誘導(dǎo)超排卵和隨后的供體授精，收集，胚胎的評(píng)估和移植。

1 胚胎移植技術(shù)的發(fā)展

歷史上第一次哺乳動(dòng)物胚胎移植的案例發(fā)生在1890年，Walter Heape將安哥拉兔胚胎移植到比利時(shí)兔輸卵管中，并順利產(chǎn)下了6 只幼兔[2]。1934年Warwick等[3]又報(bào)道了第一例山羊胚胎移植。后來(lái)學(xué)者又在牛等動(dòng)物上進(jìn)行了相關(guān)研究。

現(xiàn)代的胚胎移植技術(shù)是在20 世紀(jì)70 年代發(fā)展起來(lái)的，Wilmut 和Rowsond 等[4]成 功 地 實(shí)現(xiàn)了牛胚胎的低溫保存。在過(guò)去的3 0 年里，胚胎移植技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了3 個(gè)階段的變化：第一代是通過(guò)超數(shù)排卵、非手術(shù)恢復(fù)和移植從供體獲得胚胎。第二代是通過(guò)卵子的體外受精獲得體外胚胎。第三代是進(jìn)一步發(fā)展了體外受精技術(shù)，創(chuàng)新了胚胎微操作技術(shù)，涉及體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的克隆、著床前遺傳學(xué)診斷、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)等內(nèi)容。

2 胚胎移植技術(shù)的原理及過(guò)程

胚胎移植技術(shù)的原理是通過(guò)收集基因優(yōu)良的雌性的胚胎，并將收獲的胚胎移植到受體動(dòng)物體內(nèi)，從而增加優(yōu)良雌性動(dòng)物的子代數(shù)量和遺傳基因優(yōu)勢(shì)。利用胚胎移植技術(shù)可以提高奶牛的繁殖率，通過(guò)更高的選擇強(qiáng)度、更短的世代間隔和更多的雌性后代來(lái)傳遞理想性狀。

目前的牛胚胎移植技術(shù)通常包括供受體的選擇、供體動(dòng)物的發(fā)情同步和超數(shù)排卵、供體動(dòng)物的授精、從供體收集胚胎、轉(zhuǎn)移到受體（新鮮）或冷凍保存、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎分割、胚胎檢查和性別鑒定、胚胎移植等步驟。

2.1 供體選擇

胚胎的數(shù)量與質(zhì)量由供體的選擇決定，囊胚期前的胚胎發(fā)育主要靠母系遺傳物質(zhì)來(lái)維持，只有當(dāng)受精卵運(yùn)用自己的基因組而不再是母系遺傳物質(zhì)時(shí)才能夠進(jìn)入囊胚發(fā)育期階段。胚胎移植的第一步是選擇供體牛，選擇遺傳或表型優(yōu)良的動(dòng)物是供體選擇的基礎(chǔ)，供體奶牛必須具備遺傳優(yōu)勢(shì)，能夠產(chǎn)生大量可用胚胎的特性[5]；具有規(guī)律的發(fā)情期，每次受孕不超過(guò)2 次，沒(méi)有分娩困難，沒(méi)有可檢測(cè)到的遺傳缺陷[6]；同時(shí)供體的營(yíng)養(yǎng)水平應(yīng)與體型和產(chǎn)奶量相適應(yīng)，體況評(píng)分良好。此外良好的公?；蛘邇鼍侵陵P(guān)重要的，在后裔測(cè)定中應(yīng)具有優(yōu)異的性狀表現(xiàn)，并且營(yíng)養(yǎng)狀況良好。

2.2 超數(shù)排卵

超數(shù)排卵是指在一個(gè)發(fā)情期釋放許多卵母細(xì)胞的方法。在牛中，有兩種普遍接受的超數(shù)排卵方法。一種方法是在發(fā)情周期的第10天肌內(nèi)注射（IM）1 次2 000～2 500 IU的馬絨毛膜促性腺激素（eCG），然后在2 天或3 天后間隔12～24 h注射2 次前列腺素。另一種方法是使用促卵泡激素（FSH）。在正常的發(fā)情周期中期或接近尾聲時(shí)，在卵巢上會(huì)出現(xiàn)功能性黃體（CL），每天注射2 次FSH，連續(xù)4 天；在胚胎移植計(jì)劃的第3天注射PG，這將導(dǎo)致CL消退，48～60 h后出現(xiàn)發(fā)熱或發(fā)情；在這時(shí)，牛通常會(huì)產(chǎn)生7～20 個(gè)或更多的存活卵子[7]。由于卵子數(shù)量增加，因此比正常情況下更需要確定存活的精子細(xì)胞來(lái)授精，所以至少相隔12 h用2 支精液，7 天后沖洗子宮以收集胚胎。

2.3 胚胎收集

目前比較普遍的是非手術(shù)方法采集牛胚胎，該方法通常要使用雙向流動(dòng)導(dǎo)管，用大量的商品化的沖洗液（500～2 000 mL）來(lái)沖洗子宮，然后將液體從子宮返回，經(jīng)不銹鋼或尼龍篩將胚胎封入塑料杯中。當(dāng)胚胎被識(shí)別后，要立即被轉(zhuǎn)移到含有新鮮無(wú)菌培養(yǎng)基中。通常使用含有青霉素和10%～20%熱滅活血清的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）作為保存介質(zhì)。然后通過(guò)至少3 個(gè)不同的裝有新鮮無(wú)菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿連續(xù)沖洗，每一步都需要新的無(wú)菌移液管。最后將它們收集后，利用立體顯微鏡評(píng)估胚胎形狀、顏色、質(zhì)地和大小等因素，篩選出質(zhì)量良好的胚胎待轉(zhuǎn)移或冷凍保存[8]。

2.4 胚胎凍存

胚胎凍存通常采用甘油作為低溫保護(hù)劑。甘油在冷凍過(guò)程中保護(hù)了胚胎，但如果在移植前不移除，對(duì)胚胎是致命的。一旦胚胎被冷凍，解凍程序需要3～4個(gè)步驟的沖洗，以去除甘油，然后再轉(zhuǎn)移。這個(gè)過(guò)程可能需要15～20 min。在乙二醇中冷凍胚胎用于解凍后直接移植的方法已被廣泛采用[9]，這使得在野外條件下解凍胚胎的移植更加實(shí)用。冷凍胚胎的解凍方式與冷凍精液非常相似，應(yīng)在嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度的條件下處理。

2.5 同期發(fā)情

胚胎移植的妊娠率部分取決于受者與胚胎供者在24 h內(nèi)發(fā)情時(shí)間的同步性。通過(guò)檢測(cè)未處理動(dòng)物的自然發(fā)情或通過(guò)藥物誘導(dǎo)的同步發(fā)情后，可以選擇受體動(dòng)物進(jìn)行胚胎移植計(jì)劃。因?yàn)榍傲邢偎兀≒GF）誘導(dǎo)的受者發(fā)情會(huì)在60～72 h發(fā)生，而超數(shù)排卵的受者發(fā)情會(huì)在3 6 ～4 8 h 發(fā)生，受體牛只必須在供體牛只前12～24 h接受治療，以保證其發(fā)情周期趨于一致，特別是鮮胚移植，其差異不得超過(guò)12 h[10]。目前牛的同期發(fā)情主要采用一次PG法、二次PG法與陰道孕酮栓（CIDR）+PG法，不同處理方法效果差異不大，且技術(shù)路線十分成熟。

2.6 胚胎移植

胚胎移植分為手術(shù)和非手術(shù)兩種方法。在大多數(shù)情況下，非手術(shù)轉(zhuǎn)移是首選方式。目前使用的非手術(shù)胚胎移植包括人工授精移液管和胚胎移植移液管的使用。發(fā)情同步確認(rèn)后，移植前，進(jìn)行第二尾間隙硬膜外腔麻醉，去除直腸的糞便，消毒外陰部。移植過(guò)程是將凍存胚胎在水浴中解凍，然后用蔗糖將胚胎復(fù)蘇，并重新裝入0.25 mL吸管，胚胎間至少間隔2 個(gè)氣泡，然后將吸管裝入胚胎移植移液管中。全程必須小心確保吸管與移植槍外套緊密接合，以避免泄漏。胚胎通過(guò)移液器穿過(guò)子宮頸，被放置在毗鄰CL的卵巢的子宮角中，非常類(lèi)似于人工授精[12]。

3 胚胎移植技術(shù)在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用

如今胚胎移植技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成較成熟的產(chǎn)業(yè)，利用胚胎移植技術(shù)可以加強(qiáng)遺傳選擇、診斷和治療不孕不育的、控制疾病傳播、篩選基因缺陷的牛只、繁殖稀有和瀕危物種，以及進(jìn)行發(fā)育生物學(xué)等方面的研究。

3.1 遺傳改良

胚胎移植技術(shù)現(xiàn)在被用于遺傳改良，特別是在奶牛養(yǎng)殖業(yè)，今天使用的大多數(shù)精液來(lái)自通過(guò)胚胎移植生產(chǎn)的公牛。超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)被用來(lái)增加遺傳優(yōu)秀的雌性和優(yōu)秀的父系后代的數(shù)量。并且隨著選擇強(qiáng)度的增加和世代間隔的縮短，選擇為胚胎移植的雌性，可以在群體內(nèi)獲得遺傳增益。此外，新的基因組技術(shù)正越來(lái)越多的應(yīng)用于選擇胚胎供體，基因組分析也已成為選擇胚胎移植的牛只的必要條件。

3.2 疾病控制

胚胎移植技術(shù)可用于控制基因疾病的大規(guī)模傳播。首先胚胎移植技術(shù)通過(guò)有效的篩選供體雌性和雄性牛只，就可以在初步階段篩選掉一些具有疾病的牛只。并且胚胎可以進(jìn)行活檢和染色體組型分析，進(jìn)一步對(duì)染色體組型異常的個(gè)體進(jìn)行鑒別和淘汰。此外通過(guò)檢查透明帶、胰蛋白酶處理，以及清洗等程序，使體內(nèi)衍生的胚胎可以去除特定的病原體。因此，一些研究者建議在疾病暴發(fā)時(shí)可以利用胚胎移植技術(shù)挽救遺傳群體[13]，同時(shí)也可以作為建立無(wú)病畜群的有效替代方法。

3.3 種畜保護(hù)

對(duì)于單胎動(dòng)物而言，要獲得純種的后代，至少需要7～8 個(gè)世代的繁殖，要經(jīng)歷15～20 年的時(shí)間。而采用胚胎移植技術(shù)以純種母畜為供體，通過(guò)超數(shù)排卵和人工授精技術(shù)，經(jīng)過(guò)一代就可獲得純種后代[14]，可以大大縮短繁殖時(shí)間。因此在保護(hù)動(dòng)物遺傳資源、繁衍瀕臨滅絕的野生動(dòng)物等方面，胚胎移植技術(shù)也發(fā)揮了重要的作用。

3.4 發(fā)展生物技術(shù)

當(dāng)前許多生物工程研究必須借助胚胎移植技術(shù)的基礎(chǔ)來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此也催生了結(jié)合胚胎移植等生物技術(shù)的相關(guān)研究。比如通過(guò)胚胎移植技術(shù)檢測(cè)奶牛和公牛中不良隱性性狀的攜帶者；對(duì)于某些特征，如并指畸形和侏儒癥，缺乏純合子的、可生育的雌性作為疑似攜帶者公牛的配偶，通過(guò)胚胎移植技術(shù)擴(kuò)大生產(chǎn)，從而測(cè)試公牛是否為攜帶者。有了超排卵和胚胎移植，1～2 個(gè)療程的超排卵將提供足夠的胚胎來(lái)測(cè)試大多數(shù)奶牛；此外，接受者可以是雙胞胎，在懷孕2 個(gè)月左右對(duì)胎兒進(jìn)行檢查，以診斷出許多這些缺陷。因此，通過(guò)胚胎移植，可以快速解決原本難以解決的問(wèn)題[15]。

4 胚胎移植電子數(shù)據(jù)的建立

胚胎移植電子數(shù)據(jù)的建立對(duì)奶牛場(chǎng)開(kāi)展胚胎移植管理具有重要意義，目前，粗放式管理對(duì)奶牛的生產(chǎn)性能、繁殖性能、譜系及后裔信息等記錄不全，不利于奶牛胚胎移植數(shù)據(jù)系統(tǒng)管理，造成奶牛場(chǎng)生產(chǎn)水平低下。而奶牛胚胎移植電子數(shù)據(jù)的建立可基于受體母牛電子耳標(biāo)，配備自動(dòng)識(shí)讀器，通過(guò)無(wú)線網(wǎng)絡(luò)、智能化技術(shù)裝備、可視裝備、信息編碼、電子數(shù)據(jù)交換等技術(shù)對(duì)受體母牛的基本信息、移植胚胎來(lái)源基本信息及移植過(guò)程信息進(jìn)行系統(tǒng)采集和管理。

對(duì)實(shí)施胚胎移植的奶牛場(chǎng)奶牛存欄量、品種、受體母牛及胚胎移植相關(guān)材料信息通過(guò)大數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)獲取，用以支持胚胎移植過(guò)程管理。通過(guò)數(shù)據(jù)模塊對(duì)奶牛胚胎移植、奶牛群體檔案進(jìn)行記錄和存儲(chǔ)，包括基本檔案，所有奶牛的血統(tǒng)資料，以及奶牛的繁殖性能測(cè)定、體形外貌評(píng)分、繁殖遺傳力評(píng)估結(jié)果等方面的資料，這些資料對(duì)于奶牛繁殖、生產(chǎn)管理與飼養(yǎng)等方面的工作具有重要的價(jià)值。另外，制定出一個(gè)與新疆奶牛場(chǎng)自身相適應(yīng)的繁殖循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)，在奶牛繁殖過(guò)程中，預(yù)先提醒繁殖過(guò)程中奶牛要發(fā)生的繁殖事件，在繁殖過(guò)程中出現(xiàn)意外狀況，就要重新進(jìn)行運(yùn)算和提醒。奶牛繁殖評(píng)價(jià)先要統(tǒng)計(jì)所有奶牛的資料，只有資料完整時(shí)，才能做出完整、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，可根據(jù)奶牛場(chǎng)的現(xiàn)有實(shí)際情況，還有奶牛場(chǎng)的發(fā)展需要，分析牛群特征，然后在奶牛繁殖評(píng)價(jià)模塊中根據(jù)繁殖指標(biāo)，作出全面的繁殖評(píng)價(jià)結(jié)論，確定牛群繁殖現(xiàn)有狀況和發(fā)展方向，改進(jìn)奶牛胚胎移植的方法。

5 胚胎移植技術(shù)前景

通過(guò)胚胎移植技術(shù)可以提高良種公畜的配種效率，充分挖掘優(yōu)良母畜的繁殖能力。胚胎移植技術(shù)還被應(yīng)用在肉牛雙胎的生產(chǎn)中[16]，提高生產(chǎn)效率。加快優(yōu)良品種繁育，品種資源保存等優(yōu)點(diǎn)，使得胚胎移植技術(shù)在國(guó)內(nèi)外的科研和商業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。

胚胎移植技術(shù)在家畜育種上可充分發(fā)揮優(yōu)良母畜在品種改良和育種中的作用，尤其是對(duì)于牛、羊等單胎家畜來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)使得供體繁殖后代增加7～8 倍。并從更多的頭數(shù)中加大選擇強(qiáng)度，利用更多的親緣個(gè)體群的記錄從而提高選擇準(zhǔn)確性；可以增加后代的數(shù)量，縮短世代間隔。在特定品種擴(kuò)繁上，對(duì)于牛、羊等單胎動(dòng)物，通常獲得某一品種的純種一般需要經(jīng)過(guò)7～8 個(gè)世代，要15～20年的時(shí)間。而采用胚胎移植的方法，可以選擇純種母畜為供體，通過(guò)超數(shù)排卵和人工授精技術(shù)，一次就可獲得純種后代。20世紀(jì)80年代后期，隨著我國(guó)牛羊胚胎移植技術(shù)水平的提高，一些省市先后在中國(guó)荷斯坦牛、西門(mén)塔爾牛、安哥拉山羊、優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊的擴(kuò)繁上應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)，使這些優(yōu)良品種的后代數(shù)量大大增加，為提高我國(guó)牛羊品種的整體水平起到了積極的作用。

在保護(hù)動(dòng)物遺傳資源、提高家畜生產(chǎn)性能、挽救瀕臨滅絕的野生動(dòng)物方面，胚胎移植技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越發(fā)揮出重要的作用。在偶蹄目和靈長(zhǎng)目等動(dòng)物上，國(guó)外通過(guò)手術(shù)方法和經(jīng)子宮頸的非手術(shù)方法移植胚胎獲得了后代。當(dāng)前國(guó)外已開(kāi)始建立生殖細(xì)胞保存中心，即冷凍動(dòng)物園。通過(guò)體外受精技術(shù)、冷凍精液的人工授精技術(shù)，將冷凍胚胎移植給亞種等來(lái)獲得后代的胚胎移植技術(shù)，不僅大量保存了珍貴的遺傳資源，而且也為珍稀動(dòng)物的繁衍和國(guó)際交流創(chuàng)造了新的機(jī)遇。

目前我國(guó)胚胎移植技術(shù)正在快速發(fā)展，更多地應(yīng)用到畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域中，同時(shí)也促進(jìn)了其他需要在體外操縱卵母細(xì)胞或胚胎的技術(shù)的開(kāi)發(fā)，如試管受精、胚胎分割、性別鑒定[17]、基因動(dòng)物的生產(chǎn)、基因編輯[18]以及核移植克隆[19]等技術(shù)。相信隨著與之相關(guān)的一些研究進(jìn)一步加深，胚胎移植將發(fā)揮出更加廣闊的前景。